專利名稱：淋巴細胞培養液及培養淋巴細胞的方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種淋巴細胞培養液及培養淋巴細胞的方法和應用。
背景技術：
淋巴細胞是一種具有重要用途的免疫活性細胞，通過在癌癥患者體內提取淋巴細胞進行體外誘導培養，可以獲得大量的具有抗腫瘤細胞能力的活性細胞。
細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells)，簡稱CIK細胞。它是自體的外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞，將這類細胞大量回輸后，可提供對腫瘤細胞的殺傷活性，還能使機體免疫能力提高，從而對腫瘤治療施以雙重的作用。由于CIK細胞是活化的自體細胞，安全性好，無明顯副作用。目前，CIK細胞被認為是新一代抗腫瘤細胞免疫治療的首選方案，該細胞在防止腫瘤復發和抑制腫瘤轉移方面具有重要的作用。
目前淋巴細胞培養液中的主要能源物質是多種氨基酸、L-谷氨酰胺和葡萄糖。
L-谷氨酰胺作為能源物質之一對細胞的生長具有特殊的作用，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的原料。細胞需要L-谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，L-谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。但過量追加L-谷氨酰胺也會造成代謝廢物氨以及一些非必需氨基酸的產生，造成培養基中細胞生長抑制。
葡萄糖作為另一能源物質在代謝過程中有95％的都生產乳酸，因此代謝廢物產生多，影響細胞的擴增和傳代。而且過多的乳酸也會降低培養液的pH值，增加滲透壓。
因此只能根據細胞的生長特性來調整培養液中L-谷氨酰胺和葡萄糖的使用量。這樣在細胞培養過程中能量提供就受到了限制。從而大大影響了細胞的擴增和傳代。
中國專利CN1245504C公開了一種CIK細胞體外培養方法，該方法所采用的培養液是在RPMI-1640基礎培養基中添加10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素和50umol/L二巰基乙醇。其能量物質僅僅是谷氨酰胺，因此同樣存在不能為細胞培養提供足夠的能量，從而影響細胞擴增和傳代的問題。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種具有較高擴增倍數，較長傳代時間的淋巴細胞培養液。
本發明的目的之二在于提供一種培養淋巴細胞的方法。
本發明的目的之三在于提供這種培養液的應用。
實現本發明第一個目的的技術方案是一種淋巴細胞培養液，在完全培養液中加入ATP和輔酶A；所述完全培養液包括基礎培養液RPMI-1640、白蛋白、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氫鈉和HEPES。
各組分的用量如下基礎培養液RPMI-16405～15g/L白蛋白 5～15wt％L-谷氨酰胺 0.1～0.5g/L葡萄糖 1～5g/L碳酸氫鈉 1～5g/LHEPES 2～10g/LATP6～15mg/L輔酶A 30～50U/L。
上述用量優選基礎培養液RPMI-164010.4g/L白蛋白 10wt％L-谷氨酰胺 0.3g/L葡萄糖 2g/L碳酸氫鈉 2g/LHEPES 6g/LATP10mg/L輔酶A 40U/L。
所述基礎培養液RPMI-1640含10mmol/L的HEPES、0.02mmol/L的2-巰基乙醇、100U/ml的IL-2、100U/ml的IL-1和1wt％的丙酮酸鈉。
其中，NaHCO3是細胞培養的緩沖劑，與氣相中的CO2組成緩沖體系。HEPES(中文名為N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)是一種非離子緩沖液，用于穩定培養液的pH值。ATP作為能量物質，在分解時放出大量的能量，可以為細胞培養的各個過程都提供充足的能量，改善和提高細胞酶的代謝功能，促進細胞的擴增和傳代。輔酶A能夠促進三羧酸的循環，為細胞的擴增與傳代提供能量。
實現本發明另一目的的技術方案是一種培養淋巴細胞的方法，具有以下步驟①制備培養液；②用步驟①制備的培養液懸浮細胞；③激活細胞；④用步驟①制備的培養液洗滌激活后的細胞；⑤收集細胞。
步驟①中制備培養液的方法如下在雙蒸水中分別加入基礎培養液RPMI-1640、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氫鈉、HEPES，攪拌使之完全溶解，過濾除菌并保存，使用前再加入ATP和輔酶A。
步驟②中的懸浮細胞是指將細胞濃度調整至2.0×106個/L，再接種于細胞培養瓶中。
步驟③中激活細胞的方法如下第1天加入1.5×106U/L的IFN-γ，放置在37℃、5％的CO2的培養箱中培養，24小時后加入100μg/L的anti-CD3 McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1，刺激3天。
步驟④的洗滌是指用含有100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1的培養液進行培養，以后每3天添加該培養液。
步驟⑤中所述的收集細胞是指在細胞數量和細胞毒活性達到預期要求后收集細胞。
實現本發明的第三個目的的技術方案是，本發明的淋巴細胞培養液用于CIK細胞的培養。
本發明的積極效果是(1)具有較高的擴增倍數，通過實驗數據可知，使用本發明的培養液可使細胞的擴增倍數達到520±102倍，這就是由于ATP和輔酶A為細胞培養提供的足夠的能量，促進了細胞的擴增。(2)具有較長的傳代時間，使用本發明的培養液后，細胞在第14～21天仍然具有較高的增值量。(3)具有較高的特定生物學活性，在加入相同種類相同劑量細胞因子的前提之下，本發明所述培養液所培養的細胞具有較好的細胞表型，在第14～21天時細胞表型達最佳狀態，此時細胞具有最高的抗腫瘤活性。(4)本發明的培養液用于CIK細胞的效果要好于用于TIL細胞、LAK細胞以及CD3AK細胞。
具體實施例方式
(實施例1)本實施例的培養液的組分及用量見表1
表1
上述培養液的制備方法如下在1L雙蒸水中分別加入10.4g基礎培養液RPMI-1640(一包)、10wt％的白蛋白、0.3g L-谷氨酰胺、2g葡萄糖、2g碳酸氫鈉、6gHEPES。同時還可以加入4萬U的硫酸慶大霉素以及10mg的氟康唑。攪拌使之完全溶解，經微孔濾膜過濾除菌，并與-20℃保存，使用前再加入10mg的ATP以及40U的輔酶A。
上述一包基礎培養液RPMI-1640中含有10mmol/L的HEPES、0.02mmol/L的2-巰基乙醇、100U/ml的IL-2、100U/ml的IL-1和1wt％的丙酮酸鈉。
(應用例)用實施例1制備的培養液培養CIK細胞。
用ficoll密度梯度分離人外周血單個核細胞(PBMC)，用實施例1制備的培養液懸浮細胞，調整細胞濃度至2.0×106個/L接種于細胞培養瓶中，置于5％的CO2培養箱中激活。
激活時，第1天加入1.5×106U/L的IFN-γ，然后放置于37℃、5％的CO2培養箱中培養24h，再加入100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1，刺激3天。
第4天用上述培養液洗滌激活后的細胞，并添加含有100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1的培養液進行培養，以后每3天添加該培養液。
1、動態分析CIK細胞表型發現(見表2)應用本發明的培養液誘導培養CIK細胞，在不同培養時間的CIK細胞CD3+CD16+56+雙陽性細胞的百分含量大幅度上升，由起初(0.70±0.4)％上升到第14天的(31.6±5.5)％和第21天的(35.8±9.7)％。此外，總CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞比例均較培養前顯著升高，其中CD3+CD8+細胞增加更為明顯，此期CD8+T細胞和CD4+T細胞也達到增殖高峰。表型研究也證實在第14～21天時效應細胞呈高表達平臺期，顯示此期間CIK細胞具有較強的抗腫瘤能力。
表2 CIK細胞在不同時間的細胞免疫表型(x±s，％，n＝16)
2、在第7、14、21、28和35天時進行細胞毒活性實驗，當效應細胞與靶細胞比為10∶1時，CIK細胞對K562細胞和Raji細胞的細胞活毒性(見表3)應用本發明的培養液研究CIK細胞毒活性發現第14天時對K562細胞的細胞毒活性達峰值(76.65±16.78)％，第14天時對Raji細胞的細胞毒活性達峰值(75.32±15.61)％。
表3CIK細胞在不同時間的細胞毒活性(n＝12，％)
3、CIK細胞和TIL細胞在不同時間細胞量的變化(見表4)。
由表4可知，CIK細胞在第14天增殖活性為最高，擴增數量是原來的520±102倍。而TIL細胞在第14天時的擴增數量僅為原來的182±78倍。
表4 CIK細胞和TIL細胞在不同時間細胞增殖量的變化(n＝12，×108/L)
注*與0d、7d、14d、28d和35d比較，P＜0.01；△與0d、7d、14d、21d和35d比較，P＜0.01
4、CIK細胞、CD3AK細胞和LAK細胞對K562的細胞毒活性的比較(見表5)。
由表5可知，LAK細胞在第7天殺傷活性最高，CD3AK細胞在第14天殺傷活性最高，CIK細胞在第14天殺傷活性最高。在峰值期CIK細胞殺傷活性顯著高于CD3AK細胞和LAK細胞。
表5 CIK細胞、CD3AK細胞和LAK細胞對K562的細胞毒活性的比較(n＝12，％)
通過對CIK細胞的細胞表型及細胞毒活性分析，證實了應用本發明的培養液培養的CIK細胞具有增殖速度快，殺瘤活性高和抗瘤譜廣等特點，并確立了CIK細胞臨床應用的最佳時機為CIK誘導培養14～21天。
(實施例2～實施例5)實施例2～實施例5的培養液的組分和用量見表4表6
權利要求
1.一種淋巴細胞培養液，其特征在于在完全培養液中加入ATP和輔酶A；所述完全培養液包括基礎培養液RPMI-1640、白蛋白、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氫鈉和HEPES。
2.根據權利要求1所述的淋巴細胞培養液，其特征在于各組分的用量如下基礎培養液RPMI-16405～15g/L白蛋白 5～15wt％L-谷氨酰胺 0.1～0.5g/L葡萄糖 1～5g/L碳酸氫鈉 1～5g/LHEPES 2～10g/LATP6～15mg/L輔酶A 30～50U/L。
3.根據權利要求2所述的淋巴細胞培養液，其特征在于各組分的用量如下基礎培養液RPMI-164010.4g/L白蛋白 10wt％L-谷氨酰胺 0.3g/L葡萄糖 2g/L碳酸氫鈉 2g/LHEPES 6g/LATP10mg/L輔酶A 40U/L。
4.一種培養淋巴細胞的方法，其特征在于具有以下步驟①制備培養液；②用步驟①制備的培養液懸浮細胞；③激活細胞；④用步驟①制備的培養液洗滌激活后的細胞；⑤收集細胞。
5.根據權利要求4所述的培養淋巴細胞的方法，其特征在于步驟①中制備培養液的方法如下在雙蒸水中分別加入基礎培養液RPMI-1640、L-谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氫鈉、HEPES，攪拌使之完全溶解，過濾除菌并保存，使用前再加入ATP和輔酶A。
6.根據權利要求4所述的培養淋巴細胞的方法，其特征在于步驟②中的懸浮細胞是指將細胞濃度調整至2.0×106個/L，再接種于細胞培養瓶中。
7.根據權利要求4所述的培養淋巴細胞的方法，其特征在于步驟③中激活細胞的方法如下第1天加入1.5×106U/L的IFN-γ，放置在37℃、5％的CO2的培養箱中培養，24小時后加入100μg/L的anti-CD3 McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1，刺激3天。
8.根據權利要求4所述的培養淋巴細胞的方法，其特征在于步驟④的洗滌是指用含有100μg/L的anti-CD3McAb、5.0×105U/L的IL-2和1.0×105U/L的IL-1的培養液進行培養，以后每3天添加該培養液。
9.根據權利要求4所述的培養淋巴細胞的方法，其特征在于步驟⑤中所述的收集細胞是指在細胞數量和細胞毒活性達到預期要求后收集細胞。
10.權利要求1至3之一所述的淋巴細胞培養液用于CIK細胞的培養。
全文摘要
本發明公開了一種淋巴細胞培養液及培養淋巴細胞的方法和應用，該培養液是在完全培養液中加入ATP和輔酶A；所述完全培養液包括基礎培養液RPMI－1640、白蛋白、L－谷氨酰胺、葡萄糖、碳酸氫鈉和HEPES。該培養方法，具有以下步驟①制備培養液；②用步驟①制備的培養液懸浮細胞；③激活細胞；④用步驟①制備的培養液洗滌激活后的細胞；⑤收集細胞。采用本發明的培養液培養細胞具有較高擴增倍數和較長傳代時間。
文檔編號C12N5/08GK101037668SQ20071007956
公開日2007年9月19日 申請日期2007年3月1日 優先權日2007年3月1日
發明者蔣敬庭 申請人:蔣敬庭