戊型肝炎病毒熒光定量pcr檢測方法

專利名稱：：戊型肝炎病毒熒光定量pcr檢測方法
技術領域：
：本發明是一種涉及生物工程領域的檢測方法，特別是用于定量檢測臨床標本中戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法。
背景技術：
：戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvims,HEV)引起的一種急性、自限性疾病。病毒主要通過糞-口途徑傳播，廣泛流行于發展中國家，主要侵犯青壯年，孕婦感染后死亡率可達20%以上，構成嚴重的公共衛生問題。我國為戊型肝炎的高發區，控制該病刻不容緩。目前，對戊型肝炎的診斷除臨床癥狀外，通常采用ELISA法檢測血清中抗HEV-IgG抗體。但是，目前ELISA檢測靈敏度及特異性較低，漏檢率高，給戊型肝炎的診治帶來困難。而實時熒光定量PCR作為一種新的技術已經廣泛應用于疾病診斷，因此迫切需要建立一種靈敏、穩定、特異性強的熒光定量PCR方法，用于戊型肝炎的臨床診斷及HEV定量檢測。建立該方法將為戊型肝炎的早期診斷，病程中糞便和血清中病毒載量的消長規律、抗病毒藥物篩選、感染動物模型的研究提供方法；為戊肝的抗病毒治療效果的評價提供技術平臺；為戊型肝炎的流行病學監測、致病機理的研究提供技術支持；還可用于監測戊型肝炎流行區水體的HEV污染狀況，以及食品及生物制品的HEV檢測，進一步提高我國的戊型肝炎防治水平。熒光定量PCR技術具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、無污染、實時和準確等特點，已經廣泛應用于病原體檢測、單核苷酸多態性(SNP)測定及突變分析、基因表達分析、腫瘤基因檢測等方面的研究。在病毒檢測方面，它不僅能對病毒定性，更能快速、準確地定量病毒核酸，使研究病毒負荷和疾病進展的關系成為可能，從而可以動態地研究在整個病程中病毒載量的消長規律，并可對抗病毒治療的效果和耐藥變異毒株的出現作出評估，為抗病毒藥物的篩選以及研究工作提供有效的技術平臺。目前，在國內外熒光定量PCR技術廣泛應用于疾病的臨床診斷，定量檢測乙型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨細胞病毒、結核桿菌等各種病原體的商品化試劑盒己經面世，但是尚無HEV熒光定量PCR試劑盒問世。戊型肝炎的實驗室診斷常用酶聯免疫法檢測血清抗HEV-IgG和IgM，逆轉錄PCR方法檢測糞便和血清中病毒RNA。但是，ELISA檢測戊型肝炎特異性抗體的敏感度有限，而且所用抗原不盡相同，導致檢出率差異較大，隨著人們發現的HEV基因型的日益增多，需要合成更多的抗原檢測試劑，以降低漏檢率。而由于臨床樣本中的病毒含量非常低，常規RT-PCR方法靈敏度不夠，易產生漏檢。本發明采用絕對定量技術，建立靈敏、穩定、特異性強的熒光定量PCR檢測HEV的方法，適用于戊型肝炎的臨床診斷。熒光PCR定量檢測HEV方法的建立，將給戊型肝炎的診斷技術帶來巨大飛躍；為抗病毒藥物篩選、感染動物模型、患者發病過程中糞便和血清中病毒載量消長規律等方面的研究提供方法；為戊肝的抗病毒治療效果的評價提供技術平臺；為戊型肝炎的流行病學監測、致病機理的研究提供技術支持；還可用于監測戊型肝炎流行區水體的HEV污染狀況，以及食品及生物制品的HEV檢測，進一步提高我國的戊型肝炎防治水平。
發明內容本發明的目的是克服現有技術中存在的缺陷，提供一種HEV病毒的熒光定量PCR檢測方法。該方法的檢測靈敏度可達10°數量級，較傳統的RT-PCR和RT-nPCR方法具有更高的靈敏度，且操作簡便，可進行大批量的樣本分析，并對HEV進行定量，從而為戊型肝炎病毒的檢測和監控提供有效方法。本發明通過對Genbank中HEV全序列進行生物信息學分析，選取HEVORJF2基因的保守區段為耙目標，應用primerexpress軟件和primerpremier5.0軟件，設計一對PCR引物和Taqman探針。本發明所述的HEV特異性定量檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為151bp。引物和探針序列為上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;下游引物HEV-2(—)AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3，。本發明包括如下步驟1.通過生物信息學分析，選擇HEVORF2基因的保守片段為耙目標，其基因片段的擴增目標核苷酸序列為GAATGCTCAGCAGGATMGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT;2.應用primerexpress軟4牛禾卩primerpremier5.0軟牛，設計一)(寸病毒牛寺異性定量PCR引物和Taqman探針設計。探針5'端的熒光報告基團是FAM，3，端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;下游引物HEV-2(—):AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3，3.構建和制備質粒定量標準品pET28a-ORF2。根據確定的PCR引物，利用DNA重組技術將包含目的擴增片段的基因克隆到質粒載體pET-28a中，構建的重組質粒pET28a-ORF2作為檢測HEV滴度的定量標準品。4.樣本中戊型肝炎病毒的分離濃縮，及其病毒RNA的提取樣本用聚乙二醇(PEG)和氯化鈉(NaCl)進行濃縮，以提高檢測的靈敏度。5.對提取的樣本RNA進行逆轉錄反應，獲得樣本cDNA6.戊型肝炎病毒特異性定量檢測方法的優化和建立經過大量的反應條件優選、對比試驗和驗證試驗，并經過臨床樣品的檢測應用評估。對建立的方法進行靈敏度、穩定性、特異性以及對臨床標本的有效性進行綜合評價。(1).靈敏度用滅菌雙蒸水分別將質粒定量標準品pET28a-ORF2稀釋至108、107、106、105、104、103、102、101、10Qcopies/^il，采用經優化后的體系進行檢測，驗證所建立的方法的靈敏度。本檢測方法在10G108copies/reaction數量級范圍內具有良好的線性關系，相關系數R二0.9995，其檢測范圍可達9個數量級，其靈敏度可到10拷貝以下。(2).穩定性我們從批間重復和批內重復兩個方面進行評價。批內重復性:選取同一份標本，設10個平行反應管同時進行反應，檢驗其CT值的變異系數。批間重復性選取2個不同濃度的重組質粒標準品，一周內重復檢測5次，檢測其C"直的變異系數。(3).特異性本研究選擇了7個標本進行檢測，3份RT-nPCR檢測呈陽性的人的糞便標本，3份健康標本以及1份甲型肝炎病毒標本。Trizol提取的標本RNA溶于無RNase的DEPC-H20中，并按常規方法合成cDNA第一鏈。cDNA產物應用建立的Real-timePCR方法進行定量檢測。定量結果顯示3份陽性標本的病毒載量分別為3.8xl02、5.4><102和l.lxlO3copies/mg,其余標本均為陰性結果。本發明采用Taqman探針定量PCR進行戊型肝炎病毒的特異性檢測，具有以下優點和效果1.與傳統的定量方法相比，此實時熒光定量PCR具有高靈敏度、高特異性、高穩定性等特點。直接對PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線。特異性好。由于Taqman法采用雜交的方式對目標分子進行甄別，具有很高的準確性。同時，耙序列由引物和探針雙重控制，具有特異性好，假陽性率低等特點。2.本發明建立的基于Taqman探針的熒光定量PCR方法具有靈敏度高，檢測范圍廣的特點。在10°108拷貝范圍內有極好的線性關系(R=0.9995)，檢測范圍可以達到9個數量級，達到國際先進水平。其檢測靈敏度可到IO個拷貝以下，具有極高的靈敏度，適合檢測低病毒含量的實驗標本。3.穩定性和重復性高其批內重復性檢測的CT值變異系數(CV)為1.49%，批內重復性檢測的CT值變異系數(CV)為1.98%和2.23。％。4.操作簡單，自動化程度高。基于Taqman探針的定量技術在同一反應管內同時進行多重反應。反應過程中無需開蓋，避免污染，擴增和檢測同步完成，操作簡單，易于實現自動化。本發明采用的熒光定量PCR技術巧妙地利用了PCR技術的DNA高效擴增、探針技術的高特異性和光譜技術的敏感性及實時定量的優點，克服了常規PCR定性檢測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，縮短了實驗時間，簡化了實驗操作，而且熒光檢測的結果由電腦軟件分析，避免了產物后處理過程所致的污染，較常規PCR更為客觀、靈敏、準確。同時，本發明中采用的陽性對照是根據戊型肝炎病毒的保守序列設計構建的標準質粒分子，使得陽性標準品的來源可靠，避免了陽性毒株在每次實驗中的使用。圖1為熒光定量PCR敏感度檢測的熒光信號圖(從左至右的標準品濃度分別為10G108copies/^)。圖2.戊型肝炎病毒絕對定量的標準曲線，y=-3.257*log(conc)+45.819(注conc表示反應體系中的標準質粒拷貝數)。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。實施例1:設計引物和Taqman探針實驗步驟在Genbank中收集HEV全序列并進行生物信息學分析，選取序列保守區段作為設計引物和探針的候選區段，重點分析比對流行于我國的HEV全序列(EMBL登錄號AB108537、AJ272108、D11092、L08816、L25547和M94177),確定位于0RF2的高保守區域作為PCR擴增的靶基因序列。應用primerexpress軟件和primerpremier5.0軟件，設計一對PCR引物和Taqman探針，探針5，端的熒光報告基團是FAM，3'端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。引物和探針位于ORF2區域，目的擴增片段為151bp。戊型肝炎病毒特異性定量PCR引物指的是長度為21bp的寡核苷酸鏈。引物和探針序列為上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;下游引物HEV-2(—)AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3，。實施例2:定量標準品的構建與制備實驗步驟1.定量標準品的構建利用RT-PCR方法克隆得到含有靶序列的HEV基因片段，重組到載體pET-28a中，并進行DNA序列測定。構建的重組質粒作為定量標準品，命名為pET28a-ORF2。2.定量標準品的制備質粒pET28a-ORF2用堿裂法進行提取純化，根據紫外分光光度計測定的OD26。、OD28。和OD23。值計算質粒濃度，檢測質粒的純度，并根據阿伏伽德羅常數換算成拷貝數。計算公式如下質粒濃度(嗎/pl)二OD26。x稀釋倍數x50/1000質粒拷貝數=A*N/1000MA:代表質粒濃度(^g/^d);M:代表質粒分子量；N:代表阿伏伽德羅常數(6.02xl023/mol)實施例3:病毒樣本中病毒的分離與濃縮實驗步驟1.病毒提取和濃縮(1).用PH7.4的PBS與戊肝患者急性期的糞便標本充分振蕩混勻，制成10%的糞便懸液。若樣品病毒含量較高，直接繼續步驟2;若病毒含量較低則繼續以下步驟(2).4°C，8000rpm離心10min后取上清；(3).4°C，12000rpm繼續離心15min，取上清；(4).上清中加入加適量PEG6000和氯化鈉，4。C靜置過夜；(5).4°C，12000rpm離心15min后獲得沉淀，沉淀用Trizol提取RNA。2.病毒核酸提取(1).每150(il的10%的糞便懸液或每1ml的病毒懸液沉淀物加1mlTrizol，充分混勻裂解；(2).加200[il氯仿，振蕩混勻30s;(3).4°C，12000rpm離心5min，上清轉入無RNA酶的1.5ml離心管中；(4).加入等體積異丙醇，室溫放置5min;(5).4°C，12000rpm離心5min，小心棄上清；(6).加入700ul170%的乙醇洗滌沉淀一次；(7).重復步驟(6)—次；(8).沉淀室溫干燥；(9).加入30(il含RNasin(2U/|il)的DEPC-H20，充分溶解提取的病毒核酸。實施例4:樣本RNA的逆轉錄實驗步驟1.取核酸樣品5ial、負鏈引物1.5(il及DEPC-H203.5111，輕輕混勻；270°C作用5min，立即冰浴2min;3.加入5x逆轉錄Buffer6(il，10mmol/LdNTP2fil，RNasin1(J(80U/|il)，M-MLV逆轉錄酶1|iK200U4d)，DEPC-H2010pl，溫和混勻后42。C反應30min(注逆轉錄反應體系見表l);4.9(TC作用30s滅活逆轉錄酶，獲得cDNA;5.cDNA產物采用建立的實時熒光PCR反應體系進行定量檢測。表1.逆轉錄反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5:戊型肝炎病毒特異性定量PCR方法的優化和建立實驗步驟1.絕對定量標準曲線的建立(1).質粒標準品制備質粒pET28a-ORF2用堿裂法進行提取純化，根據紫外分光光度計測定的OD26Q、OD280和OD23。值計算質粒濃度，檢測質粒的純度，并根據阿伏伽德羅常數換算成拷貝數。(2).定量PCR反應條件優化通過對反應體系中不同濃度的Mg"、定量PCR引物、Taqman探針、dNTP等的實驗結果進行比較，選擇反應靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型S型擴增熒光信號曲線、反應效率接近于1的反應體系。本發明使用的熒光定量PCR儀為Corbettresearch公司的RotorGene3000。熒光檢測的程序設置在每個循環第二步結束時檢測熒光信號，檢測波長為510nm。定量PCR循環采用兩步法，退火和延伸同步進行。循環條件為:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反應體系的篩選:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>經優化后的定量PCR反應體系(25^xl反應體系):反應試劑體積(pi)終濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3).絕對定量的擴增標準曲線建立用滅菌雙蒸水10倍梯度稀釋質粒定量標準品pET28a-ORF2。稀釋后質粒濃度分別為108、107、106、105、104、103、102、101、10Qcopies/pl。采用經優化后的反應體系進行反應，反應條件為94。C預變性3min;94°C10s，60°C30s，共40個循環。檢測結束后利用熒光PCR自帶的軟件(Rotorgeneversion6.0.38)，根據噪聲情況設定和調整基線和閾值，繪制標準曲線(圖l)。本檢測方法在10Q108copies/reaction數量級范圍內具有良好的線性關系，相關系數R二0.9995，其檢測范圍可達9個數量級，其靈敏度可到10拷貝以下(圖2)。檢測反應管中病毒cDNA拷貝數的計算公式COnC=10(—a3()7xCT+14Q69);樣品中病毒濃度的計算公式樣品病毒載量(copies/mg)二concx樣品稀釋度/YM(注conc代表檢測體系中的病毒拷貝數；Y代表cDNA合成效率；M代表樣品質量mg)。2.穩定性分析從批間重復性和批內重復性兩個方面進行評價建立的熒光定量PCR反應體系的穩定性。a).批內重復性檢驗選取同一份標本，按照實施例n和實施例m所述的方法提取病毒核酸并進行逆轉錄反應。采用經優化的反應體系和反應條件設置IO個平行反應管同時進行反應，利用統計學方法檢驗其CT值的變異系數。批內重復性檢測的CT值變異系數(CV)為1.49%。(2).批間重復性檢驗選取2個不同濃度的質粒標準品，采用實施例rv所述的反應體系和條件，一周內重復檢測5次，利用統計學方法檢驗其CT值的變異系數。批間重復性CT值的變異系數(CV)分別為1.98%和2.23%。表明本發明建立的檢測方法具有良好的穩定性和重復性。3.特異性分析為檢驗建立的熒光定量PCR方法的適用性，本研究選擇了7個標本進行檢測3份RT-nPCR檢測呈陽性的人的糞便標本，3份健康標本以及1份甲型肝炎病毒標本。按照實施例n和實施例III所述的方法提取病毒核酸并獲得一鏈cDNA模板，采用經優化的反應體系進行定量檢測。對上述標本的定量結果顯示，3份陽性標本的病毒載量分別為3.8x102、5.4><102和Llx103copies/mg，其余標本無擴增信號均為陰性結果。4.檢測結果判定及病毒的定量(1).陽性對照的CT值應小于30.0，陰性對照的CT值應大于35.0。陽性模板為質粒定量標準品pET28a-ORF2，陰性模板為無菌雙蒸水；(2).若Ct惶小于30.0，且呈現典型的擴增曲線，則判斷為陽性結果，表明檢測樣品中含有HEV病毒核酸；(3).若CT值大于35.0或無擴增信號，則判斷為陰性結果，表明檢測樣品種無HEV病毒核酸；(4).若CT值在30.035.0之間，則視為可疑結果，樣本需重復檢測一次。若結檢測果仍在此范圍內，則判斷為陰性結果；(5).結果呈陽性的樣本，根據其CT值以及建立的定量的標準曲線計算樣本內的HEV病毒載量。計算公式如下待測樣品病毒滴度(copies/mg)=10(-o.3G7xCT+14.,x/YM(X:代表樣品稀釋度；Y:代表cDNA合成效率；M:代表樣品質量mg)。權利要求1.一種戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于檢測方法步驟如下(1).病毒特異性定量PCR引物和探針設計，包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，在Genbank中檢索戊型肝炎病毒全序列，通過生物信息學比對分析，選取序列保守片段，應用primerexpress軟件和primerpremier5.0軟件，設計一對PCR引物和Taqman探針，探針5'端的熒光報告基團是FAM，3'端標記的熒光淬滅基團為TAMRA，引物和探針位于戊型肝炎病毒ORF2區域，目的擴增片段為151bp，擴增序列為GAATGCTCAGCAGGATMGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATGACAACCMCATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCT引物和探針序列為上游引物HEV-1(+):GAATGCTCAGCAGGATAAGGGT;'下游引物HEV-2(—)AGCTCGGAGGACAGAAAAAGG;Taqman探針序列5，-FAM-CCGCATGACATCGACCTCGGG-TAMRA-3,;(2).定量標準品的構建根據確定的PCR引物，利用DNA重組技術將包含目的擴增片段的基因克隆到質粒載體pET-28a中，構建的重組質粒pET28a-ORF2作為檢測戊型肝炎病毒滴度的定量標準品；(3).樣本中戊型肝炎病毒的分離及其RNA的提取，并針對病毒含量較低的樣本用聚乙二醇和氯化鈉進行濃縮，提高檢測的靈敏度；(4).對提取的樣本RNA進行逆轉錄反應，獲得樣本cDNA;(5).定量檢測方法的優化和建立通過篩選不同的Mg"濃度、引物濃度、Taqman探針濃度，選擇具有高靈敏度、合適反應效率的反應體系和反應條件。并通過對反應體系的靈敏度、穩定性和特異性等指標對建立的熒光定量PCR方法進行綜合評價；(6).經過對臨床標本的檢測進行應用評估，驗證建立的熒光定量PCR的可靠性。2.根據權利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于標準陽性模板核苷酸序列為GAATGCTCAGCAGGATMGGGTATTGCMTCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATCTGTCCTCCGAGCT3.根據權利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的病毒特異性定量探針，指的是長度為21bp的寡聚核苷酸序列。4.根據權利要求3所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的探針序列為CCGCATGACATCGACCTCGGG。5.根據權利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的探針5'端標記的熒光報告基團是FAM。6.根據權利要求1所述的戊型肝炎病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，其特征是所述的3'端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。全文摘要本發明是一種涉及生物工程領域的檢測方法，特別是用于定量檢測臨床標本中戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)滴度的熒光定量PCR檢測方法。本發明包括如下步驟病毒特異性定量PCR引物和探針設計；標準分子的構建；病毒樣本RNA的提取；樣本RNA的cDNA合成；熒光定量PCR檢測方法的建立和優化。本發明的檢測靈敏度可達10°數量級的病毒拷貝，具有良好的穩定性和特異性，可用于大批量的樣本檢測，并可對樣本的病毒載量進行準確定量。文檔編號C12Q1/70GK101122563SQ20071007056公開日2008年2月13日申請日期2007年8月28日優先權日2007年8月28日發明者沃恩康,艷洪,王怡婷,勇陳申請人:浙江省醫學科學院