專利名稱：編碼糖原分支酶的基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼糖原分支酶的基因及其用途，特別涉及耐干燥性及/或耐低溫保存性良好的實用酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法。更加具體地說，本發明涉及通過提高編碼釀造酵母的具有糖原分支酶活性的蛋白質Glc3p的基因GLC3特別是啤酒酵母的特征基因nonScGLC3的表達量從而使耐干燥性及/或耐低溫保存性提高的酵母、使用該酵母制造酒精飲料的方法等。此外，本發明的酵母也可用作面包酵母或工業用酵母。
背景技術：
啤酒釀造工序具有的特征是，對發酵結束后的酵母進行回收并在下次發酵中使用(稱為連續釀造)。在酒精存在的條件下，將酵母保存在溫度保持為約0～3℃的槽內，而在此期間如果酵母死亡不僅會影響下次發酵，而且因自溶流出的細胞構成物可能給產品帶來不好的氣味。因此，使用耐低溫保存性良好的酵母，對自由設計工序、穩定生產高質量產品非常重要。
連續釀造的次數根據發酵條件、使用酵母的特性而不同，經過一定次數后終止。生產新的發酵酵母的工序稱為繁殖，從小規模經過多階段的規模放大進行放大培養，一般需要數日～數周時間，因此如果能夠縮短工期、或使預先大量培養的菌體在低溫或干燥狀態下長期穩定保存，在生產效率方面將會有很大價值。
有關維持高活菌率的干燥酵母的制造方法，已經對干燥裝置或溫度、添加乳化劑等制造條件進行了各種研究。例如L-干燥法能夠維持極高的活菌率，但另一方面，因為耗時長和成本高，在實際生產規模中使用不現實。
有關酵母的耐低溫性，以面包酵母為中心，已報道了幾種以提高耐冷凍性為目的的試驗。這是因為與啤酒、清酒等的釀造酵母在低溫發酵相比，面包酵母Saccharomyces cerevisiae的低溫保存性差。例如在JP特開平11-155559號公報、JP特開2003-304864號公報中，主要通過篩選法發現具有耐冷凍性及耐干燥性的面包酵母。此外，作為使用基因工程技術的例子，JP特開平10-117771號公報中報道了破壞NTH1(海藻糖基因)的海藻糖高積累菌株，JP特開2001-238665號公報中報道了破壞CAR1(精氨酸分解酶基因)的精氨酸等特定氨基酸的高積累菌株。
發明內容
在上述狀況下，期待利用編碼與釀造酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性相關的蛋白質的基因以及該蛋白質，能夠高效率生產酒精飲料或有用物質。
本發明者為了解決上述課題進行了精心研究，結果從啤酒酵母中成功鑒定、分離出編碼糖原分支酶(glycogen branching enzyme)的基因，并且制備了將得到的基因導入酵母中使其表達的轉化酵母，證實了耐干燥性及/或耐低溫保存性得到增強，從而完成了本發明。
本發明涉及編碼啤酒酵母中特征存在的新型糖原分支酶的基因、該基因編碼的蛋白質、該基因的表達受到調節的轉化酵母、通過使用該基因表達受到調節的酵母從而促進酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性的方法等。具體來說，本發明提供下述所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導入該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒精飲料的制造方法等。
(1)多核苷酸，其選自由下述(a)～(f)所組成的組(a)多核苷酸，其包括由序列號1的核苷酸序列所組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號2或的氨基酸序列組成；(c)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有糖原分支酶的活性；(d)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有的氨基酸序列與序列號2的氨基酸序列有60％以上的一致性，且具有糖原分支酶的活性；(e)多核苷酸，其包括在嚴謹條件下與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其包括在嚴謹條件下與由編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸。
(2)如上述(1)所述的多核苷酸，其選自由下述(g)～(i)所組成的組(g)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號2的氨基酸序列或者在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1～10個氨基酸的氨基酸序列所組成，且具有糖原分支酶的活性；(h)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上一致性的氨基酸序列，且具有糖原分支酶的活性；以及(i)多核苷酸，其包括在高嚴謹條件下與由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸或與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其包括由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其包括編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
(5)如上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。
(6)蛋白質，其為由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
(7)載體，其包括上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)所述的載體，其包括表達盒，該表達盒包括下述構成要素(x)～(z)(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子，(y)連接在該啟動子的有義或反義方向的上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，以及(z)涉及RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化作用并在酵母內起作用的信號。
(7b)上述(7)所述的載體，其包括表達盒，該表達盒包括下述構成要素(x)～(z)
(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子，(y)連接在該啟動子的有義方向的上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，以及(z)涉及RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化作用并在酵母內起作用的信號。
(8)酵母，其為導入上述(7)～(7b)中任一項所述的載體的酵母。
(9)上述(8)所述的酵母(實用酵母)，其耐干燥性得到增強。這里，“實用酵母”是指釀造用酵母、面包酵母、工業用酵母等具有實際使用價值的酵母。
(10)上述(8)所述的酵母，其耐低溫保存性得到增強。
(11)如上述(9)所述的酵母，其中，通過增大上述(6)所述的蛋白質的表達量使其耐干燥性得到增強。
(12)如上述(10)所述的酵母，其中，通過增大上述(6)所述的蛋白質的表達量使耐低溫保存性得到增強。
(12a)如上述(9)～(12)中任一項所述的酵母，其為釀造用酵母。
(13)酒精飲料的制造方法，其使用上述(8)～(12a)中任一項所述的酵母。
(14)如上述(13)所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
(15)如上述(13)所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。
(16)酒精飲料，其為采用上述(13)～(15)中任一項所述的方法制造的酒精飲料。
(17)被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性的評價方法，其包括使用根據具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的核苷酸序列設計的引物或探針。
(17a)使用上述(17)所述的方法選擇耐干燥性及/或耐低溫保存性增強的酵母的方法。
(17b)使用上述(17a)所述的方法所選擇的酵母制造酒精飲料(如啤酒、工業用酒精)的方法。
(17c)使用上述(17a)所述的方法所選擇的酵母制造有用物質(如蛋白質)的方法。
(18)評價被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性的方法，其包括培養被檢酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的表達量。
(18a)選擇耐干燥性及/或耐低溫保存性高的酵母的方法，其包括使用上述(18)所述的方法評價被檢酵母，并選擇編碼糖原分支酶的基因的表達量高的酵母。
(18b)使用上述(18a)所述的方法所選擇的酵母制造酒精飲料(如啤酒)的方法。
(18c)使用上述(18a)所述的方法所選擇的酵母制造有用物質(如蛋白質)的方法。
(19)酵母的選擇方法，其包括培養被檢酵母；對上述(6)所述的蛋白質進行定量或者測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的表達量；選擇上述蛋白質的量或基因表達量與目標耐干燥性及/或耐低溫保存性相應的被檢酵母。
(20)如上述(19)所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因在各酵母中的表達量；選擇與標準酵母相比該基因為高表達的被檢酵母。
(21)如上述(19)所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；對各酵母中的上述(6)所述蛋白質進行定量；選擇其具有的蛋白質的量多于標準酵母的被檢酵母。
(22)酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(8)～(12a)所述的任一酵母或根據上述(19)～(21)所述的任一方法所選擇的酵母進行發酵。
本發明的轉化酵母能夠在干燥保存或低溫保存下維持高的活菌數，所以應用于釀造等時，能夠消除酵母貯存的棘手問題，能夠有助于質量的穩定化。進而，由于干燥酵母適合長期保存，而且其重量減輕，所以對流通運輸非常有利，可用作工業用酒精生產、有用蛋白質生產等的工業用微生物。此外，本發明的酵母也可應用于面包酵母、工業用酵母。
圖1表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經時變化，橫軸表示發酵時間，縱軸表示660nm處的光密度(OD660)值。
圖2表示啤酒釀造試驗中浸出物(糖)消耗量的經時變化，橫軸表示發酵時間，縱軸表示浸出物的表觀濃度(w/w％)。
圖3表示啤酒釀造試驗中的酵母中nonScGLC3基因的表達行為，橫軸表示發酵時間，縱軸表示檢出的信號強度。
圖4表示親株及nonScGLC3高表達株的耐干燥性試驗結果。
具體實施例方式
本發明人根據JP特開2004-283169公開的方法中的啤酒酵母基因組的信息，分離、鑒定出編碼啤酒酵母特有的糖原分支酶的non基因和nonScGLC3基因。該核苷酸序列用序列號1表示，此外由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列用序列號2表示。
1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供(a)多核苷酸，其包括由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號2的氨基酸序列組成。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作為本發明對象的多核苷酸，并不限定于編碼上述具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸，而且還包括編碼與該蛋白質具有同等功能的蛋白質的其他多核苷酸。作為具有同等功能的蛋白質，其包括例如可以為(c)蛋白質，其由在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有糖原分支酶活性。此類蛋白質包括由在序列號2的氨基酸序列中，例如，缺失、替換、插入及/或添加1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1～數個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個或1個氨基酸殘基后的氨基酸序列組成，且具有糖原分支酶活性的蛋白質。上述缺失、替換、插入及/或添加的氨基酸殘基的個數，一般優選小的數目。并且此類蛋白質還包括(d)蛋白質，其含有與序列號2的氨基酸序列有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上的一致性的氨基酸序列，且具有糖原分支酶活性。上述一致性的數值一般優選大的數值。
糖原分支酶活性，例如可根據Mol.Cell.Biol.，1992 Jan；12(1)22-9中記載的方法進行評價。
本發明還包括(e)多核苷酸，其包括在嚴謹條件下與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其包括在嚴謹條件下與由編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸。
這里所述的“在嚴謹條件下進行雜交的多核苷酸”，是指將含有序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列的多核苷酸的全部或一部分、或將編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法(plaque hybridization)、Southern雜交法等得到的多核苷酸(如DNA)。雜交方法可利用如Molecular Cloning 3rd Ed.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997等記載的方法。
本說明書所述的“嚴謹條件”，可以為低嚴謹條件、中嚴謹條件、高嚴謹條件中的任一種。“低嚴謹條件”，例如為5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件；此外，“中嚴謹條件”，例如為5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件；“高嚴謹條件”，例如為5×SSC、5×Denhardt液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在這些條件中，認為溫度越高越能有效得到高同源性的多核苷酸(如DNA)。當然，一般認為影響雜交嚴謹度的因素有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多個因素，本領域技術人員可通過適當選擇這些要素實現相同的嚴謹度。
使用市售的試劑盒進行雜交時，例如，可以使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制造)。這種情況下，按照試劑盒中附帶的說明書，與標記探針過夜溫育后，在55℃的條件下用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗滌緩沖液將膜洗滌后，由此檢測被雜交的多核苷酸(如DNA)。
除此之外，可被雜交的多核苷酸還包括，與編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸有約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1以上％、99.2以上％、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、或99.9％以上一致性的多核苷酸，上述一致性是通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟件，利用系統設定的默認參數計算獲得。
氨基酸序列、核苷酸序列的一致性，可以使用Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)來確定。以BLAST算法為基礎的稱為BLASTN、BLASTX的程序也已開發出(Altschul SF，et alJ Mol Biol 215403，1990)。使用BLASTN分析核苷酸序列時，例如，使參數為score＝100、word length＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列時，例如，使參數為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，采用各程序的系統設定默認參數值。
2.本發明的蛋白質本發明還提供由上述(a)～(i)中任一種多核苷酸所編碼的蛋白質。本發明的優選蛋白質包括由在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成、且具有糖原分支酶活性的蛋白質。
此類蛋白質包括由在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加上述數量的氨基酸殘基后的氨基酸序列組成、且具有糖原分支酶活性的蛋白質。此外，此類蛋白質還包括含有與序列號2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列、且具有糖原分支酶活性的蛋白質。
此類蛋白質可通過使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等記載的定點誘變法獲得。
本發明所述的在蛋白質的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個以上的氨基酸殘基，是指在同一序列中的任意1個或多個位置上缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸殘基，并且缺失、替換、插入及添加中的2種以上可同時發生。
下面列舉可互相替換的氨基酸殘基，同一組中包含的氨基酸殘基可互相替換。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發明的蛋白質也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法制造，并且也可以利用Advanced Chem Tech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、Shimazu公司等制造的肽合成儀進行化學合成。
3.本發明的載體及導入該載體的轉化酵母本發明提供含有上述多核苷酸的載體，本發明的載體包括上述(a)～(i)中所述的任一多核苷酸(DNA)。并且，構成的本發明的載體通常包含表達盒，該表達盒包括的組成要素為(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子，(y)連接在該啟動子的有義或反義方向的上述(a)～(i)任一項所述的多核苷酸(DNA)，以及(z)涉及RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷化作用并在酵母內起作用的信號。此外，要使上述本發明的蛋白質進行高表達時，優選將上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)以有義方向導入該啟動子，以促進這些多核苷酸(DNA)的表達。
導入酵母時使用的載體可以是多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如作為YEp型載體，已知有YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)，作為YCp型載體，已知有YCp50(M.D.Roseet al.，gene，60，237，1987)，作為YIp型載體，已知有YIp5(K.Struhl etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)，且均容易獲得。
用于調節酵母中的基因表達的啟動子/終止子，只要在實用酵母中起作用的同時不受發酵液中的成分影響，可以任意組合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因均已克隆，例如，在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有詳細記載，通過已知的方法能夠容易地獲得。
因實用酵母不能利用營養缺陷型標記，因而轉化時使用的選擇性標記可利用氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)或淺藍菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)(豬腰淳嗣ら，生化學，64，660，1992；Hussainet al.，gene，101，149，1991)等。
將上述構建的載體導入宿主酵母內，作為宿主酵母可以為任意酵母(實用酵母)，例如，啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母，面包酵母，工業用酒精生產酵母，有用蛋白質生產酵母等。具體可以為例如酵母屬(Saccharomyces)等酵母，在本發明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70等、Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且還可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如協會葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等；清酒酵母，例如協會酵母清酒用7號、清酒用9號等；面包酵母，例如NBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等，但并不限于這些酵母。在本發明中，優選使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。
酵母的轉化方法可利用一般使用的公知方法，如電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質球法(Spheroplast)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、乙酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等記載的方法，但并不限于這些方法。
更具體地說，將宿主酵母在標準酵母營養培養基(如YEPD培養基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養至OD600nm值為1～6。將該培養酵母離心分離并收集，洗凈，用濃度約為1M～2M的堿金屬離子進行前處理，優選用鋰離子進行前處理。上述細胞在約30℃下，靜置約60分鐘后，與要導入的DNA(約1μg～20μg)同時在約30℃下，再靜置約60分鐘。添加聚乙二醇，優選添加約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。約30℃下靜置約30分鐘后，將上述細胞在約42℃下加熱處理約5分鐘。優選用標準酵母營養培養基將上述細胞懸浮液洗凈，加入到規定量的新鮮標準酵母營養培養基中，約30℃下靜置約60分鐘。然后，將其接種于含有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基上，獲得轉化體。此外，一般克隆技術可參照《MolecularCloning 3》、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發明的酒精飲料的制造方法以及根據該方法得到的酒精飲料將上述本發明的載體導入酵母中，能夠得到耐干燥性及/或耐低溫保存性良好的酵母。并且通過使用下述本發明的酵母的評價方法進行選擇，可以得到耐干燥性及/或耐低溫保存性良好的酵母。本發明得到的酵母的應用對象，例如可以為啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等酒精飲料的釀造；面包制造；工業用酒精生產、有用蛋白質生產等有用物質的制造等，但并不限于這些。
生產這些物質時，除使用本發明得到的實用酵母代替親株之外，可利用公知的方法。由于使用的原料、制造設備、制造管理等可與以往的方法完全相同，因而不會增加成本就可實施。
5.本發明的酵母的評價方法本發明涉及的評價方法是，使用根據具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的核苷酸序列設計的引物或探針，對被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性進行評價。上述評價方法的一般方法是公知的，例如在WO01/040514號公報、JP特開平8-205900號公報等中有記載。下面，對該評價方法進行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可采用Hereford法或乙酸鉀法等任何一種公知方法(如Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，130(1990))。使用根據編碼糖原分支酶的基因的核苷酸序列(優選ORF序列)設計的引物或探針，檢測被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異序列。可采用公知的方法設計引物或探針。
基因或特異序列的檢出可采用公知的方法實施。例如，用含有特異序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與該核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸作為一個引物，用含有該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與該核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸作為另一個引物，通過PCR法擴增酵母的核酸，測定擴增產物的有無、擴增產物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的堿基數通常為10bp以上，優選15bp～25bp。此外，夾在兩引物間的堿基數通常以300bp～2000bp為宜。
PCR法的反應條件無特別限定，例如可采用變性溫度90℃～95℃，退火溫度40℃～60℃，延伸溫度60℃～75℃，循環數10次以上等條件。得到的反應生成物通過使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等被分離，能夠測定擴增產物的分子量。通過該方法，根據擴增產物的分子量包含特定DNA分子的大小，預測、評價該酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性。并且，通過分析擴增產物的核苷酸序列，可以更準確地預測、評價上述性質。
在本發明中，通過培養被檢酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的表達量，也能夠評價被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性。此外，編碼糖原分支酶的基因的表達量的測定，能夠通過培養被檢酵母，對該基因的轉錄產物mRNA或蛋白質進行定量來進行。mRNA或蛋白質的定量可采用公知的方法進行。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法或定量RT-PCR進行，蛋白質的定量例如可通過Western印跡法進行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons 1994-2003)。
通過培養被檢酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的表達量，選擇與目標糖原合成能力相應的上述基因表達量的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望的酒精飲料的酵母。此外，也可以培養標準酵母及被檢酵母，測定各酵母中上述基因的表達量，通過比較標準酵母和被檢酵母中上述基因的表達量，從而選擇所期望的酵母。具體來說，例如通過培養標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因在各酵母中的表達量，選擇該基因的表達高于標準酵母的被檢酵母，從而選擇出適于釀造所期望酒精飲料、適于生產有用物質的酵母。
通過培養被檢酵母，選擇含有糖原分支酶活性高的蛋白質的酵母，從而選擇出適于釀造所期望酒精飲料、或適于生產有用物質的被檢酵母。
所述情況下，作為被檢酵母或標準酵母，例如可以使用導入上述本發明載體的酵母、實施突變處理的酵母、發生自然突變的酵母等。糖原分支酶的活性，例如，可根據Eur J Biochem.1993 Mar 1212(2)315-23中記載的方法進行評價。對于突變處理，例如可以使用紫外線照射、放射線照射等物理方法，以及如EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等試劑處理的化學方法等任何方法(例如，參照大泰治編著，生物化學實驗法39，酵母分子遺傳學實驗法，p67-75，學會出版中心等)(大泰治編著、生物化學実験法39酵母分子遺伝學実験法、p 67-75、學會出版センタ一)。
能夠作為標準酵母、被檢酵母使用的酵母，可以為任意酵母(實用酵母)，例如，啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母，面包酵母，工業用酒精生產酵母或有用蛋白質生產酵母等。具體可以為酵母屬(Saccharomyces)等酵母(例如Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae及Saccharomycescarlsbergensis)等。在本發明中可以使用啤酒酵母，例如，Saccharomycespastorianus W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等；并且也可以使用威士忌酵母，例如，Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如協會葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等；清酒酵母，例如，協會酵母清酒用7號、清酒用9號等；面包酵母，例如，NBRC 0555、NBRC 1346、NBRC 2043等，但并不限于這些酵母。在本發明中，優選使用啤酒酵母，例如，巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。標準酵母、被檢酵母也可以從上述酵母組中任意組合選擇。
下面根據實施例對本發明進行詳細說明，但本發明并不限于下述實施例。
實施例1 編碼糖原分支酶的基因(nonScGLC3)的克隆使用JP特開2004-283169所述的比較數據庫進行檢索，結果發現了編碼啤酒酵母的糖原分支酶的nonScGLC3基因(序列號1)。根據獲得的核苷酸序列信息，分別設計用于擴增全長基因的引物non ScGLC3_for(序列號3)/nonScGLC3_rv(序列號4)，通過以基因組解讀株Saccharomyces pastorianusWeihenstepan34/70株(簡稱“W34/70株”)的染色體DNA為模板的PCR，獲得包括non ScGLC3全長基因的DNA片段。
將上述得到的nonScGLC3基因片段，通過TA克隆插入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)分析并確定nonScGLC3基因的核苷酸序列。
實施例2 啤酒試釀中nonScGLC3基因的表達分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行啤酒試釀造，從發酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA通過啤酒酵母DNA微陣列進行檢測。
麥芽汁浸出物濃度12.69％麥芽汁體積 70L麥芽汁中溶解氧濃度 8.6ppm發酵溫度15℃酵母添加量 12.8×106cells/mL對發酵液進行經時采樣，觀察酵母增殖量(圖1)、浸出物表觀濃度(圖2)的經時變化。與此同時對酵母菌體進行采樣以制備mRNA，將制備的mRNA用生物素進行標記，使其與啤酒酵母DNA微陣列進行雜交。使用GeneChip Operating System(GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，Affymetrix公司制造)進行信號檢測，nonScGLC3基因的表達模式如圖3所示。根據該結果確認在通常的啤酒發酵中nonScGLC3基因進行表達。
實施例3 non ScGLC3高表達株的構建將實施例1所述方法得到的nonScGLC3/pCR2.1-TOPO用限制性內切酶SacI及NotI酶解，制備含有nonScGLC3基因的DNA片段。將該片段連接于經限制酶SacI及NotI處理的pYCGPYNot上，構建non ScGLC3高表達載體nonScGLC3/pYCGPYNot。pYCGPYNot為YCp型酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子進行高表達。酵母的選擇性標記包括氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大腸菌的選擇性標記包括氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用上述方法制得的高表達載體，采用JP特開平07-303475記載的方法轉化AJL4004株，采用含有氨基糖苷類抗生素(Geneticin)300mg/L的YPD平板培養基(1％酵母浸出物，2％多聚蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)選擇轉化體。
實施例4 nonScGLC3高表達株的耐干燥性評價采用以下方法評價親株(AJL4004株)及根據實施例3中記載的方法得到的nonScGLC3高表達株的耐干燥性。
每種酵母分別取1白金耳，接種于10mL麥芽汁(含有100mg/L的氨基糖苷類抗生素(Geneticin))中，30℃振蕩培養過夜。將該前培養液接種于10mL麥芽汁(同上)中，且使OD660＝0.5，然后開始增菌培養，培養2天使酵母增殖至穩定期。測定結束時的菌體濁度，將其懸浮于滅菌水中且使OD660＝2。將如此調整的懸浮液100μL裝入1.5mL微量管內，用減壓濃縮機(DNA110SpeedVac(日本國注冊商標)、ThermoSavant公司制造)處理1小時，使菌體干燥固化。
活菌率的測定采用下述方法進行。將上述得到的干燥菌體再懸浮于50μL滅菌水中，向該懸浮液中再加入50μL的0.02％亞甲藍溶液(pH值為4.5)，將失去還原能力染成藍色的菌體作為死菌體。接著，在顯微鏡下觀察該懸浮液，使用鑒定細胞死活體系(Cell Vital Analyzer System)(DA細胞計數儀、Yamato科學株式會社制造)計算活菌率。為了減小實驗誤差，計算時使基數為2000個細胞以上。
如圖4所示，親株的活菌率為19.9％，而高表達株的活菌率為30.2％，由此表明nonScGLC3高表達使酵母的耐干燥性提高。
實施例5 nonScGLC3高表達株的耐低溫性評價采用以下方法評價親株(AJL4004株)及根據實施例3中記載的方法得到的nonScGLC3高表達株的耐低溫性。采用實施例4中記載的方法培養，將制成的OD660＝2的酵母懸浮液分別在2個微量管內各注入900μL，向其中一個微量管內加入100μL滅菌水，另一個微量管內加入100μL的99.5％的乙醇(最終濃度10％)。將其于5℃下保存4周時間，然后采用與實施例4同樣的方法計算活菌率。
工業實用性根據本發明，能夠提高酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性，因此能夠使酵母長期穩定保存，能夠提高酒精飲料(例如啤酒)釀造、面包制造、工業用酒精生產、有用蛋白質生產等有用物質的生產效率。
序列表<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>編碼糖原分支酶的基因及其用途(Gene encoding glycogen branching enzyme and use thereof)<130>G06-0101CN<150>JP2006-54196<151>2006-02-28<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2115<212>DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>1atgtacaacg ttcctgataa tgtcaaaggt gcagtcgaat tcgatccgtg gctgaaaccc60tttgcggatg tgctatccga gagaagatac ctggccgaca agtggtctta cgatatcact120catgccacgc ccgatggttc gtaccagtcg ctgagtaaat tctctagaga ttcatataag180tcgtatgggt tgcatgccaa cccagatact aaggatatta cctacaaaga atgggcaccc240aatgctcaac gtgcatattt agtgggggag tttaacaact ggaatactac atctcatgag300ctcaaggaca aggacgagtt cggaaatttc accatcacta tccctcccct atcgaatggt360gactttgcca ttcctcatga ctctaagatt aaggtgatgt ttgttttgcc ggatggttct420
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<210>2<211>704<212>PRT<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>2Met Tyr Asn Val Pro Asp Asn Val Lys Gly Ala Val Glu Phe Asp Pro1 5 10 15Trp Leu Lys Pro Phe Ala Asp Val Leu Ser Glu Arg Arg Tyr Leu Ala20 25 30Asp Lys Trp Ser Tyr Asp Ile Thr His Ala Thr Pro Asp Gly Ser Tyr35 40 45Gln Ser Leu Ser Lys Phe Ser Arg Asp Ser Tyr Lys Ser Tyr Gly Leu50 55 60His Ala Asn Pro Asp Thr Lys Asp Ile Thr Tyr Lys Glu Trp Ala Pro65 70 75 80Asn Ala Gln Arg Ala Tyr Leu Val Gly Glu Phe Asn Asn Trp Asn Thr85 90 95Thr Ser His Glu Leu Lys Asp Lys Asp Glu Phe Gly Asn Phe Thr Ile100 105 110Thr Ile Pro Pro Leu Ser Asn Gly Asp Phe Ala Ile Pro His Asp Ser115 120 125Lys Ile Lys Val Met Phe Val Leu Pro Asp Gly Ser Glu Ile Phe Arg130 135 140Leu Pro Ala Trp Ile Thr Arg Ala Thr Gln Pro Ser Lys Glu Thr Ser145 150 155 160Lys Gln Phe Gly Pro Val Tyr Glu Gly Arg Phe Trp Asn Pro Gln Thr
165 170 175Ser Tyr Asn Phe Val Asn Pro Arg Pro Lys Phe Asn Gly Ser Val Asp180 185 190Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ala His Val Gly Ile Ser Ser Pro Glu Pro195 200 205Lys Val Thr Thr Tyr Lys Glu Phe Thr Glu Lys Val Leu Pro Arg Ile210 215 220Lys Tyr Leu Gly Tyr Asp Ala Ile Gln Leu Met Ala Ile Met Glu His225 230 235 240Ala Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr Gln Val Thr Asn Phe Phe Ala Ala245 250 255Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Glu Glu Leu Lys Glu Leu Val Asp Thr260 265 270Ala His Gly Met Gly Ile Ile Val Leu Leu Asp Val Val His Ser His275 280 285Ala Ser Lys Asn Val Glu Asp Gly Leu Asn Met Phe Asp Gly Ser Asp290 295 300His Gln Tyr Phe His Ser Val Ser Ser Gly Arg Gly Glu His Pro Leu305 310 315 320Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Lys Phe Glu Val Gln Arg Phe325 330 335Leu Leu Ala Asn Leu Ala Phe Tyr Val Asp Val Tyr Gln Phe Asp Gly340 345 350Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Leu Tyr Val His His Gly Val355 360 365Gly Glu Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asp Tyr Asn Glu Tyr Leu Ser Arg370 375 380Asp Arg Ser Ser Val Asp His Glu Ala Leu Ala Tyr Leu Met Leu Ala385 390 395 400
Asn Asp Leu Val His Glu Leu Leu Pro Gln Ser Ala Val Thr Ile Ala405 410 415Glu Asp Val Ser Gly Tyr Pro Thr Leu Cys Leu Pro Arg Ser Ile Gly420 425 430Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Arg Leu Ala Met Ala Leu Pro Asp Met Trp435 440 445Ile Lys Leu Ile Lys Glu Lys Ala Asp Asp Glu Trp Glu Met Gly Gly450 455 460Ile Val Tyr Thr Leu Thr Asn Arg Arg His Gly Glu Lys Val Val Ala465 470 475 480Tyr Cys Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Leu Ala485 490 495Phe Trp Leu Met Asp Ala Ser Met Tyr Thr Asp Met Thr Val Leu Lys500 505 510Glu Pro Thr Ile Ile Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile515 520 525Arg Leu Ile Thr His Ser Leu Gly Gly Glu Ala Tyr Leu Asn Phe Glu530 535 540Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Leu Asp Phe Pro Asn Ala Asn545 550 555 560Asn Gly Asp Ser Tyr Lys Tyr Ala Arg Arg Gln Phe Asn Leu Ala Asp565 570 575Asp Pro Leu Leu Arg Tyr Gln Asn Leu Asn Glu Phe Asp Arg Ser Met580 585 590Gln Leu Cys Glu Lys Lys His Lys Trp Leu Asn Thr Glu Gln Ala Tyr595 600 605Val Ser Leu Lys Asn Glu Lys Asp Lys Met Ile Val Phe Glu Arg Asn610 615 620Asn Leu Leu Phe Ile Phe Asn Phe His Pro Thr Asp Ser Tyr Ser Asp
625 630 635 640Tyr Arg Val Gly Val Glu Lys Ala Gly Thr Tyr His Ile Val Leu Asn645 650 655Ser Asp Arg Ala Glu Phe Gly Gly His Asn Arg Ile Asn Glu Thr Ser660 665 670Glu Phe Phe Thr Thr Asp Leu Glu Trp Asn Asn Arg Arg Asn Phe Ile675 680 685Gln Val Tyr Ile Pro Ser Arg Val Cys Leu Val Leu Ala Leu Lys Glu690 695 700<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>3gagctcatag cggccatgta caacgttcct gataatgtca40<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>4ggatcctatg cggccgcttt atatatgaaa aggaaggaag ca 4權利要求
1.多核苷酸，其選自由下述(a)～(f)所組成的組(a)多核苷酸，其包括由序列號1的核苷酸序列所組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號2的氨基酸序列組成；(c)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列組成，且具有糖原分支酶的活性；(d)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有的氨基酸序列與序列號2的氨基酸序列有60％以上的一致性，且具有糖原分支酶的活性；(e)多核苷酸，其包括在嚴謹條件下與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其包括在嚴謹條件下與由編碼具有序列號2的氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其選自由下述(g)～(i)所組成的組(g)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質由序列號2的氨基酸序列或者在序列號2的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1～10個氨基酸的氨基酸序列所組成，且具有糖原分支酶的活性；(h)多核苷酸，其包括編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序列號2的氨基酸序列有90％以上一致性的氨基酸序列，且具有糖原分支酶的活性；以及(i)多核苷酸，其包括在高嚴謹條件下與由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸或與由序列號1的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的多核苷酸進行雜交，且編碼具有糖原分支酶活性的蛋白質的多核苷酸。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其包括由序列號1的核苷酸序列組成的多核苷酸。
4.如權利要求1所述的多核苷酸，其包括編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
5.如權利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。
6.蛋白質，其為由權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
7.載體，其包括權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
8.酵母，其為導入權利要求7所述的載體的酵母。
9.如權利要求8所述的酵母，其耐干燥性得到增強。
10.如權利要求8所述的酵母，其耐低溫保存性得到增強。
11.如權利要求9所述的酵母，其中，通過增大權利要求6所述的蛋白質的表達量使其耐干燥性得到增強。
12.如權利要求10所述的酵母，其中，通過增大權利要求6所述的蛋白質的表達量使耐低溫保存性得到增強。
13.酒精飲料的制造方法，其使用權利要求8～12中任一項所述的酵母。
14.如權利要求13所述的方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
15.如權利要求13所述的方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。
16.酒精飲料，其為采用權利要求13～15中任一項所述的方法制造的酒精飲料。
17.被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性的評價方法，其包括使用根據具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的核苷酸序列設計的引物或探針。
18.評價被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性的方法，其包括培養被檢酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的表達量。
19.酵母的選擇方法，其包括培養被檢酵母；對權利要求6所述的蛋白質進行定量或者測定具有序列號1的核苷酸序列且編碼糖原分支酶的基因的表達量；選擇上述蛋白質的量或基因表達量與目標耐干燥性及/或耐低溫保存性相應的被檢酵母。
20.如權利要求19所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；測定具有序列號1的核苷酸序列且糖原分支酶的基因在各酵母中的表達量；選擇與標準酵母相比該基因為高表達的被檢酵母。
21.如權利要求19所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；對各酵母中的權利要求6所述的蛋白質進行定量；選擇其中具有的蛋白質的量多于標準酵母的被檢酵母。
22.酒精飲料的制造方法，其包括使用權利要求8～12所述的任一酵母或根據權利要求19～21所述的任一方法所選擇的酵母進行發酵。
全文摘要
本發明涉及編碼糖原分支酶的基因及其用途，特別涉及耐干燥性及/或耐低溫保存性良好的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。更加具體地說，本發明涉及通過提高編碼釀造酵母的糖原分支酶Glc3p的GLC3基因特別是啤酒酵母的特征基因nonScGLC3的表達量從而使耐干燥性及/或耐低溫保存性提高的酵母、使用該酵母的酒精飲料制造方法等。
文檔編號C12C11/02GK101041829SQ20071008526
公開日2007年9月26日 申請日期2007年2月16日 優先權日2006年2月28日
發明者中尾嘉宏, 兒玉由紀子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社