一種低成本的CBFB基因斷裂快速檢測探針及其制備方法和應用與流程

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種低成本的cbfb基因斷裂快速檢測探針及其制備方法和應用。

背景技術：

檢測cbfb基因斷裂是診斷急性早幼粒細胞白血病(apl)最特異最敏感的方法之一，也是apl治療方案選擇、療效分析預后分析等最可靠的指標。目前核型分析、pcr法和fish法是常見的幾種檢測方式。fish具有安全、快速、靈敏度高及同時顯示多種顏色等優點。

熒光原位雜交是一種在20世紀80年代放射性原位雜交技術基礎上發展起來的一種非放射性分子遺傳技術，以熒光素標記取代放射性同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。目前fish常用的檢測探針主要是通過對特定人類基因組bac克隆進行缺口平移法或隨機引物法標記，再經cot-1dna封閉后用于原位雜交實驗，但此方法包含大量的重復序列即使經過cot-1dna封閉但雜交結果仍具有較高的背景，并且此種方法標記的探針通常需要12-16h(過夜)來完成雜交實驗費時費力并且此種方需要大量(通常是探針濃度的50～100倍)昂貴的cot-1dna來進行重復序列封阻，這大大的增加了探針的制備成本。此外近年來一種不含重復序列的快速熒光原位雜交探針的制備方法也被建立起來(1h完成雜交實驗)，但此種方法需要設計大量引物或者構建大量載體來實現探針的制備，并且探針的制備過程仍采用缺口平移或隨機引物等傳統方法，導致批次間的不穩定；此外此種制備方法仍然需要依賴于人類基因組序列或者bac克隆序列，原料來源具有一定局限性，并且整個制備過程繁瑣，制備成本和不可控因素大大增加。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種低成本的cbfb基因斷裂快速檢測探針及其制備方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種低成本的cbfb基因斷裂快速檢測探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)從ucscgenomebrowser下載cbfb基因探針所覆蓋區域的基因組非重復序列，其中cbfb上游探針覆蓋區域為：chr16:66885331-67101057，cbfb下游探針覆蓋區域為：chr16:67122220-67337946；

(2)將步驟(1)獲得的cbfb基因上游探針所覆蓋區域的基因組非重復序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區塊；將分割后的區塊批量導入oligoarray軟件進行探針設計、探針篩選，然后將篩選出的探針導出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標簽序列，得到一系列帶有標簽序列的cbfb基因上游探針序列；

(3)將步驟(1)獲得的cbfb基因下游探針所覆蓋區域的基因組非重復序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的區塊；將分割后的區塊批量導入oligoarray軟件進行探針設計、探針篩選，然后將篩選出的探針導出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標簽序列，得到一系列帶有標簽序列的cbfb基因下游探針序列；

(4)使用dna合成儀對步驟(2)所得帶有標簽序列的cbfb基因上游探針序列進行化學合成，將化學合成的探針進行混合，制備得到cbfb基因上游探針庫；同理，使用dna合成儀對步驟(3)所得帶有標簽系列的cbfb基因下游探針序列進行化學合成，將化學合成的探針進行混合，制備得到cbfb基因下游探針庫；

(5)分別合成5’端帶有綠色熒光基團的m13通用引物和5’端帶有橘紅色熒光基團的m13通用引物，使用5’端帶有綠色熒光基團的m13通用引物對cbfb基因上游探針庫進行擴增標記反應，使用5’端帶有橘紅的熒光基團的m13通用引物對cbfb基因下游探針庫進行擴增標記反應；

(6)步驟(5)所得cbfb基因上游探針庫的擴增標記產物經純化、稀釋后得到熒光標記的cbfb基因上游探針庫，步驟(5)所得cbfb基因下游探針庫的擴增標記產物經純化、稀釋后得到熒光標記的cbfb基因下游探針庫，所述熒光標記的cbfb基因上游探針庫和熒光標記的cbfb基因下游探針庫構成了cbfb基因斷裂快速檢測探針。

上述方案中，步驟(2)和步驟(3)中所述探針篩選的條件為：探針長度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探針間最小間隔5bp。

上述方案中，步驟(2)和步驟(3)中所述標簽序列的堿基序列如下所示：

5’端標簽序列為：tgtaaaacgacggccag(m13上游序列)

3’端標簽序列為：ggtcatagctgtttcctg(m13下游序列)。

上述方案中，步驟(5)中所述通用引物序列為：

m13-ftgtaaaacgacggccagt；

m13-rcaggaaacagctatgacc。

上述方案中，步驟(5)所述擴增標記反應的pcr反應體系如下：

上述方案中，步驟(5)所述擴增標記反應的pcr反應條件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進行20個循環；72℃10min。

包含上述制備方法制備所得cbfb基因斷裂快速檢測探針的試劑盒。

上述試劑盒在制備檢測cbfb基因斷裂試產品中的應用，具體的應用方式包括如下步驟：

(1)樣本處理：將外周血細胞滴片樣本放入盛有2×ssc的容器中，微波爐高火加熱處理3min直至液體沸騰，然后再中低火繼續加熱處理10min，處理完成后立即將玻片置于-20℃預冷的梯度酒精中脫水晾干，備用；

(2)cbfb基因斷裂快速檢測探針雜交混合物的制備：將熒光標記的cbfb基因上游探針庫、熒光標記的cbfb基因下游探針庫和雜交緩沖液按照1:1:9的體積比混合；

(3)探針樣本共変性：每例樣本使用10ul步驟(2)混合所得cbfb基因斷裂快速檢測探針雜交混合物，使用22×22mm蓋玻片蓋片，使用橡皮膠封片，封片后將玻片置于雜交儀中90℃變性1min，37℃雜交15～30min；

(4)雜交后洗滌：待雜交完成后揭去蓋玻片，將玻片置于60℃預熱的洗液中洗滌去除未結合探針；

(5)復染及鏡檢：將晾干的玻片滴加10ul抗淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察雜交結果。

上述方案中，步驟(2)中所述雜交緩沖液的組分為：10wt％去離子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1ugrnasea、0.6m氯化鈉、10mm檸檬酸緩沖液、0.5mmctab(十六烷基三甲基溴化銨)。

上述方案中，步驟(3)中所述洗液含0.3m氯化鈉、0.03m檸檬酸鈉和0.1％tween-20。

本發明的有益效果如下：

(1)相比于傳統的bac克隆fish，本發明所述制備方法完全不依賴bac克隆，且不含有重復序列，不需要昂貴的cot-1dna進行封閉，大大降低了雜交背景和制備成本。

(2)相比于近年來建立的不含重復序列的快速熒光原位雜交探針的制備方法，本發明所述制備方法中，探針的篩選主要依賴程序完成，并且使用的是更為穩定的pcr法擴增和標記探針，探針標記率更高更均一，僅在探針5’端進行熒光標記所以不影響探針的雜交配對反應；此外本發明不采用容易受環境或操作手法影響的缺口平移反應和隨機引物反應來標記探針，所標記的探針長短一致，增加了批次間的穩定性；

(3)與現有技術相比，本發明通過優化探針設計配合特定的雜交緩沖液以及獨特的檢測方法，本發明可在15-30min內完成雜交實驗，這比現有技術中最快需要1h來完成雜交實驗所耗費的時間相比，降低了50％以上。

(4)本發明所述的探針具有極高的信噪比，并且具有很高的特異性和樣本檢出率。

附圖說明

圖1為探針制備示意圖。

圖2為探針與靶基因結合示意圖。

圖3為chunks.pl程序使用代碼圖。

圖4為去除重復序列后cbfb基因斷裂檢測試劑盒部分探針序列圖。

圖5為本發明cbfb基因斷裂檢測探針的檢測結果圖。

圖6為本發明cbfb基因斷裂檢測探針與雅培探針不同雜交時間結果對比圖。

具體實施方式

為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1cbfb基因斷裂快速檢測探針的制備

本實施例所述cbfb基因斷裂快速檢測探針的制備過程示意圖如圖1所示，具體包括如下步驟：

(1)從ucscgenomebrowser下載cbfb基因探針所覆蓋區域的基因組非重復序列，其中cbfb上游探針覆蓋區域為：chr16:66885331-67101057，cbfb下游探針覆蓋區域為：chr16:67122220-67337946；所獲取的序列保存為fasta格式，基因組中重復序列區域替換為n；

(2)將步驟(1)獲得的cbfb基因上游探針所覆蓋區域的基因組非重復序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代碼圖見圖3)分割成1kb大小的區塊；將分割后的區塊批量導入oligoarray軟件進行探針設計、探針篩選，探針篩選的條件為：探針長度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含tttt/gggg/aaaa/cccc，探針間最小間隔5bp；然后將篩選出的探針導出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標簽序列，得到帶有標簽的一系列cbfb基因上游探針序列(圖4所示為cbfb基因探針池，由于序列過多不一一展示)；標簽序列的堿基序列如下：

5’端標簽序列為：tgtaaaacgacggccag(m13上游序列)，

3’端標簽序列為：ggtcatagctgtttcctg(m13下游序列)；

(3)將步驟(1)獲得的cbfb基因下游探針所覆蓋區域的基因組非重復序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代碼圖見圖3)分割成1kb大小的區塊；將分割后的區塊批量導入oligoarray軟件進行探針設計、探針篩選，探針篩選的條件為：探針長度50bp，tm值85～99℃，gc比40～80％，不含ttttt/gggg/aaaaa/cccc，探針間最小間隔5bp；然后將篩選出的探針導出到excel表格中，再分別在每條探針的5’端和3’端加上18bp的標簽序列，得到帶有標簽的一系列cbfb基因下游探針序列；標簽序列的堿基序列同步驟(2)；

(4)使用dna合成儀對步驟(2)所得帶有標簽序列的cbfb基因上游探針序列進行化學合成，將化學合成的探針進行混合，制備得到cbfb基因上游探針庫，所述cbfb基因上游探針庫包含1109條帶有標簽序列的cbfb基因上游探；同理，使用dna合成儀對步驟(3)所得帶有標簽序列的cbfb基因下游探針序列進行化學合成，將化學合成的探針進行混合，制備得到cbfb基因下游探針庫，所述cbfb基因下游探針庫包含1238條帶有標簽序列的cbfb基因下游探針；

(5)分別合成5’端帶有綠色熒光基團和橘紅色熒光基團的m13通用引物，通用引物序列為：m13-ftgtaaaacgacggccagt，m13-rcaggaaacagctatgacc；使用5’端帶有綠色熒光基團的m13通用引物對cbfb基因上游探針庫進行擴增標記反應；使用5’端帶有橘紅的熒光基團的m13通用引物對cbfb基因下游探針庫進行擴增標記反應；所述擴增標記反應的pcr反應體系如下：

所述擴增標記反應的pcr反應條件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共進行20個循環；72℃10min；

(6)使用乙醇醋酸鈉法分別對步驟(5)所得cbfb基因上游探針庫的擴增標記產物和cbfb基因下游探針庫的擴增標記產物進行純化，純化后再經稀釋得到：濃度為20ng/ul的熒光標記的cbfb基因上游探針庫和濃度為20ng/ul的熒光標記的cbfb基因下游探針庫。

實施例2cbfb基因斷裂快速檢測探針的檢測方法

本實施例所述cbfb基因斷裂快速檢測探針在用于檢測cbfb基因斷裂的試劑盒中的應用，具體包括如下步驟：

(1)樣本處理：將外周血細胞滴片樣本放入盛有2×ssc的容器中，微波爐高火加熱處理3min直至液體沸騰，然后再中低火繼續加熱處理10min，處理完成后立即將玻片置于-20℃預冷的梯度酒精中脫水晾干，備用；

(2)cbfb基因斷裂快速檢測探針雜交混合物的制備：將實施例1制備所得濃度為20ng/ul的熒光標記的cbfb基因上游探針庫、濃度為20ng/ul的熒光標記的cbfb基因下游探針庫和雜交緩沖液按照1:1:9的體積比混合；所述雜交緩沖液的組分為：10wt％去離子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1ugrnasea、0.6m氯化鈉、10mm檸檬酸緩沖液、0.5mmctab(十六烷基三甲基溴化銨)；

(3)探針樣本共変性：每例樣本使用10ul步驟(2)混合所得cbfb基因斷裂快速檢測探針雜交混合物，使用22×22mm蓋玻片蓋片，使用橡皮膠封片，封片后將玻片置于雜交儀中90℃變性1min，37℃雜交15min～30min；

(4)雜交后洗滌：待雜交完成后揭去蓋玻片，將玻片置于60℃預熱的洗液(含0.3m氯化鈉、0.03m檸檬酸鈉和0.1％tween-20)中洗滌去除未結合探針；

(5)復染及鏡檢：將晾干的玻片滴加10ul抗淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察雜交結果。

注意事項：步驟(2)～步驟(4)需避光操作，檢測結果如圖5所示。

采用實施例1制備的cbfb基因斷裂快速檢測探針及實施例2所述檢測方法，設置雜交的時間梯度為15min、30min、16h；同時使用雅培公司cbfb基因斷裂檢測探針嚴格按照其提供的說明書進行樣本處理及雜交操作，同樣設置雜交15min、30min、16h時間梯度，作為對照。檢測結果如圖6所示，從圖6看出：本發明所制備的cbfb基因斷裂快速檢測探針在雜交時間為15min時就有較好的雜交信號強度，雜交時間為30min及以上時均具有強烈雜交信號；雅培公司雅培公司cbfb基因斷裂檢測探針僅在雜交時間為16小時出現可見清晰雜交信號，充分說明了本發明制備的探針雜交所用時間短及雜交信號強的特點，也說明了本發明制備的探針具有極高的信噪比，很高的特異性和樣本檢出率。同時本發明制備的探針不含重復系列，且探針長短均一，探針與靶基因結合示意圖如圖2所示，從圖2看出，所述探針與靶基因非重復系列區域的結合特異性非常高。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之內。