專利名稱：一種具有單側延長臂發夾型dna探針的dna芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物芯片，特別涉及一種具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片。
背景技術：
探針技術是生物芯片技術的核心。發夾型DNA探針又叫分子信標(molecular beacon)是根據核酸堿基配對原則和熒光共振能量轉移(fluores-cenceresonance energy transfer，FRET)現象設計。空間結構上呈莖環結構。環序列是與靶核酸互補的探針；莖由與靶序列無關的互補序列構成；莖的兩端分別連上一個熒光分子和一個淬滅分子。當有靶序列存在時，分子信標的環序列與靶序列特異性結合，熒光分子發出的熒光不能被淬滅分子吸收，可檢測到熒光。與常規核酸探針相比，發夾型DNA探針的優勢明顯A.非常高的特異性。B.非常高的靈敏度。C.液相雜交檢測效率高。D.有效消除核酸交叉污染。E.可進行核酸實時檢測。F.可實現核酸的大規模自動化檢測。G.對活體內核酸動態進行檢測等。在用于核酸分子檢測的基因芯片領域，目前使用最廣泛的DNA探針主要是寡核苷酸探針Oligo、cDNA、PNA探針等，發夾型DNA探針具有上述諸多獨特優勢，但由于受分子結構的限制，目前發夾型DNA探針在芯片表面的固定難題成為制約其在生物芯片領域運用的主要障礙，其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測效率高等優勢在芯片領域難以得到有效發揮。為此國內外許多學者重點研究怎樣解決發夾型DNA探針在芯片表面的固定問題。但通常都是在發夾型DNA探針的莖結構修飾上作主研究方向，最多見的是修飾生物素-親和素(biotin-avidin)生物素(biotin)修飾到發夾型DNA探針的莖臂，親和素(avidin)固定到芯片表面，通過生物素-親和素(biotin-avidin)之間的結合力固定發夾型DNA探針，這種修飾生物素-親和素的發夾型DNA探針有兩個主要弱點1，發夾型DNA探針莖結構修飾有很高的技術難度(國內目前還未見報道)；2，莖臂修飾生物素(biotin)發夾型DNA探針與芯片表面親和素(avidin)結合無特異性對中、高密度芯片難以做到“點對點雜交”。發夾型DNA探針的優勢在于“液-液相雜交”時的高特異性和高靈敏性即發夾型DNA探針與靶序列先在試管里高特異/高靈敏雜交，復合體再與芯片表面的“探針”(親和素avidin)結合；由于生物素-親和素(biotin-avidin)結合方式無特異性，同樣固定在芯片表面的親和素(avidin)無特異性，從而導致多樣本靶序列與特異性發夾型DNA探針雜交體在與芯片表面的親和素(avitin)結合時無特異性，這種無特異性的芯片結合使得發夾型DNA探針對中、高密度芯片難以做到“點對點雜交”。芯片雜交時是整張芯片表面所有位點同時浸沒在雜交液中，依靠探針與靶序列的特異性識別保證多樣本檢測的特異性“點對點雜交”。由于生物素-親和素(biotin-avidin)結合方式無特異性，修飾在發夾探針莖臂上的生物素與固定在芯片表面的親和素之間結合無特異性，這種無特異性的芯片結合導致所有靶序列樣本都可與芯片表面所有位點結合，從而引起混亂無法區分使用。傳統莖臂修飾發夾型DNA探針由于無法保證雜交特異性，在高密度芯片領域幾乎無法實際使用。由于這兩大技術缺陷的存在從而極大地限制了發夾型DNA探針在芯片領域的運用。
我們繞開國內外學者在發夾型DNA探針莖臂修飾上作主研方向的思路，在發夾型DNA探針莖臂長度上做突破，設計了全新型的發夾型DNA探針單側延長臂發夾型DNA探針。
發明內容
本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種在保證了發夾型DNA探針與芯片結合時的特異性，對中、高密度芯片可以做到“點對點雜交”的同時，使發夾型DNA探針在芯片表面的固定容易，繞開了發夾型DNA探針莖臂修飾難題，使其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測效率高、大規模自動化檢測等獨有技術優勢在生物芯片領域得到充分發揮的具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案一種具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，包括發夾型DNA探針、載體，其特征在于所述發夾型DNA探針的一側莖臂為合成DNA鏈時自然延長的單鏈核苷酸臂，該莖臂的長度長于另一莖臂的長度；在載體表面固定有與自然延長的單鏈核苷酸臂堿基序列完全互補配對的寡核苷酸探針，自然延長的單鏈核苷酸臂通過固定在載體表面的寡核苷酸探針，依據堿基互補配對原則進行特異性雜交，使自然延長的單鏈核苷酸臂探針特異性地雜交到載體上的相應位置。
優選的，所述單側延長臂發夾型DNA探針中，每一組或每一個自然延長的單鏈核苷酸臂的長度各不相同，其自然延長部分的長度為10～80mer。
優選的，所述單側延長臂發夾型DNA探針中每一組或每一個自然延長的單鏈核苷酸臂的長度相同，并具有不同堿基序列。
優選的，所述的自然延長的單鏈核苷酸臂在淬滅分子3′一側，淬滅分子被修飾在中間與對側互補莖臂5′端標記熒光分子對應部位的堿基上。
單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片的制備步驟包括1、首先準確定位要檢測的目標序列，通過相應軟件(如Beacon Designer)設計發夾型DNA探針和單側延長臂DNA，把兩者組合后再經軟件(如DNAstar)驗證不會形成除發夾結構外的其他二級結構，并經gengbank比對后就可完成設計工作，與單側延長臂DNA相匹配的Oligo DNA探針(固定在芯片表面)相對更容易。
2、DNA的人工合成是早已成熟的技術，各大生物工程公司都可完成，如上海生物工程公司的ABI394高通量DNA合成儀等。
3、Oligo DNA的人工化學合成現在一般都采用b-乙腈亞磷酰胺化學合成Oligo DNA，合成時從3′→5′方向進行，通常3′端的第一個堿基結合在Glass擔體(Controlled Pore Glass，CPG)上。合成的詳細過程見圖3，現簡要說明如下1)脫掉附加在CPG擔體上的第一個堿基5′-OH基團上的保護基(DMTr)，準備附加下一個新的堿基；2)活化新的堿基單體(Phosphoramidite)，準備與第一個堿基進行反應；3)第二個堿基與第一個堿基發生偶聯反應；4)將沒有反應的第一個堿基的5′-OH加帽封死(Capping)，使其不再進一步參與反應；5)將核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯(即將三價磷氧化成五價磷)。
6)重復進行Step1～Step5的循環，直至合成完所需的Oligo DNA序列。
7)合成結束后，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進行進一步的純化。
4、本發明單側延長臂發夾型DNA探針的合成原理與普通Oligo DNA的人工化學合成基本相同，特殊一點是帶堿基T的淬滅分子(通常為DABCYL)和修飾熒光分子(如FAM\EDANS\Coumarin\TET\TAMRA\TexasRed等)按預先設計好的序列在DNA合成儀上合成。
5、合成后還應進行一系列的純化，這樣就得到純化好的單側延長臂發夾型DNA探針，以供使用。
單側延長臂發夾型DNA探針是把發夾型DNA探針一側莖臂(通常是掛淬滅分子一側)設計為自然延長的單鏈核苷酸臂，淬滅分子修飾在自然延長的單鏈核苷酸臂上與熒光分子對應的同側位置，參見附圖1、附圖2。莖結構單側單鏈核苷酸臂自然延長無須修飾生物素(biotin)、多肽等大分子，極大簡化了技術難度。發夾型DNA探針與芯片表面結合可選擇兩種方式第一發夾型DNA探針莖結構單側延長臂可根據需要(對多樣本靶序列)設計為不同堿基序列和不同長度，另外設計一段與單側延長臂堿基序列完全互補配對的寡核苷酸探針oligo固定在芯片表面，這樣單側延長臂與固定在芯片表面的寡核苷酸探針oligo依據堿基互補配對原則進行特異性雜交，使發夾型DNA探針特異性地雜交到芯片上的相應位置(其他位置的寡核苷酸探針由于堿基序列不同不能雜交結合)，對中、高密度芯片可以做到“點對點雜交”。第二可在發夾型DNA探針莖結構單側延長臂末端修飾上氨基、巰基等早已成熟的探針—芯片修飾技術，使發夾型DNA探針固定在芯片表面。
本發明的創新及主要優點如下，參見附圖21、可繞開發夾型DNA探針莖結構修飾的技術難題。
2、完全可以保證發夾型DNA探針與芯片結合時的特異性，對中、高密度芯片可以做到“點對點雜交”。
繞開國內外學者為解決發夾型DNA探針在芯片表面的固定難題而在探針莖臂修飾上作主研方向的思路，在探針莖臂長度設計上突破，在保證了發夾型DNA探針與芯片結合時的特異性(對中、高密度芯片可以做到“點對點雜交”)同時，較好地解決了發夾型DNA探針在芯片表面的固定難題。克服了長久以來發夾型DNA探針在芯片領域運用受到極大限制的痼疾，使其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測效率高、大規模自動化檢測等獨有技術優勢在生物芯片領域得到充分發揮。
單側延長臂發夾型DNA探針及芯片固定技術主要用于病源微生物基因檢測(如HBV、HAV、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌等)、其他生物物種的基因檢測、基因突變性和多態性檢測、基因表達譜分析、腫瘤分子分型、新藥的研究與開發等。
本發明的一種具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，在保證了發夾型DNA探針與芯片結合時的特異性，對中、高密度芯片可以做到“點對點雜交”的同時，使發夾型DNA探針在芯片表面的固定容易，繞開了發夾型DNA探針莖臂修飾難題，使其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測效率高、大規模自動化檢測等獨有技術優勢在生物芯片領域得到充分發揮。
圖1是本發明的單側延長臂發夾探針與芯片表面寡核苷酸探針結構示意圖；
圖2是本發明單側延長臂發夾型DNA探針與芯片表面寡核苷酸探針高特異性雜交對中、高密度芯片可做到“點對點雜交”示意圖；其中，A為探針單側延長臂與芯片表面oligo雜交B為發夾探針單側延長臂依靠不同堿基序列或長度保證特異性；C為單側延長臂發夾探針對中、高密度芯片可高特異性雜交；圖3是本發明Oligo DNA的合成過程示意圖；圖4是本發明MRSA多重耐藥基因譜單側延長臂發夾型DNA探針芯片構建示意圖；其中，AMRSA各易變基因擴增片段；B擴增片段與對應發夾探針特異性“液-液相雜交”；C如果某段基因有多個突變點，可采用多重發夾探針覆蓋；D由此構成MRSA多重耐藥基因譜單側延長臂發夾探針芯片；D1耐β-內酰胺類；D2耐喹諾酮類；D3耐四環素類；D4耐MLSB；D5耐氨基糖苷類；D6耐萬古霉素具體實施方式
下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但并不因此將本發明限制在所述的具體實施方式
范圍之中，如圖1、圖2、圖3、圖4所示合成并檢測的結核桿菌通用單側延長臂發夾型DNA探針。
1，針對結核桿菌保守序列IS986通過軟件Primer 5.0設計靶序列(1)下面的序列表中，中間為擴增目標產物為245bp(加粗)，兩端為擴增引物(字下加線表示)Primer15’-CGTGAGGGATCGAGGTGGC-3’Primer25’-GCGTAGGCTCGGTGACAAA-3’
(2)針對中間245bp擴增產物通過軟件(Beacon Designer)設計靶序列774-797上面的序列表中斜體文字序列表示5’-tccagcg ccgcttcgga ccaccag-3’2，設計環序列即以上靶序列的對應互補序列5’-CTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGA-3’3，設計互補的莖臂堿基序列5’-GTCGA-3’，3’-CAGCT-5’。
4.設計單側延長臂堿基序列5’-ATGGTGCAGCGTCG-3’與單側延長臂互補的Oligo5’-CGACGCTGCACCAT---3’并經genebank和DNA star軟件證實并保證特異性及不會形成除發夾結構以外的其他結構。
5，選擇FAM-DABCYL為熒光-淬滅分子對，在DNA合成儀上(如ABI394高通量DNA合成儀)合成上述針對結核桿菌保守序列IS986非對稱環發夾型DNA探針及Oligo(氨基修飾在5’端)。
結核桿菌保守序列IS986單側延長臂發夾型DNA探針5’--熒光 Oligo氨基-5’-GCCATGAGTCCAT-3’6，后續實驗步驟為擴增、純化、雜交、芯片沖洗掃描、熒光信號數據分析等芯片實驗常規步驟(此處略)。
權利要求
1.一種具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，包括發夾型DNA探針、芯片載體，其特征在于所述發夾型DNA探針的一側莖臂為合成DNA鏈時自然延長的單鏈核苷酸臂，該莖臂的長度長于另一莖臂的長度；在芯片載體表面固定有與自然延長的單鏈核苷酸臂堿基序列完全互補配對的寡核苷酸探針，自然延長的單鏈核苷酸臂通過固定在芯片載體表面的寡核苷酸探針，依據堿基互補配對原則進行特異性雜交，使自然延長的單鏈核苷酸臂探針特異性地雜交到芯片載體上的相應位置。
2.根據權利要求1所述的具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，其特征在于所述單側延長臂發夾型DNA探針中，每一組或每一個自然延長的單鏈核苷酸臂的長度各不相同，其自然延長部分的長度為10～80mer。
3.根據權利要求1所述的具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，其特征在于所述單側延長臂發夾型DNA探針中每一組或每一個自然延長的單鏈核苷酸臂的長度相同，并具有不同堿基序列。
4.根據權利要求1所述的具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，其特征在于所述的自然延長的單鏈核苷酸臂在淬滅分子3′一側，淬滅分子被修飾在中間與對側互補莖臂5′端標記熒光分子對應部位的堿基上。
全文摘要
本發明公開了一種具有單側延長臂發夾型DNA探針的DNA芯片，包括發夾型DNA探針、載體，所述發夾型DNA探針的一側莖臂為合成DNA鏈時自然延長的單鏈核苷酸臂，該莖臂的長度長于另一莖臂的長度；自然延長的單鏈核苷酸臂通過固定在載體表面的寡核苷酸探針，依據堿基互補配對原則，使自然延長的單鏈核苷酸臂探針特異性地雜交到載體上的相應位置。本發明在保證了發夾型DNA探針與芯片結合時的特異性，對中、高密度芯片可以做到“點對點雜交”的同時，使發夾型DNA探針在芯片表面的固定容易，繞開了發夾型DNA探針莖臂修飾難題，使其非常高的特異性和靈敏度、液相雜交檢測效率高、大規模自動化檢測等獨有技術優勢在生物芯片領域得到充分發揮。
文檔編號C12Q1/68GK101041863SQ20071007841
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月23日 優先權日2007年4月23日
發明者陳慶海, 府偉靈, 匡紅 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院