專利名稱：山羊皮膚表達基因探針序列及其構成的基因芯片的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，特別是涉及動物皮膚表達基因探針和構成基因芯片。
背景技術：
生物基因組中可轉錄表達的基因序列，就目前所掌握的情況看雖然僅占總序列的3～5％，但若對這部分序列的表達特征進行測定和比較，可以直接導致一些新特征的發現，并可從中獲取基因組中與產業化關系最為密切的信息。20世紀90年代人類基因組計劃和生物信息學興起后，使得利用比較基因組技術來獲取跨物種的保守基因序列成為可能。再以保守基因序列作為基礎利用，就能進一步地在保守基因序列的近3’端找到短的核苷酸探針序列，進而就可以以此序列為探針，比較出該基因在不同時空的表達模式即表達譜。簡而言之，該核苷酸探針系列(即OLIGO序列)來自表達基因的近3’端，特異性的代表了基因的部分轉錄片斷。
隨著生物技術的發展和生命科學發展的需要以及諸多物種基因組計劃的逐步展開，人們迫切需要高通量的了解多基因的表達譜，為此，基因芯片應運而生。所謂基因芯片的實質就是在面積不大的基片上有序地點陣排列了一系列固定于一定位置上可尋址的生物識別分子。運用基因芯片技術，將獲得的相關數據運用雜交技術和掃描技術進行芯片的有效數據分析處理，即可獲得相應的基因表達譜。目前的DNA芯片具有較強的可用性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點而被應用在許多領域，如DNA序列測定、基因多態性檢測、新基因的發現、疫苗和藥物研究、特征標記的篩選、生物抗逆性研究、有機體的發育、調節細胞功能的基因互作研究、檢測不同發育時期不同組織中基因的變化規律以及基因調控網絡的構建等。分析基因組規模化的基因表達數據，將最終導致對細胞分化的整體性觀察，涉及細胞增殖、細胞凋亡、能量代謝、細胞通訊、細胞遷移等不同系統生物學層次。
雖然上述研究已取得一定突破，但針對山羊來說，目前來看還是一項空白。
發明內容
基于上述因素，本發明選動物中的山羊做本體進行了研究，找到了山羊皮膚差異表達基因探針序列及其構成的基因芯片。其目的在于提供一種可作比較用的基因探針序列及其基因芯片，作為以后基因分析的借鑒模式。通過對表達基因探針及其構成的基因芯片進行表達譜分析，有助于發現基因互作模式、構建基因調控網絡、疾病檢測、藥物毒理學分析、分析基因在不同組織的表達特異性和對細胞和有機體的整體研究等 本發明篩選出的山羊皮膚表達基因探針，是一種運用同源性檢索技術篩選出的哺乳動物保守基因序列，本發明篩選了差異表達的基因探針序列225個，它們所對應的基因名稱和序列信息由附表給出，其具體編號是NMBI001～NMBI225。
所述的OLIGO序列具有給定列表中的一條或數條的組合，并包括其中每條序列的互補序列或同源序列，同時還包括表中每條序列中的8～65個連續核苷酸為探針的序列或其互補序列。
由上述OLIGO序列探針所構成的基因芯片，是在載體上結合有列表中所示的序列、同源序列或其互補序列的核酸分子，其載體為固相或液相載體。固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠，核酸分子包括脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸、多聚肽核苷酸。
OLIGO基因芯片是用于生物功能的研究和檢測的一個基本條件。這里，所述的生物包括家畜、植物以及它們的細胞、組織器官及其系統；所述的生物功能的研究包括家畜抗逆性、家畜育種和家畜新品種的產生、雜種優勢的早期預測、新型抗寄生蟲藥物的篩選、動植物生長和發育的機理和藥物的毒理學；所述的生物功能的檢測包括轉基因動植物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、生物物種的鑒定，包括動植物和微生物。
本發明是采用同源性檢索技術篩選了哺乳動物保守基因序列并合成該序列的一段寡核苷酸探針，以所獲得的探針序列應用微陣列技術制成OLIGO基因芯片，將該獲得的基因芯片用于檢測和比較山羊不同部位不同時期皮膚的基因表達譜，獲得了差異表達的225個探針序列。包含此225個OLIGO探針序列的基因芯片能用于對家畜的重要經濟性狀的基因克隆、標記輔助選擇、雜種優勢的早期預測、抗寄生蟲藥物的篩選、新藥物的發現和毒理學研究、疾病診斷、動植物育種和家畜新品種的產生、家畜抗逆性的研究和動植物品種的鑒定等。
本發明的優點是，用獲得的不同時期不同部位皮膚差異表達基因探針序列制成OLIGO基因芯片具有許多商用價值和科研價值可用于分析不同生理、病理條件下多個基因的表達模式；應用該基因芯片也可用于對家畜經濟性狀的標記輔助選擇和雜種優勢的早期預測，篩選出最佳選配模式或雜交配對；應用該基因芯片也能用于對轉基因農產品進行安全性檢驗；應用該基因芯片還可以用于查找藥物的毒性和副作用，進行毒理學研究，利于對新型殺滅寄生蟲藥物的篩選；該基因芯片可用于動植物的育種和家畜新品種的產生；該基因芯片還可用于從整體上研究整個mRNA的表達，這對生物體基因調節的整體性研究具有重要的科研和實踐指導價值；應用該基因芯片還可以運用突變體研究信號轉導、細胞通訊，為發現家畜的基因功能和生理代謝途徑提供重要的理論依據；該基因芯片能夠作為一種商品，廣泛應用于臨床、醫藥行業以及實際生產中。
圖1為基因芯片示意圖； 圖2為雜交結果示意圖。
具體實施例方式 本發明的實施主要包含探針系列的篩選和合成、基因芯片的制備和應用。
1.關于保守基因及其3’端探針序列的篩選 根據GenBank上發表的哺乳動物基因組數據和非冗余序列數據庫，結合皮膚基因表達的特點和規律，選擇感興趣的保守基因并以這些基因為基礎做BLAST搜索，搜尋基因的近3’端保守區，對找到的3’端保守區序列做優化分析，篩選符合探針要求的序列集合并進一步優化。
2.關于OLIGO探針序列的合成 按照探針序列表中的序列信息NMBI001-NMBI225合成探針序列。
3.關于基因芯片的制備 把上述OLIGO探針用于基因芯片的點制，基因芯片由機器人平臺點制在一張75×25mm、經過化學修飾的載玻片上。整個點陣分成48個亞陣，每個亞陣均設立陽性對照和陰性對照，以保證試驗的可靠性。芯片的點陣示意如圖1其中，1為載片，2為亞陣，其中，每個亞陣有22行、22列，點間距為185um，點的直徑約為150um。
4、實施例——利用包含上述探針序列的芯片比較絨山羊不同部位皮膚基因表達的差異 Trizol一步法提取皮膚組織塊或皮膚細胞中的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進一步對總RNA進行過柱純化，最后用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢。對樣品RNA進行反轉錄和熒光標記，標記的DNA溶于雜交液中雜交過夜。雜交結束后洗滌甩干后用于掃描，雜交結果如圖2。該圖2反映了絨山羊不同部位皮膚基因表達模式的差異，這一設計完全達到預想效果。圖中，白色箭頭所指是第10亞陣第2行第1列的點樣，代表山羊的HOXB7基因(Homeobox protein Hox-B7)，探針編號為NMBI084。
5、附表探針對應基因名稱及序列信息表。
權利要求
1. 所篩選出的山羊皮膚表達基因探針序列，其特征在于所合成的該序列的一段寡核苷酸探針，即OLIGO探針序列，共225個，它們對應的基因名稱和序列信息由附表給出，其具體編號為NMBI001～NMBI225。
2. 根據權利要求1所述的山羊皮膚表達基因探針序列，其特征在于所述的OLIGO探針序列具有NMBI001～NMBI225所示的序列中的一條或數條的組合。
3. 根據權利要求1所述的山羊皮膚表達基因探針序列，其特征在于所述的OLIGO序列包括NMBI001～NMBI225所示的序列中每條序列的互補序列或同源序列。
4. 根據權利要求1所述的山羊皮膚表達基因探針序列，其特征在于所述的OLIGO序列包括NMBI001～NMBI225所示的每條序列中的8～65個連續核苷酸為探針的序列或其互補序列。
5. 權利要求1或2～4所述的山羊皮膚表達基因探針序列所組成的基因芯片，其特征在于在載體上結合有NMBI001-NMBI225所示的序列、同源序列或其互補序列的核酸分子。
6. 根據權利要求5所述的基因芯片，其特征是所述的載體為固相載體或液相載體。
7. 根據權利要求6所述的基因芯片，其特征在于所述固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。
8. 根據權利要求5所述的基因芯片，其特征在于所述的核酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸、多聚肽核苷酸。
全文摘要
本發明涉及生物技術，針對絨山羊提出，主要是公開了其皮膚差異表達基因探針序列及其構成的基因芯片。基本做法是，運用同源性檢索技術篩選哺乳動物保守基因序列，并合成該序列的一段寡核苷酸探針，再以微陣列技術制成OLIGO基因芯片。所述芯片將探針按48個亞陣點制在一張載玻片上，每個亞陣均設立陽性對照和陰性對照。將獲得的探針與芯片用于檢測和比較山羊不同部位不同時期皮膚的基因表達譜時，獲得了差異表達的225個探針序列。包含此225個OLIGO探針序列的基因芯片，能用于家畜的重要經濟性狀的基因克隆、標記輔助選擇、雜種優勢的早期預測、抗寄生蟲藥物的篩選、新藥物的發現和毒理學研究等。
文檔編號C12N15/11GK101270387SQ200710091230
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月23日 優先權日2007年3月23日
發明者張文廣, 李金泉 申請人:張文廣