新型肽生成酶基因的制作方法

專利名稱：新型肽生成酶基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及不必通過復雜的合成方法即可容易地、高產率地和廉價地生成肽的新型酶。更具體地，本發明涉及催化由羧基成分和胺成分的肽生成反應的新型酶，產生該酶的微生物，以及采用該酶或微生物生產二肽的方法。
背景技術：
肽被用于藥物、食品領域和多種其它領域中。例如，由于L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的穩定性和水溶性高于L-谷氨酰胺，故其被廣泛地用作輸液和無血清培養基的成分。
化學合成法(生產肽的已知方法)并非總是容易的方法。所述方法的已知實例包括使用N-芐氧羰基丙氨酸(以下稱為“Z-丙氨酸”)和保護的L-谷氨酰胺的方法(參見Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))，使用Z-丙氨酸和保護的L-谷氨酸-γ-甲酯的方法(參見Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))，使用Z-丙氨酸酯和無保護的谷氨酸的方法(參見專利文件1)，包括用2-取代的丙酰鹵化物為原料，合成N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物作為中間體的方法(參見專利文件2)。
但是，由于所有這些方法需要引入和脫去保護基或使用光學活性中間體，故這些方法不能充分滿足工業上有利的要求。
另一方面，使用酶的典型肽生產方法的眾所周知的實例包括使用N保護的和C無保護的羧基成分和N無保護的、C保護的胺成分的縮合反應(以下稱為“反應1”)，和使用N保護的和C保護的羧基成分和N無保護的、C保護的胺成分的置換反應(以下稱為“反應2”)。反應1的實例是由Z-天門冬氨酸和丙氨酸甲酯生產Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(參見專利文件3)，而反應2的實例是由乙酰苯丙氨酸乙酯和亮氨酰胺生產乙酰苯丙氨酰亮氨酰胺(參見Biochemical J.，163，531(1977))。有關使用N無保護的、C保護的羧基成分的方法的研究報告例非常少。在國際專利出版物WO 90/01555(專利文件4)中，描述了使用N無保護的、C保護的羧基成分和N無保護的、C保護的胺成分的置換反應(以下稱為“反應3”)的實例。例如，其中描述了由精氨酸乙酯和亮氨酰胺生產精氨酰亮氨酰胺的方法。在歐洲專利出版物EP 278787A1(專利文件5)和歐洲專利出版物EP 359399B1(專利文件6)中，描述了使用N無保護的、C保護的羧基成分和N無保護的、C無保護的胺成分的置換反應(以下稱為“反應4”)的實例。例如，其中描述了酪氨酸乙酯和丙氨酸生產酪氨酰丙氨酸的方法。
專利文件1；日本專利申請H1-96194號公報。
專利文件2；專利申請H6-234715號公報。
專利文件3；日本專利申請S53-92729號公報。
專利文件4；國際專利出版物WO 90/01555公報專利文件5；歐洲專利出版物EP 278787A1公報專利文件6；歐洲專利出版物EP 359399B1公報非專利文件1；Biochemical J.，163，531(1977)發明概述在上述反應1-4的方法中，最廉價的生產方法自然屬于保護基最少的反應4。
但是，現有技術中反應4的實例(參見歐洲專利出版物EP278787A1)存在如下主要問題(1)肽生產速度非常低，(2)肽產率低，(3)可生產的肽限于包含疏水性相對高的氨基酸的肽，(4)酶的加入量非常大，和(5)需要源于霉菌、酵母或植物的相對昂貴的羧肽酶制劑。在反應4中，未見有使用酵母菌屬以外的細菌或酵母來源的酶的方法，且未見有生產丙氨酰谷氨酰胺和其它具有高親水性的肽的方法。在此背景下，需要開發一種生產這些肽的廉價的工業方法。
本發明的目的是提供不必通過復雜的合成方法即可容易地、高產率地和廉價地生成肽的新型酶。更具體地，本發明的目的是提供催化由羧基成分和胺成分的肽生成反應的新型酶，產生該酶的微生物，和采用該酶或微生物廉價地生產二肽的方法。
本發明人根據上述目的進行了大量研究，結果發現了來自新近發現的屬于穩桿菌屬等的細菌的，能有效生成肽的新型酶，并確定了該酶基因的序列，由此完成了本發明。
亦即，本發明如以下所述[1]編碼以下(A)或(B)所示蛋白質的DNA(A)具有由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(B)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(C)或(D)所示蛋白質的DNA(C)具有由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(D)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(E)或(F)所示蛋白質的DNA(E)具有由序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(F)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(G)或(H)所示蛋白質的DNA(G)具有由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(H)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(I)或(J)所示蛋白質的DNA(I)具有由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，
(J)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(K)或(L)所示蛋白質的DNA(K)具有由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(L)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(M)或(N)所示蛋白質的DNA(M)具有序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白質，(N)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO6中所示氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(O)或(P)所示蛋白質的DNA(O)具有序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白質，(P)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO12中所示氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(Q)或(R)所示蛋白質的DNA(Q)具有序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白質，(R)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO18中所示氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(S)或(T)所示蛋白質的DNA(S)具有序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的蛋白質，(T)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO23中所示氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(U)或(V)所示蛋白質的DNA(U)具有序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的蛋白質，(V)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO25中所示氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
編碼以下(W)或(X)所示蛋白質的DNA(W)具有序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的蛋白質，(X)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO27中所示氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列。
以下(a)或(b)所示的DNA(a)具有序列表中的SEQ ID NO5中所示堿基序列的127-1908位堿基的堿基序列的DNA，(b)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO5中所示堿基序列的127-1908位堿基組成的堿基序列互補。
以下(c)或(d)所示的DNA(c)具有序列表中的SEQ ID NO11中所示堿基序列的121-1917位堿基的堿基序列的DNA，(d)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO11中所示堿基序列的121-1917位堿基組成的堿基序列互補。
以下(e)或(f)所示的DNA(e)具有序列表中的SEQ ID NO17中所示堿基序列的127-1935位堿基的堿基序列的DNA，
(f)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO17中所示堿基序列的127-1935位堿基組成的堿基序列互補。
以下(g)或(h)所示的DNA(g)具有序列表中的SEQ ID NO22中所示堿基序列的127-1995位堿基的堿基序列的DNA，(h)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO12中所示堿基序列的127-1995位堿基組成的堿基序列互補。
以下(i)或(j)所示的DNA(i)具有序列表中的SEQ ID NO24中所示堿基序列的104-1888位堿基的堿基序列的DNA，(j)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO24中所示堿基序列的104-1888位堿基組成的堿基序列互補。
以下(k)或(l)所示的DNA(k)具有序列表中的SEQ ID NO26中所示堿基序列的112-1992位堿基的堿基序列的DNA，(l)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO26中所示堿基序列的112-1992位堿基組成的堿基序列互補。
以下(m)或(n)所示的DNA(m)具有序列表中的SEQ ID NO5中所示堿基序列的61-1908位堿基的堿基序列的DNA，(n)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO5中所示堿基序列的61-1908位堿基組成的堿基序列互補。
以下(o)或(p)所示的DNA(o)具有序列表中的SEQ ID NO11中所示堿基序列的61-1917位堿基的堿基序列的DNA，(p)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO11中所示堿基序列的61-1917位堿基組成的堿基序列互補。
以下(q)或(r)所示的DNA(q)具有序列表中的SEQ ID NO17中所示堿基序列的61-1935位堿基的堿基序列的DNA，(r)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO17中所示堿基序列的61-1935位堿基組成的堿基序列互補。
以下(s)或(t)所示的DNA(s)具有序列表中的SEQ ID NO22中所示堿基序列的127-1995位堿基序列的DNA，(t)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO22中所示堿基序列的127-1995位堿基組成的堿基序列互補。
以下(u)或(v)所示的DNA(u)具有序列表中的SEQ ID NO24中所示堿基序列的29-1888位堿基序列的DNA，(v)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO24中所示堿基序列的29-1888位堿基組成的堿基序列互補。
以下(w)或(x)所示的DNA(w)具有序列表中的SEQ ID NO26中所示堿基序列的61-1992位堿基序列的DNA，(x)在嚴緊條件下，與具有下述堿基序列的DNA雜交并編碼包含成熟蛋白質區且具有肽生成活性的蛋白質的DNA，所述堿基序列與由序列表中的SEQ ID NO26中所示堿基序列的61-1992位堿基組成的堿基序列互補。
根據[13]-[24]任一項的DNA，其中嚴緊條件是在相當于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下，于60℃進行洗滌的條件。
一種包含根據[1]-[25]任一項的DNA的重組DNA。
一種導入了根據[26]的重組DNA的轉化細胞。
一種生產肽生成酶的方法，包括在培養基中培養根據[27]的轉化細胞，使肽生成酶在培養基和/或轉化細胞中累積。
一種生產二肽的方法，包括在培養基中培養根據[28]的轉化細胞以獲得培養物，將該培養物與羧基成分和胺成分混合以合成二肽。
一種生產二肽的方法，包括通過使用屬于鞘氨醇桿菌屬并具有由羧基成分和胺成分生成二肽的活性的微生物的培養物，從該培養物中分離的微生物細胞，該微生物的微生物細胞處理產物或源于該微生物的肽生成酶，由羧基成分和胺成分生成二肽。
此外，SEQ ID NO6中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO5中所述DNA確定。SEQ ID NO12中所示氨基酸序列由序列表中的SEQID NO11中所述DNA確定。SEQ ID NO18中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO17中所述DNA確定。SEQ ID NO23中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO22中所述DNA確定。SEQ ID NO25中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO24中所述DNA確定。SEQ ID NO27中所示氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO26中所述DNA確定。
附圖簡述

圖1是舉例說明本發明的穩桿菌的酶的最適pH的圖；圖2是舉例說明本發明的穩桿菌的酶的最適溫度的圖；圖3是舉例說明由L-丙氨酸甲酯和L-谷氨酰胺制備L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的時程圖；和圖4是舉例說明胞質部分(Cy)和周質部分(Pe)中存在的酶量的條形圖。
發明的最佳實施方案以下為本發明的新型二肽生成酶基因和該基因的產物二肽生成酶。
(1)含有本發明的DNA的微生物本發明的DNA編碼具有由羧基成分和胺成分生成肽的活性的蛋白質。在本說明書中，羧基成分是指提供肽鍵(-CONH-)中羰基位點(CO)的成分，而胺成分是指提供肽鍵中氨基位點(NH)的成分。此外，在本說明書中，除非另有特指，術語“肽”在單獨使用時是指具有至少一個肽鍵的多聚體。此外，在本說明書中，“二肽”是指具有一個肽鍵的肽。
含有本發明的DNA的微生物的實例包括屬于穩桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、土地桿菌(Pedobacter)屬、整形桿菌屬、圓桿菌屬或Psycloserpens屬的細菌，而其更具體的實例包括短穩桿菌菌株ATCC14234(菌株FERM P-18545、菌株FERM BP-8113)、鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124、解肝磷脂土地桿菌(Pedobacter heparinus)菌株IFO 12017、Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116、海圓桿菌菌株ATCC 25205和Psycloserpens burtonensis菌株ATCC700359。短穩桿菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545、菌株FERMBP-8113)、鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124、解肝磷脂土地桿菌菌株IFO 12017、Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116、海圓桿菌菌株ATCC 25205和Psycloserpens burtonensis菌株ATCC700359是本發明人經研究而選擇的能高產量地由羧基成分和胺成分生成肽的微生物。
上述微生物菌株中，以FERM號表示的微生物已被保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并可參照各號而獲得。
上述微生物菌株中，以ATCC號表示的微生物已被保藏于美國典型培養物保藏中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)，并可參照各號而獲得。
上述微生物菌株中，以IFO號表示的微生物已被保藏于發酵研究所，Osaka(2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)，并可參照各號而獲得。
上述微生物菌株中，以NBRC號表示的微生物已被保藏于日本國立技術與評價研究所生物資源中心(NITE)(5-8 Kazusa-Kamaashi2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，Japan)，并可參照各號而獲得。
上述微生物菌株中，以DSMZ號表示的微生物已被保藏于DeutcheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)(Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)，并可參照各號而獲得。
短穩桿菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545，菌株FERM BP-8113)已于2001年10月1日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并指定其保藏號為FERM P-18545。隨后，依據布達佩斯條約的規定，于2002年7月8日將該菌株的轉移至獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，并指定其保藏號為FERM BP-8113(微生物表現短穩桿菌菌株AJ 13933)。
鞘氨醇桿菌sp.菌株AJ 110003已于2002年7月22日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，并指定其保藏號為FERM BP-8124。通過下述鑒定試驗，將菌株AJ 110003(FERM BP-8124)鑒定為上述鞘氨醇桿菌sp.。菌株FERM BP-8124是革蘭氏陰性桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)，不生成芽孢，無運動性。其菌落為圓形，邊緣完全光滑，包含低突起，有光澤，淺黃色。該生物體在30℃生長，過氧化物酶陽性，氧化酶陽性，OF試驗(葡萄糖)陰性，根據這些特征而將其鑒定為屬于鞘氨醇桿菌屬的細菌。此外，因為如下特性硝酸鹽還原陰性、吲哚產生陰性、來源于葡萄糖的酸產物陰性、精氨酸二水解酶陰性、脲酶陽性、七葉苷水解陽性、明膠水解陰性、β-半乳糖苷酶陽性、葡萄糖同化陽性、L-阿拉伯糖同化陰性、D-甘露糖同化陽性、D-甘露醇同化陰性、N-乙酰-D-葡萄糖胺同化陽性、麥芽糖同化陽性、葡萄糖酸鉀陰性、正癸酸同化陰性、已二酸同化陰性、dl-蘋果酸同化陰性、枸櫞酸鈉同化陰性、苯乙酸同化陰性和細胞色素氧化酶陽性，可確定其具有與多食鞘氨醇桿菌或食神鞘氨醇桿菌相似的特性。此外，雖然16S rRNA基因的堿基序列的同源性分析結果顯示其具有與多食鞘氨醇桿菌高度的同源性(98.8％)，但沒有與該細菌菌株完全匹配的細菌菌株。因此，該細菌菌株可被鑒定為鞘氨醇桿菌sp。
(2)微生物培養為了得到含有本發明的DNA的微生物的微生物細胞，可將該微生物在適宜的培養基上培養和生長。對用于該目的的培養基無特別限制，只要能使該微生物生長即可。該培養基可以是含有普通的碳源、氮源、磷源、硫源、無機離子、以及根據需要的有機營養源的普通培養基。
例如，只要可被上述微生物利用，可使用任何碳源。可使用的碳源的具體實例包括糖諸如葡萄糖、果糖、麥芽糖和直鏈淀粉，醇諸如山梨糖醇、乙醇和甘油，有機酸諸如富馬酸、檸檬酸、乙酸和丙酸及其鹽，諸如石蠟的碳氫化合物以及它們的混合物。
可使用的氮源的實例包括諸如硫酸銨和氯化銨的無機酸的銨鹽，諸如富馬酸銨和檸檬酸銨的有機酸的銨鹽，諸如硝酸鈉和硝酸鉀的硝酸鹽，諸如胨、酵母提取物、肉提取物和玉米漿的有機氮化合物以及它們的混合物。
此外，還可將用于普通培養基的諸如無機鹽、微量金屬鹽和維生素的營養源適當地混合使用。
在培養條件上也沒有特別的限制，例如，可在好氣條件下，使pH和溫度適當地控制在pH為5-8的范圍，溫度為15-40℃的范圍內，培養約12-約48小時。
酶的純化本發明的DNA編碼肽生成酶。例如，該肽生成酶可從屬于穩桿菌屬的細菌中純化。從短穩桿菌中分離和純化肽生成酶的方法將作為純化酶的實例進行描述。
首先，通過采用物理方法諸如超聲破碎或使用溶細胞壁性酶的酶法破碎細胞以及通過離心等方法除去不溶部分，從而從短穩桿菌，例如菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的微生物細胞中制備微生物細胞提取物。然后通過聯合普通的蛋白質純化方法諸如陰離子交換層析、陽離子交換層析或凝膠過濾層析，經過對獲自上述方法的微生物細胞提取物溶液進行分餾來純化肽生成酶。
用作陰離子交換層析的載體的實例是Q-Sepharose HP(Amersham生產)。當將包含酶的細胞提取物經過填充了載體的柱時，在pH 8.5的條件下可從非吸附部分中回收酶。
用作陽離子交換層析的載體的實例是MonoS HR(Amersham生產)。在通過將包含酶的細胞提取物經過填充了載體的柱從而使酶吸附在柱上以及隨后洗滌柱之后，用具有高鹽濃度的緩沖溶液洗脫酶。此時，可連續增加鹽濃度或可采用濃度梯度。例如，在使用MonoS HR的情況下，用約0.2-約0.5M的NaCl洗脫吸附在柱上的酶。
然后可將用上述方法純化的酶進一步通過凝膠過濾層析等進行均勻純化。用于凝膠過濾層析的載體的實例是Sephadex 200pg(Amersham生產)。
在上述純化方法中，可根據下述實施例所描述的方法，通過檢測各部分的肽生成活性，從而確認包含酶的部分。序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中顯示了用上述方法純化的酶的內部氨基酸序列。
(4)本發明的DNA和轉化體(4-1)本發明的DNA從短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)中，分離出具有在SEQ ID NO5中所述61-1908位堿基的堿基序列的本發明的DNA。含有SEQ ID NO5中所述61-1908位堿基的DNA是編碼區序列(以下稱為“CDS”)部分。61-1908位堿基的堿基序列包含信號序列區和成熟蛋白質區。信號序列區由61-126位堿基組成，而成熟蛋白質區由127-1908位堿基組成。亦即，本發明提供了包含信號序列的肽酶蛋白質基因，和成熟蛋白質形式的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO5中所述序列中包含的信號序列是一種前導序列類型，推測該前導序列所編碼的前導肽的主要功能是從細胞膜內側至細胞膜外側的分泌。由127-1908位堿基(即除前導肽以外的位點)所編碼的蛋白質是成熟蛋白質，推測其可表現高度的肽生成活性。
從鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)中，分離出具有SEQ ID NO11中所述61-1917位堿基的堿基序列的DNA，其也是本發明的DNA。具有由61-1917位堿基組成的堿基序列的DNA是編碼序列(CDS)部分。由61-1917位堿基組成的堿基序列包含信號序列區和成熟蛋白質區。信號序列區是61-120位堿基的區域，而成熟蛋白質區是121-1917位堿基的區域。亦即，本發明提供了包含信號序列的肽酶蛋白質基因，和成熟蛋白質形式的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO11中所述序列中包含的信號序列是前導序列類型。推測該前導序列所編碼的前導肽的主要功能是從細胞膜內側至細胞膜外側的分泌。由121-1917位堿基(即除前導肽以外的部分)所編碼的蛋白質是成熟蛋白質，推測其可表現高度的肽生成活性。
從解肝磷脂土地桿菌菌株IFO 12017(保藏機構發酵研究所，Osaka，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)中，分離出具有SEQ ID NO17所述61-1935位堿基的堿基序列的本發明的DNA。SEQ ID NO17中由所述61-1935位堿基組成的DNA是CDS部分。由61-1935位堿基組成的堿基序列中包含信號序列區和成熟蛋白質區。信號序列區由61-126位堿基組成，而成熟蛋白質區由127-1935位堿基組成。亦即，本發明提供了包含信號序列的肽酶蛋白質基因，和成熟蛋白質形式的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO17中所述序列中包含的信號序列是前導序列類型，推測該前導序列所編碼的前導肽的主要功能是從細胞膜內側至細胞膜外側的分泌。127-1935位堿基(即除前導肽以外的位點)所編碼的蛋白質是成熟蛋白質，推測其可表現高度的肽生成活性。
從Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig，Germany)中分離出具有SEQ ID NO22中所述61-1995位堿基的堿基序列的本發明的DNA。由SEQ ID NO22中所述61-1995位堿基組成的DNA是CDS部分。由61-1995位堿基的堿基序列中包含信號序列區和成熟蛋白質區。信號序列區由61-126位堿基組成，而成熟蛋白質區由127-1995位堿基組成。亦即，本發明提供了包含信號序列的肽酶蛋白質基因，和成熟蛋白質形式的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO22中所述序列中包含的信號序列是前導序列類型，推測該前導序列所編碼的前導肽的主要功能是從細胞膜內側至細胞膜外側的分泌。由127-1995位堿基(即除前導肽以外的位點)所編碼的蛋白質是成熟蛋白質，推測其可表現高度的肽生成活性。
從海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)中，分離出具有SEQ ID NO24中所述29-1888位堿基的堿基序列的本發明的DNA。由SEQ ID NO24中所述29-1888位堿基組成的DNA是CDS部分。含有29-1888位堿基的堿基序列中包含信號序列區和成熟蛋白質區。信號序列區由29-103位堿基組成，而成熟蛋白質區由104-1888位堿基組成的。亦即，本發明提供了包含信號序列的肽酶蛋白質基因，和成熟蛋白質形式的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO24所述序列中所包含的信號序列是前導序列類型，推測該前導序列所編碼的前導肽的主要功能是從細胞膜內側至細胞膜外側的分泌。由104-1888位堿基(即除前導肽以外的位點)所編碼的蛋白質是成熟蛋白質，推測其可表現高度的肽生成活性。
從Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)中，分離出具有SEQ ID NO26所述61-1992位堿基的堿基序列的本發明的DNA。由SEQ ID NO26中所述61-1992位堿基組成的DNA是CDS部分。含有61-1992位堿基的堿基序列中包含信號序列區和成熟蛋白質區。信號序列區由61-111位堿基，而成熟蛋白質區由112-1992位堿基組成。亦即，本發明提供了包含信號序列的肽酶蛋白質基因，和成熟蛋白質形式的肽酶蛋白質基因。SEQ ID NO26中所述序列中包含的信號序列是前導序列類型，推測該前導序列所編碼的前導肽的主要功能是從細胞膜內側至細胞膜外側的分泌。112-1992位堿基所編碼的蛋白質(即除前導肽以外的位點)是成熟蛋白質，推測其可表現高度的肽生成活性。
此外，根據諸如Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)的出版物中的描述，可實施下述多種基因重組技術。
本發明的DNA可通過聚合酶鏈式反應(以下稱為“PCR”)(參見PCR；White T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))或通過短穩桿菌、鞘氨醇桿菌sp.、解肝磷脂土地桿菌、Taxeobactergelupurpurascens、海圓桿菌或Psycloserpens burtonensis的染色體DNA或DNA文庫的雜交而獲得。PCR引物可根據基于按上述(3)節中所述進行純化的肽生成酶所確定的內部氨基酸序列進行設計。此外，因為本發明已經清楚地確定了肽生成酶基因的堿基序列(SEQ IDNO5、SEQ ID NO11、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24和SEQ ID NO26)，故可根據這些堿基序列設計用于雜交的引物或探針，還可采用探針分離該基因。如果將具有與5′非翻譯區和3′非翻譯區相應的序列的引物用作PCR引物，則可擴增本發明的酶的編碼區的全長。例如，在擴增包含SEQ ID NO5中所述前導序列和成熟蛋白質編碼區的區域時，具體來說，5′側引物的實例是具有SEQ ID NO5中61位堿基的上游區域的堿基序列的引物，而3′側引物的實例是具有與1908位堿基下游區域的堿基序列互補的序列的引物。
例如，可按常規方法采用Applied Biosystems生產的380B型DNA合成儀，通過phosphoamidite法(參見Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)合成引物。例如，可根據由提供方例如制造商所說明的方法，采用Gene Amp PCR System 9600(Perkin-Elmer生產)和TakaraLA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo生產)實施PCR反應。
無論是否包含前導序列，本發明的DNA中還包含與序列表中的SEQID NO5中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通過從編碼具有突變的本發明的酶的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴緊條件下與具有與序列表中的SEQ ID NO5中所述CDS互補的堿基序列的DNA雜交，或與從相同堿基序列制備的探針雜交，并編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA而獲得與本發明的DNA基本上同一的DNA。
無論是否包含前導序列，本發明的DNA中還包含與序列表中的SEQID NO11中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通過從編碼具有突變的本發明的酶的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴緊條件下與具有與序列表中的SEQ ID NO11中所述CDS互補的堿基序列的DNA雜交，或與從相同堿基序列制備的探針雜交，并編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA而獲得與本發明的DNA基本上同一的DNA。
無論是否包含前導序列，本發明的DNA中還包含與序列表中的SEQID NO17中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通過從編碼具有突變的本發明的酶的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴緊條件下與具有與序列表中的SEQ ID NO17中所述CDS互補的堿基序列的DNA雜交，或與從相同堿基序列制備的探針雜交，并編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA而獲得與本發明的DNA基本上同一的DNA無論是否包含前導序列，本發明的DNA中還包含與序列表中的SEQID NO22中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通過從編碼具有突變的本發明的酶的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴緊條件下與具有與序列表中的SEQ ID NO22中所述CDS互補的堿基序列的DNA雜交，或與從相同堿基序列制備的探針雜交，并編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA而獲得與本發明的DNA基本上同一的DNA。
無論是否包含前導序列，本發明的DNA中還包含與序列表中的SEQID NO24中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通過從編碼具有突變的本發明的酶的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴緊條件下與具有與序列表中的SEQ ID NO24中所述CDS互補的堿基序列的DNA雜交，或與從相同堿基序列制備的探針雜交，并編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA而獲得與本發明的DNA基本上同一的DNA。
無論是否包含前導序列，本發明的DNA中還包含與序列表中的SEQID NO26中所述CDS的DNA基本上同一的DNA。亦即，可通過從編碼具有突變的本發明的酶的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴緊條件下與具有與序列表中的SEQ ID NO26中所述CDS互補的堿基序列的DNA雜交，或與從相同堿基序列制備的探針雜交，并編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA而獲得與本發明的DNA基本上同一的DNA例如，可以按照已確定的方法，根據例如序列表中的SEQ ID NO5中所述的堿基序列來制備探針。此外，還可按照已確定的方法，實施通過使用探針來發現與探針雜交的DNA，從而用于分離靶DNA的方法。例如，DNA探針可通過擴增在質粒或噬菌體載體中克隆的堿基序列，用限制性酶剪切需要用作探針的堿基序列，然后提取所需堿基序列來制備。要剪切掉的部分可根據靶DNA進行調整。
此處所用的術語“在嚴緊條件下”是指在該條件下形成所謂的特異性雜交，而不形成非特異性雜交。用數值精確表示該條件是困難的。例如，這些條件可以是，同源性高的DNA(例如，50％或更高，優選80％或更高，更優選90％或更高)可彼此雜交且同源性比這些低的DNA不能彼此雜交的條件，或Southern雜交中洗滌的普通條件，其中雜交在與1×SSC和0.1％SDS，優選0.1×SSC和0.1％SDS相應的鹽濃度下，于60℃進行。雖然在所述條件下雜交的基因包括序列中特定位置上出現終止子或由于活性中心中的突變而喪失活性的那些基因，但可通過將其連接至商業上可獲得的表達載體，將其在適宜的宿主中表達，和采用下述方法檢測表達產物的酶活性從而將其很容易地除去。
但是，當堿基序列在上述嚴緊條件下雜交時，由該堿基序列編碼的蛋白質優選在50℃和pH 8的條件下，保留具有由作為保留的原始堿基序列所編碼的氨基酸序列的蛋白質的約一半或更高，優選80％或更高，更優選90％或更高的酶活性。例如，當說明如下情況，例如說明在嚴緊條件下與具有與SEQ ID NO5中所示堿基序列的127-1908位堿基的堿基序列互補的堿基序列的DNA雜交的堿基序列時，由該堿基序列編碼的蛋白質優選在50℃和pH 8的條件下，保留具有SEQ IDNO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質的約一半或更高，優選80％或更高，更優選90％或更高的酶活性。
序列表中的SEQ ID NO6中顯示了由序列表中的SEQ ID NO5所述CDS所編碼的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO12中顯示了由序列表中的SEQ ID NO11所述CDS所編碼的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO18中顯示了由序列表中的SEQ ID NO17所述CDS所編碼的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO23中顯示了由序列表中的SEQ ID NO22所述CDS所編碼的氨基酸序列。序列表中的SEQ IDNO25中顯示了由序列表中的SEQ ID NO24所述CDS所編碼的氨基酸序列。序列表中的SEQ ID NO27中顯示了由序列表中的SEQ ID NO26所述CDS所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO6中所述完整氨基酸序列包括前導肽和成熟蛋白質區，其中1-22位氨基酸殘基構成前導肽，而23-616位氨基酸殘基構成成熟蛋白質區。此外，SEQ ID NO11中所述完整氨基酸序列包括前導肽和成熟蛋白質區，其中1-20位氨基酸殘基構成前導肽，而21-619位氨基酸殘基構成成熟蛋白質區。
SEQ ID NO18中所述完整氨基酸序列包括前導肽和成熟蛋白質區，其中1-22位氨基酸殘基構成前導肽，而23-625位氨基酸殘基構成成熟蛋白質區。
SEQ ID NO23中所述的完整氨基酸序列包括前導肽和成熟蛋白質區，其中1-22位氨基酸殘基構成前導肽，而23-645位氨基酸殘基構成成熟蛋白質區。
SEQ ID NO25中所述的完整氨基酸序列包括前導肽和成熟蛋白質區，其中1-25位氨基酸殘基構成前導肽，而26-620位氨基酸殘基構成成熟蛋白質區。
SEQ ID NO27中所述的完整氨基酸序列包括前導肽和成熟蛋白質區，其中1-17位氨基酸殘基構成前導肽，而18-644位氨基酸殘基構成成熟蛋白質區。
本發明的DNA所編碼的蛋白質是其中成熟蛋白質具有肽生成活性的蛋白質，本發明的DNA中還包括編碼與具有序列表中的SEQ ID NO6、SEQ ID NO12、SEQ ID NO18、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25或SEQ ID NO27所示氨基酸序列的蛋白質基本上同一的蛋白質的DNA，無論其是否包含前導肽(注意，根據通用密碼子，堿基序列由氨基酸序列確定)。亦即，本發明提供了編碼以下(A)-(X)所示蛋白質的DNA(A)具有由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(B)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的23-616位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(C)具有由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(D)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的21-619位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(E)具有序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(F)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的23-625位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(G)具有由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(H)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的23-645位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(I)具有由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(J)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的26-620位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(K)具有由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸殘基組成的氨基酸序列的蛋白質，(L)具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在由序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的18-644位氨基酸殘基組成的氨基酸序列中置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(M)含有序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白質，(N)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO6中所示氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(O)具有序列表中的SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白質，
(P)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO12中所示氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(Q)具有序列表中的SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白質，(R)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO18中所示氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(S)具有序列表中的SEQ ID NO23所示氨基酸序列的蛋白質，(T)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO23中所示氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(U)具有序列表中的SEQ ID NO25所示氨基酸序列的蛋白質，(V)含有成熟蛋白質區，具有下述氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質，所述氨基酸序列包含在序列表中的SEQ ID NO25中所示氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列，(W)具有序列表中的SEQ ID NO27所示氨基酸序列的蛋白質，和(X)含有成熟蛋白質區，具有序列表中的SEQ ID NO27中所示氨基酸序列并具有肽生成活性的蛋白質。
此處，雖然術語“多個”的含義根據蛋白質的三維結構中氨基酸殘基的位置和類型而變化，但其范圍包括不會顯著損害三維結構和蛋白質活性的氨基酸殘基的個數，具體為2-50，優選為2-30，更優選為2-10。但是，在(B)、(D)、(F)、(H)、(J)、(L)、(N)、(P)、(R)、(T)、(V)或(X)的蛋白質的氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的氨基酸序列的情況下，蛋白質優選在50℃和pH 8的條件下，保留處于不包含突變的狀態下的蛋白質的約一半或更高，優選80％或更高，更優選90％或更高的酶活性。例如，對(B)的情況給出說明；當氨基酸序列(B)為在序列表中的SEQ ID NO6中所示氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸的情況下，該蛋白質優選在50℃和pH 8的條件下，保留具有序列表中的SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白質的約一半或更高，優選80％或更高，更優選90％或更高的酶活性。
類似上述(B)等所示的氨基酸突變可通過以下方法獲得，例如通過定點誘變法，使該酶基因的特定部位的氨基酸發生置換、缺失、插入、添加的堿基序列改變。此外，上述改變的DNA也可通過已知的誘變處理而得到。誘變處理是指，例如，用羥胺等在體外處理編碼該酶的DNA的方法，以及用通常用于人工誘變的誘變劑，諸如紫外線照射、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理包含編碼該酶的DNA的埃希氏桿菌屬細菌的方法。
此外，上述堿基的置換、缺失、插入、添加和/或倒位還包括天然存在的突變諸如由于微生物物種或菌株導致的差異。通過在適宜的細胞中表達具有所述突變的DNA和檢測表達產物的酶活性，可獲得編碼與序列表中的SEQ ID NO6或12中所述蛋白質基本上同一的蛋白質的DNA。
(4-2)轉化體的制備和肽生成酶的生產肽生成酶可通過將本發明的DNA導入適宜的宿主以及在該宿主中表達DNA來生產。
可用于表達由本發明的DNA所確定的蛋白質的宿主的實例包括多種原核細胞諸如屬于埃希氏菌屬諸如大腸桿菌，穩桿菌，鞘氨醇桿菌屬，黃桿菌屬和桿菌屬諸如枯草桿菌的細菌，以及多種真核諸如釀酒酵母，畢赤氏酵母和米曲霉。
用于將DNA導入宿主的重組DNA可通過將需要導入的DNA插入與要表達該DNA的宿主的類型相應的載體中來制備，以該方式由該DNA所編碼的蛋白質可被表達。在啟動子對短穩桿菌等的肽生成酶基因在宿主細胞中的功能是唯一的情況下，該啟動子可被用作表達本發明的DNA的啟動子。此外，可將在宿主細胞中起作用的另一啟動子與本發明的DNA連接，然后可按需要在該啟動子的控制下表達該DNA。
將重組DNA導入宿主細胞的轉化方法的實例包括D.M.Morrison的方法(參見Methods in Enzymology，68，326(1979))或通過用氯化鈣處理受體微生物細胞而增加DNA通透性的方法(參見Mandel，H.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。
在使用重組DNA技術大量生產蛋白質的情況下，將產生蛋白質的轉化體中的蛋白質結合以形成蛋白質包含體也是實施本發明的優選實施方式。該表達和生產方法的優勢包括保護靶蛋白質免受微生物細胞中存在的蛋白酶的消化，以及通過裂解微生物細胞，然后離心即可簡單而容易地純化靶蛋白質等。
以該方式獲得的蛋白質包含體用蛋白質變性劑溶解，通過活性再生步驟將溶解的蛋白質轉化為適當折疊的、生理活性蛋白質，所述活性再生步驟主要包括用蛋白質變性劑裂解蛋白質，然后除去變性劑。該過程具有很多實例，包括人白細胞介素-2的活性再生(參見日本專利特開昭S61-257931)。
為了從蛋白質包含體中獲得活性蛋白質，需要進行一系列操作，包括溶解和活性再生，該方法步驟要比直接制備活性蛋白質復雜得多。但是，在生產在微生物細胞中對微生物生長具有有害作用的大體積蛋白質的情況下，可通過在微生物細胞中累積以無活性蛋白質的包含體形式的蛋白質而抑制所述作用。
大量生產包含體形式的大體積靶蛋白質的方法的實例包括在強效啟動子的控制下獨立表達靶蛋白質的方法，以及靶蛋白質以與已知大體積表達的蛋白質的融合蛋白質的形式進行表達的方法。
以下，將以制備轉化的大腸桿菌和使用轉化的微生物來生產肽生成酶的方法為例更具體地解釋本發明。此外，在微生物諸如大腸桿菌中制備肽生成酶時，可摻入編碼前體蛋白質(包含前導序列)的DNA，或可摻入由不包含前導序列的成熟蛋白質區組成的DNA，且可根據要生產的酶的生產條件、形式、使用條件等選擇適于蛋白質編碼序列的DNA。
通常用于在大腸桿菌中生產異源蛋白質的啟動子可被用作表達編碼肽生成酶的DNA的啟動子。所述啟動子的實例包括T7啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、λ-噬菌體PR啟動子、PL啟動子和其它強啟動子。此外，可使用的載體的實例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。此外，還可以使用噬菌體DNA的載體。而且，可使用包含啟動子且能表達插入的DNA序列(包含可用的啟動子)的表達載體。
為了生產融合蛋白質包含體形式的肽生成酶，將編碼另一蛋白質(優選親水性肽)的基因連接至肽生成酶基因的上游或下游從而得到融合蛋白質基因。在該方式中，編碼另一蛋白質的基因可以是能增加累積的融合蛋白質的量，并增強融合蛋白質在變性和再生步驟后的溶解性的任何基因。所述基因的候選實例包括T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因、γ-干擾素基因、白細胞介素-2基因和凝乳酶原基因。
當這些基因與編碼肽生成酶的基因連接時，將全部基因連接以便使其密碼子的閱讀框一致。該基因可被連接至適宜的限制酶位點，或可以使用含有適宜序列的合成DNA。
此外，為了增加肽生成酶的產量，優選在某些情況下將終止子(轉錄終止序列)連接至融合蛋白質基因的下游。該終止子包括，例如，T7終止子，fd噬菌體終止子，T4終止子，四環素抗性基因終止子，和大腸桿菌trpA基因終止子。
在大腸桿菌中導入編碼肽生成酶或肽生成酶與其它蛋白質之間的融合蛋白質的基因的載體優選所謂多拷貝型載體，其實例包括具有源于ColE1的復制起點的的質粒，例如，基于pUC的質粒，以及基于pBR 322的質粒或其衍生物。此處所使用的“衍生物為是指通過堿基的置換、缺失、插入、添加和/或倒位而進行修飾的那些質粒。應當注意，此處所使用的修飾包括通過用誘變劑或UV照射的誘變處理的修飾，或通過自發突變的修飾。
為篩選轉化體，載體優選含有諸如氨芐西林抗性基因的標記物。所述質粒包括可商業獲得的含有有效啟動子的表達載體(基于pUC的載體(Takara Shuzo公司生產)，基于pRROK的載體(ClonetechLaboratories公司生產)，pKK233-2(Clonetech Laboratories公司生產)等。
通過將DNA片段連接至載體DNA獲得重組DNA；在所述DNA片段中，以下述順序連接啟動子，編碼L-氨基酸酰胺水解酶或包含L-氨基酸酰胺水解酶與另一蛋白質的融合蛋白質的基因(根據情況)，終止子。
當用重組DNA轉化大腸桿菌然后培養所得大腸桿菌時，肽生成酶或包含肽生成酶和另一蛋白質的融合蛋白質得以表達并生產。雖然通常用于表達異源基因的菌株可被用作轉化宿主，但優選，例如大腸桿菌菌株JM109。實施轉化的方法和用于篩選出轉化體的方法描述于Molecular Cloning，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press(1989)和其它出版物中。
在表達融合蛋白質形式的肽生成酶時，可使用以肽生成酶，諸如凝血因子Xa或激肽釋放酶中不存在的序列作為識別序列的限制性蛋白酶來裂解肽生成酶。
可將通常用于培養大腸桿菌的培養基，諸如M9-酪蛋白氨基酸培養基或LB培養基，用作生產培養基。此外，根據所用載體的標記物、啟動子、宿主微生物類型等來選擇適宜的培養條件和生產誘導條件。
可將下述方法用于回收肽生成酶和包含肽生成酶與另一蛋白質的融合蛋白質。如果該肽生成酶或其融合蛋白質在微生物細胞中已被溶解，則回收該微生物細胞，然后將其破碎或裂解以便將其用作粗酶液。而且，使用前可按需通過普通技術諸如沉淀、過濾或柱色譜法對該肽生成酶或其融合蛋白質進行純化。此時，還可使用采用肽生成酶或其融合蛋白質的抗體的純化方法。
在形成蛋白質包含體的情況下，用變性劑溶解該包含體。雖然其可與微生物細胞蛋白質一起溶解，但考慮到隨后的純化步驟，故優選取出包含體然后溶解。可采用常規的已知方法從微生物細胞中回收包含體。例如，可通過裂解微生物細胞然后離心從而回收包含體。能夠溶解包含體的變性劑的實例包括鹽酸胍(例如，6M，pH 5-8)和脲(例如，8M)等。
具有活性的蛋白質通過透析等除去這些變性劑而得以再生。Tris-HCl緩沖液，磷酸緩沖溶液等可被用作透析中所用的透析液，其濃度可以是，例如，20mM-0.5M，而其pH可以是，例如，5-8。
再生步驟期間的蛋白質濃度優選被保持在約500μg/ml或更低。透析溫度優選為5℃或更低以便防止再生的肽生成酶發生自交聯。此外，除了透析外，除去變性劑的方法包括稀釋或超濾，并預期無論使用何種變性劑活性均可被再生。
(5)本發明的DNA所編碼的酶的特性例如，可通過使酶在包含氨基酸酯和胺作為底物的硼酸鹽緩沖液中反應，然后定量生成的肽來檢測本發明的DNA所編碼的酶的活性。在更具體的實施例中，采用包含100mM L-丙氨酸甲酯和200mML-谷氨酰胺的硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)，在25℃實施反應若干分鐘。
本發明中所用酶的活性單位的定義是，1單位(U)是在使用包含100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0)，25℃的反應條件下，1分鐘內產生1微摩爾(μmole)肽的酶量。
本發明的DNA所編碼的蛋白質是肽生成酶蛋白質。肽生成活性是指由羧基成分和胺成分生成肽的活性。以下，將描述本發明的DNA所編碼的酶的優選實施方式的特性。
本發明的DNA所編碼的酶的一種優選實施方式包括具有下述活性的酶，二肽生產率用作其指示物。亦即，本發明的酶的一種優選實施方式包括具有由羧基成分和胺成分生成肽的活性，且在以下(i)-(iv)的條件下，在二肽生成反應中，具有優選為0.03mM/min或更高，更優選0.3mM/分鐘或更高，特別優選1.0mM/min或更高的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生產率的酶。二肽生成反應的條件如下(i)羧基成分是L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(100mM)；(ii)胺成分是L-谷氨酰胺(200mM)；(iii)pH為9.0；和，(iv)按照蛋白質量，均勻純化的酶的加入量低于0.61mg/ml。
上述生產率遠高于使用酶合成肽的常規生產率，本發明的酶具有催化肽以非常快的速度合成的能力。
酶的上述加入量指示加入反應系統的酶的最終量，按所需酶蛋白質量，酶加入量為0.01mg/ml或更高，優選0.02mg/ml或更高。術語“蛋白質量”是指通過采用蛋白質測定CBB溶液(Nakarai生產)和牛血清白蛋白作為標準物質，由考馬斯亮藍比色法所顯示的值。
在測定酶活性的方法的具體實例中，可通過使酶在包含氨基酸酯和胺作為底物的硼酸鹽緩沖液中反應，以及定量得到的肽來檢測酶活性。在更具體的實例中，方法包括使用包含100mM L-丙氨酸甲酯和200mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)，于25℃使酶反應若干分鐘。
此外，本發明的DNA所編碼的酶的優選實施方式包括具有可將氨基酸酯和氨基酸酰胺均用作羧基成分的底物的能力的酶。詞語“將氨基酸酯和氨基酸酰胺均用作底物”是指至少一類或更多類氨基酸酯和至少一類或更多類氨基酸酰胺可被用作底物。此外，本發明的酶的一種優選實施方式具有將所有氨基酸、C保護的氨基酸和胺用作胺成分的底物的能力的酶。詞語“氨基酸、C保護的氨基酸和胺用作底物”是指至少一類或更多類氨基酸，至少一類或更多類C保護的氨基酸，和至少一類或更多類胺可被用作底物。由于具有羧基成分或胺成分的廣泛的底物特異性，本發明的酶是優選的，其中可選擇廣泛的原料，其依次利于工業生產中對費用和生產設備的需要。
羧基成分的具體實例包括L-氨基酸酯，D-氨基酸酯，L-氨基酸酰胺和D-氨基酸酰胺。此外，氨基酸酯不僅包括與天然存在的氨基酸相應的氨基酸酯，還包括與非天然存在的氨基酸或其衍生物相應的氨基酸酯。此外，氨基酸酯的實例包括α-氨基酸酯以及β-，γ-，和ω-氨基酸酯等，其具有不同的氨基結合位點。氨基酸酯的典型實例包括氨基酸的甲酯，乙酯，正丙酯，異丙酯，正丁酯，異丁酯和叔丁酯。
胺成分的具體實例包括L-氨基酸，C保護的L-氨基酸，D-氨基酸，C保護的D-氨基酸和胺。此外，胺的實例不僅包括天然存在的胺，還包括非天然存在的胺或其衍生物。此外，氨基酸的實例不僅包括天然存在的氨基酸，還包括非天然存在的氨基酸或其衍生物。其包括α-氨基酸以及β-，γ-，和ω-氨基酸等，其具有不同的氨基結合位點。
此外，另一方面，本發明的DNA所編碼的酶的一種優選實施方式包括催化肽生成反應的pH范圍為6.5-10.5的酶。優選能夠在上述寬泛的pH范圍內催化反應的本發明的酶，其能靈活地適應可能會出現多種限制的工業生產。但是在肽實際生成中，在使用酶時，優選進一步調整至與所得酶相應的最適pH以便將酶的催化作用最大化。
而且，另一方面，本發明的DNA所編碼的酶的一種優選實施方式包括催化肽生成反應的溫度范圍為0-60℃的酶。因為本發明的酶能夠在上述寬泛的溫度范圍內催化反應，故其是優選的，其能靈活地適應可能會出現多種限制的工業生產。但是在肽實際生成中，在使用酶時，優選進一步調整至與所得酶相應的最適溫度以便將酶的催化作用最大化。
(6)二肽生產方法本發明的二肽生產方法包括在存在上述酶時，羧基成分和胺成分之間的反應。本發明的二肽生產方法包括使具有由羧基成分和胺成分生成肽的能力的酶，或含酶物作用于羧基成分和胺成分從而合成二肽。
使本發明所用的酶或含酶物作用于羧基成分和胺成分的方法可以是彼此混合酶或含酶物，羧基成分和胺成分。更具體地，可以采用將酶或含酶物加入含有羧基成分和胺成分的溶液然后使其反應的方法。可選地，在使用產生該酶的微生物的情況下，可使用包括培養產生該酶的微生物，在微生物或微生物培養液中產生和累積酶，然后將羧基成分和胺成分加入培養液的方法。然后通過已確定的方法收集產生的二肽，并根據需要進行純化。
術語“含酶物”是指包含酶的任何物質，其具體形式的實例包括能產生酶的微生物的培養物，來自培養物的分離的微生物細胞，和通過處理微生物細胞得到的產物(下文稱為，“微生物細胞處理產物”)。微生物的培養物是指通過培養微生物所得到的，更具體地，是指微生物細胞，用于培養微生物的培養基，和由培養的微生物產生的物質等的混合物。此外，可洗滌微生物細胞，并以洗滌的微生物細胞的形式進行使用。此外，微生物細胞處理產物包括裂解、溶解或凍干的微生物細胞等，還包括通過處理微生物細胞而回收的粗酶等，以及通過純化粗酶得到的純化的酶等。通過多種純化方法得到的部分純化的酶可被用作純化的酶，或可使用已經通過共價結合方法、吸附法、包埋法等方法固定的固定化酶。此外，因為某些微生物在培養期間會發生部分裂解(依賴于所使用的微生物)，此時培養上清液也可被用作含酶物。
此外，野生菌株可被用作包含酶的微生物，或還可使用表達該酶的基因重組菌株。微生物不局限于完整微生物細胞，還可以使用丙酮處理的微生物細胞、冷凍干燥的微生物細胞或其它經處理的微生物細胞。還可以使用通過共價結合方法、吸附法、包埋法或其它方法固定微生物細胞和微生物細胞處理產物而得到的固定化微生物細胞和固定化微生物細胞處理產物，以及處理的固定化微生物細胞。
此外，當使用培養物、培養的微生物細胞、洗滌的微生物細胞或通過破碎或裂解微生物細胞而得到的微生物細胞處理產物時，其中通常會出現不參與肽生成的酶分解生成的肽。此時，某些情況下優選加入金屬蛋白酶抑制劑如乙二胺四乙酸(EDTA)。加入量為0.1毫摩爾(mM)-300mM，優選1mM-100mM。
本發明的二肽生產方法的優選實施方式是如下方法，在培養基中培養上述(4-2)所述的轉化細胞，使肽生成酶在培養基和/或轉化細胞中累積。由于通過使用轉化體可容易地大量產生肽生成酶，故可大量且快速地生產二肽。
如果酶或含酶物的使用量顯示出達到靶效應，則該量即為足夠的(有效量)，本領域普通技術人員通過簡單的預實驗即可容易地確定該有效量。例如，在使用酶的情況下，使用量為大約0.01U-約100U，而在使用洗滌的微生物細胞的情況下，使用量為大約1g/L-約500g/L。
任何羧基成分均為可使用的，只要其能通過與胺成分形式的其它物質的縮合而生成肽即可。羧基成分的實例包括L-氨基酸酯，D-氨基酸酯，L-氨基酸酰胺和D-氨基酸酰胺以及不含氨基的有機酸酯。此外，氨基酸酯的實例不僅包括與天然存在的氨基酸相應的氨基酸酯，還包括與非天然存在的氨基酸或其衍生物相應的氨基酸酯。此外，氨基酸酯的實例包括α-氨基酸酯以及β-，γ-，和ω-氨基酸酯等，其具有不同的氨基結合位點。氨基酸酯的典型實例包括氨基酸的甲酯，乙酯，正丙酯，異丙酯，正丁酯，異丁酯和叔丁酯。
任何胺成分均為可使用的，只要其能通過與胺成分形式的其它物質的縮合而生成肽即可。胺成分的實例包括L-氨基酸，C保護的L-氨基酸，D-氨基酸，C保護的D-氨基酸和胺。此外，胺的實例不僅包括天然存在的胺，還包括非天然存在的胺或其衍生物。此外，氨基酸的實例不僅包括天然存在的氨基酸，還包括非天然存在的氨基酸或其衍生物。其包括α-氨基酸以及β-，γ-，和ω-氨基酸等，其具有不同的氨基結合位點。
用作原料的羧基成分和胺成分的濃度分別為1mM至10M，優選為0.05M至2M；但是，在某些情況下，優選以與羧基成分等摩爾或過量摩爾的量加入胺成分。此外，在高濃度的物質抑制反應的情況下，可在將其調整至不導致抑制的濃度后，在反應期間將其分步加入。
容許肽合成的反應溫度為0-60℃，優選5-40℃。此外，容許肽合成的反應pH為6.5-10.5，優選7.0-10.0。
實施例以下，通過實施例解釋本發明。但是，本發明并不限于這些實施例。除了用薄膜層析的茚三酮染色(定性)進行證實外，通過下述高效液相色譜法實施定量檢測以便測定產物。柱Inertsil ODS-2(GLScience公司生產)，洗脫液磷酸水溶液，其中包含5.0mM 1-辛烷磺酸鈉(pH 2.1)∶甲醇＝100∶15-50，流速1.0mL/分鐘，檢測210納米(以下稱為“nm”)。
(實施例1)微生物培養(短穩桿菌菌株FERM BP-8113)在500ml坂口氏瓶中，加入50mL每升(L)含有5克(g)葡萄糖、5g硫酸銨、1g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10g酵母提取物和10g胨的培養基(pH 6.2)，在115℃滅菌15分鐘。然后在該培養基上接種1鉑環已在含有同樣的培養基上，30℃培養了16小時的短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的細胞，然后在30℃，120往復/分鐘下震蕩培養16小時。
(實施例2)用微生物細胞生產肽對實施例1中得到的培養液離心(10,000轉/分鐘(rpm)，15分鐘)，收集微生物細胞，然后將其在含有10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中混懸至濃度為100g/L。在各1mL含有10mM EDTA、200mM下述羧基成分和400mM下述氨基酸的100mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0)中，分別加入1ml該懸浮液，使總量至2mL，在18℃反應2小時。表1中顯示了該反應結果所生成的肽。
表1

(對所有羧基成分均使用鹽酸鹽。)(實施例3)酶的純化離心后的步驟在冰上或4℃實施。按照與實施例1相同的方法培養短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)，通過離心(10,000rpm，15分鐘)收集微生物細胞。在用50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌16g微生物細胞后，將其懸浮在40毫升(ml或mL)相同緩沖液中，然后以195瓦特進行超聲裂解處理45分鐘。然后離心該超聲裂解液(10,000rpm，30分鐘)以除去細胞碎片，得到超聲裂解液上清。用50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)對該超聲裂解液上清透析過夜，然后通過超速離心(50,000rpm，30分鐘)除去不溶部分，從而得到上清液形式的可溶部分。將得到的可溶部分加入預先用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生產)中，然后從非吸附部分中收集活性部分。用50mM醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)對該活性部分透析過夜，然后通過離心(10,000rpm，30分鐘)除去不溶部分從而得到上清液形式的透析的部分。然后將該透析的部分加入預先用50mM醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的Mono S柱(Amersham生產)中，以含有0-1M NaCl的相同緩沖液的線性濃度梯度洗脫酶。將活性部分中含有最低水平污染蛋白質的部分加入預先用含有1M NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的Superdex 200pg柱(Amersham產)中，通過使含有1M NaCl的相同緩沖液(pH 4.5)流經柱來實施凝膠過濾，得到活性部分溶液。上述操作的結果證實了，根據電泳的實驗結果，本發明中所用的肽生成酶已被均勻地純化。上述純化步驟中的酶回收率為12.2％，純化度為707倍。
(實施例4)檢測酶的分子量(SDS-凝膠電泳)對通過實施例3的方法所得純化的酶部分的0.3微克(μg)等效物進行聚丙烯酰胺電泳。將0.3％(w/v)Tris，1.44％(w/v)甘氨酸和0.1％(w/v)月桂硫酸鈉用作電泳緩沖液，將具有10-20％凝膠濃度的濃度梯度的凝膠(Multigel 10-20，Daiichi Pure Chemicals生產)用作聚丙烯酰胺凝膠，將Pharmacia分子量標記物用作分子量標記物。電泳完成后，用考馬斯亮藍R-250對凝膠染色，在約75千道爾頓(kDa)的分子量位置發現均一條帶。
(凝膠過濾)將通過實施例3的方法所得純化的酶部分加入預先用含有1M NaCl的50mM醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的Superdex 200pg柱(Amersham產)中，通過使含有1M NaCl的相同緩沖液(pH 4.5)流經柱來實施凝膠過濾從而檢測分子量。將Pharmacia分子量標記物用作已知分子量的分子量標記物以制作校準曲線。結果，該酶的分子量為大約150kDa。
根據SDS-凝膠電泳和凝膠過濾的結果，提示該酶為具有約75kDa的分子量的同型二聚體。
(實施例5)酶反應的最適pH在由L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的反應中，檢測pH的影響。將醋酸鹽緩沖液(pH 3.9-5.4)，MES緩沖液(pH 5.4-6.4)，磷酸鹽緩沖液(pH 6.0-7.9)，硼酸鹽緩沖液(pH 7.8-9.3)，CAPS緩沖液(pH 9.3-10.7)，和K2HPO4-NaOH緩沖液(pH 10.8-11.6)用作緩沖液。將實施例3中得到的1微升(μl)Mono S酶部分(約180U/ml)加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的各緩沖液(100mM)中，使其在18℃反應5分鐘，檢測pH對反應的影響。圖1中顯示了通過將使用硼酸鹽緩沖液(pH 9.3)時的值定為100％來表示的結果。結果，發現最適pH為8-9.5。
(實施例6)酶反應的最適溫度在由L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的反應中，檢測溫度的影響。將1μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在各個溫度下反應5分鐘，檢測溫度對反應的影響。圖2中顯示了通過將在34℃下的活性值定為100％來表示的結果。結果，最適溫度為30-40℃。
(實施例7)酶抑制劑采用L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺作為底物，來檢測抑制劑對生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的影響。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入50μl含有10mM表2中所示的各個酶抑制劑的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應5分鐘。注意，在使用前，將鄰二氮雜菲，苯甲基磺酰氟和p-硝基苯基-p′-胍基苯甲酸酯溶于甲醇中，濃度為50mM。將不存在肽抑制劑時的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成值定為100，各條件下的酶活性以相對活性給出。結果如表2所示。結果，在所檢測的絲氨酸酶抑制劑中，酶未被苯甲基磺酰氟化物抑制，但其被p-硝基苯基-p′-胍基苯甲酸酯抑制。
表2

(實施例8)由L-丙氨酸甲酯和L-谷氨酰胺生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺將3μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在18℃反應。結果如圖3所示，在加入酶區中生成83mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)，副產物L-Ala-L-Ala-L-Gln的濃度為1.3mM。另一方面，在未加入酶區中幾乎未觀察到L-Ala-L-Gln的任何生成，而反應120分鐘后酶濃度僅為大約0.07mM。
(實施例9)L-谷氨酰胺濃度對生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的影響將1μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，表3中所示濃度的L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在18℃反應2小時。結果如表3所示。
表3

(實施例10)酶的底物特異性(1)在L-氨基酸酯用作羧基成分的情況下，檢測酯特異性。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表4所示的羧基成分，200mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應2小時。表4中顯示了該反應中L-Ala-L-Gln的生成量(表4中HCl代表鹽酸)。
表4

(實施例11)酶的底物特異性(2)在L-丙氨酸甲酯用作羧基成分和多種L-氨基酸用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，150mM表5所示L-氨基酸和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表5中顯示了該反應中多種肽的生成量。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量，而“tr”表示痕量)。
表5

(實施例12)酶的底物特異性(3)在多種L-氨基酸甲酯用作羧基成分和L-谷氨酰胺用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表6中所示的L-氨基酸甲酯鹽酸鹽(AA-OMe·HCl)，150mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表6中顯示了該反應中多種肽的生成量。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量，而“tr”表示痕量)。此外，在使用L-Trp-OMe和L-Tyr-Ome時，在反應系統中加入Tween-80至終濃度為0.1％。
表6

(對所有羧基成分均使用鹽酸鹽。)(實施例13)酶底物特異性(4)在多種L-氨基酸甲酯用作羧基成分和多種L-氨基酸用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表7中所示的L-氨基酸甲酯鹽酸鹽(AA-OMe·HCl)，150mM L-谷氨酰胺和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表7中顯示了該反應中所生成的各肽的生成量。(“tr”表示痕量)。此外，在使用L-Trp-OMe時，在反應系統中加入Tween-80至終濃度為0.1％。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量)。
表7

(對所有羧基成分均使用鹽酸鹽。)
(實施例14)酶底物特異性(5)在L或D型多種氨基酸甲酯用作羧基成分以及L或D型多種氨基酸用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表8中所示的L-氨基酸甲酯鹽酸鹽(AA-OMe·HCl)，150mM表8中所示的多種氨基酸和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表8中顯示了該反應中多種肽的生成量。(“tr”表示痕量)。
表8

(對所有羧基成分均使用鹽酸鹽。)
(實施例15)酶的底物特異性(6)在多種L-氨基酸酰胺用作羧基成分，和多種L-氨基酸用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表9中所示的L-氨基酸酰胺鹽酸鹽(AA-NH2·HCl)，150mM表9中所示的L-氨基酸和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表9中顯示了該反應中多種肽的生成量。
表9

(實施例16)酶的底物特異性(7)在多種L-丙氨酸甲酯用作羧基成分和C保護的L-氨基酸用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表10中所示的L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(Ala-OMe·HCl)，150mM表10中所示的L-氨基酸酰胺鹽酸鹽和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表10中顯示了該反應中多種肽的生成量。
表10

(實施例17)酶的底物特異性(8)在多種氨基酸甲酯用作羧基成分和甲胺用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表11中所示的L-氨基酸甲酯鹽酸鹽(AA-OMe·HCl)，150mM表11中所示的甲胺和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表11中顯示了該反應中多種肽的生成量。
表11

(實施例18)酶的底物特異性(9)在β-氨基酸酯用作羧基成分和β-氨基酸用作胺成分的情況下，檢測肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表12中所示的羧基成分，150mM表12中所示的胺成分和10mMEDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表12中顯示了該反應中多種肽的生成量。(“tr”表示痕量)。
表12

對所有羧基成分均使用鹽酸鹽。
(實施例19)酶的底物特異性(10)在L-氨基酸酯用作羧基成分和肽用作胺成分的情況下，檢測寡肽生成。將2μl與實施例5所用相同的酶部分加入100μl含有100mM表13中所示的羧基成分，150mM表13中所示的胺成分和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應3小時。表13中顯示了該反應中多種肽的生成量。結果清楚地顯示出本發明的酶不僅能生成二肽，還能通過將肽用作胺成分而生成長鏈肽。
如上述實施例9-20所示，由短穩桿菌菌株FERM BP-18545得到的本發明的酶被確定具有非常廣泛的底物特異性。
表13

(*由于L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala的溶解度低，故在該反應系統中使用的羧基成分的濃度為10mM，使用的胺成分的濃度為15mM。其它條件與上述實施例中所描述的相同。對所有羧基成分均使用鹽酸鹽)(實施例20)與已知酶比較催化肽生成的能力將本發明的酶與已知酶比較催化肽生成的能力。EP 278787A1中所述羧肽酶Y和EP 359399B1中所述巰基內肽酶(無花果蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶)被用作已知酶，其以純化的酶的形式進行使用(Sigma生產)。實施例3中均勻純化的酶被用作本發明的酶的來源。將這些酶以表14所示的蛋白質的量加入反應系統中。將酶加入100μl含有100mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和200mM L-谷氨酰胺的硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使所得物在25℃反應。注意，將所用的羧肽酶溶于含有1mM EDTA的10mM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)中，而將所用的巰基內肽酶溶于含有2mM EDTA，0.1M KCl和5mM二硫蘇糖醇的10mM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)中。表14中顯示了這些酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生產率的比值。
結果，即使在沒有酶的情況下也觀察到極痕量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生成，而與未加入酶的區相比，在加入羧肽酶或巰基內肽酶的區中觀測到生產率的輕微增加。相反，在加入本發明的酶的區中觀測到相對極高的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生產率，該生產率比羧肽酶Y和巰基內肽酶的生產率高大約5,000-100,000倍。如上所述，本發明的酶被證實具有與先前技術中已知的酶不同的極高的肽生產率。此外，本發明的酶是具有約75,000的分子量的二聚體。相反，羧肽酶Y的分子量已被報道為大約61,000，而巰基內肽酶的分子量已被報道為大約23,000-36,000。因此，如實施例所示，與羧肽酶Y和巰基內肽酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生產率相比，本發明的酶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生存率即使在生產率用每摩爾重量表示時也高于其以每單位重量表示時的情況。
表14

(實施例21)用鞘氨醇桿菌sp.的微生物細胞生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在500ml坂口氏瓶中，加入50mL每升(L)含有5g葡萄糖、5g硫酸銨、1g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10g酵母提取物和10g胨的培養基(pH 6.2)，在115 滅菌15分鐘用于培養鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)。然后在該培養基上接種1鉑環細胞的已在每升(L)含有5g葡萄糖、10g酵母提取物、10g胨和5g NaCl的斜面瓊脂培養基(瓊脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培養了24小時的鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)，然后在30℃，120往復/分鐘下震蕩培養20小時。然后將1ml該培養液加入上述培養基(50mL/500ml坂口氏瓶)，于30℃培養18小時。培養完成后，通過離心從培養液中分離微生物細胞，然后將其懸浮于含有10mM EDTA的0.1M硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，其濃度為100g/L，以濕微生物細胞計。然后在0.1ml該微生物細胞懸浮液中加入0.1ml含有10mM EDTA，200mM L-丙氨酰甲酯鹽酸鹽和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中。將0.2mL所得混合物在25℃反應120分鐘。此時產生的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的濃度為62mM。
(實施例22)來自鞘氨醇桿菌sp.的酶的純化離心后的以下步驟在冰上或4℃實施。按照與實施例21相同的方法培養鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)，通過離心(10,000rpm，15分鐘)收集微生物細胞。用20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)洗滌2g微生物細胞后，將其懸浮在8ml相同緩沖液中，然后以195W進行超聲裂解處理45分鐘。然后離心該超聲裂解液(10,000rpm，30分鐘)以除去細胞碎片，得到超聲裂解液上清。用20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)對該超聲裂解液上清透析過夜，然后通過超速離心(50,000rpm，30分鐘)除去不溶部分從而得到上清液形式的可溶部分。將得到的可溶部分加入預先用Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生產)中，從非吸附部分中收集活性部分。用20mM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)對該活性部分透析過夜，然后通過離心(10,000rpm，30分鐘)除去不溶部分從而得到上清液形式的透析的部分。將該透析的部分加入預先用20mM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)平衡的SP-Sepharose HP柱(Amersham生產)中，以含有0-1M NaCl的相同緩沖液的線性濃度梯度洗脫酶。
(實施例23)用酶部分生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺將10μl實施例22中純化的SP-Sepharose HP部分(約27U/ml)加入90μl含有111mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，222mM L-谷氨酰胺和11mMEDTA的的111mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應120分鐘。結果，在加入酶的區中生成73mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。另一方面，在未加入酶的區中幾乎未觀察到L-Ala-L-Gln的任何生成，而反應120分鐘后酶濃度僅為大約0.07mM。
(實施例24)酶的底物特異性(11)檢測源于鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)的酶的底物特異性。將100μl包含終濃度為100mM的表15-1至15-4所示多種羧基成分和終濃度為150mM的多種胺成分，實施例22中純化的SP-Sepharose HP酶部分(反應液中加入0.33單位)和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)在25℃反應1.5小時。表15中顯示了該反應中多種肽的生成量。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量，而“tr”表示痕量)。此外，在使用L-Tyr-Ome時，在反應系統中加入Tween-80至終濃度為0.1％。此外，對于所有羧基成分均使用鹽酸鹽。
表15-1

表15-2

表15-3

表15-4

對所有氨基酸酰胺均使用鹽酸鹽。
(實施例25)酶的底物特異性(12)檢測源于鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)的酶的關于寡肽生成的底物特異性。將100μl包含終濃度為100mM的多種羧基成分和終濃度為150mM的表16中所示的多種胺成分，實施例22中純化的SP-Sepharose HP酶部分(反應液中加入0.33單位)和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)在25℃反應1.5小時。表16中顯示了該反應中各寡肽的生成量。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量，而“tr”表示痕量)。此外，對于所有羧基成分均使用鹽酸鹽。
表16

(實施例26)酶的底物特異性(13)采用與實施例5所使用的相同的酶部分進一步評價底物特異性。
表17

將100μl包含以表17所示終濃度的各羧基成分和胺成分以及10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)的反應溶液在25℃反應表17所示的反應時間。表17中顯示了該反應中多種肽的生成量。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量，而“tr”表示痕量)。
(縮寫)H-Ala-OmeL-丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-p-F-Phe-Omep-氟-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-Cl-F-Phe-Omep-氯-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-p-NO2-Phe-Omep-硝基-L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-t-Leu-Ome叔-L-亮氨酸甲酯鹽酸鹽H-2-Nal-OMe3-(2-萘基)-L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-Aib-Omeα-氨基異丁酸甲酯鹽酸鹽H-N-Me-Ala-OMeN-甲基-L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-CHA-Omeβ-環己基-L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽H-Ser(tBu)-OmeO-叔丁基-L-絲氨酸甲酯鹽酸鹽H-Asp(OtBu)-OmeL-門冬氨酸β-叔丁基酯α-甲酯鹽酸鹽H-Lys(Boc)-OmeN-ε-叔-丁氧基羰基-L-賴氨酸甲酯鹽酸鹽H-p-F-Phe-OHp-氟-L-苯丙氨酸H-Cl-F-Phe-OHp-氯-L-苯丙氨酸H-p-NO2-Phe-OHp-硝基-L-苯丙氨酸H-t-Leu-OHtert-L-亮氨酸H-2-Nal-OH3-(2-萘基)-L-丙氨酸H-Gln-OHL-谷氨酰胺H-Phe-OHL-苯丙氨酸H-Ser(tBu)-OHO-叔丁基-L-絲氨酸H-Asp(OtBu)-OHL-門冬氨酸β-叔丁基酯H-Lys(Boc)-OHN-ε-叔-丁氧基羰基-L-賴氨酸(實施例27)酶的底物特異性(14)
采用與實施例5相同的酶部分(源于短穩桿菌)評估關于寡肽生成的底物特異性。將包含終濃度如表18中所示的各羧基成分和胺成分，酶(加入反應溶液中的單位數量如表18所示)和10mM EDTA的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)的l00μl反應溶液在25℃反應3小時。表18中顯示了該反應中多種寡肽的生成量。(標記“+”表示肽的生成得到證實但由于缺少標準而不能被定量，而“tr”表示痕量)。應當注意，對于所有羧基成分均使用鹽酸鹽。
表18

(實施例28)源于短穩桿菌的肽生成酶基因的分離以下，將描述了肽生成酶基因的分離。短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)被用作微生物。在基因的分離中，大腸桿菌JM-109被用作宿主，而pUC118被用作載體。
(1)根據確定的氨基酸序列制備PCR引物基于，根據Edman氏分解法由賴氨酰內肽酶消化源于短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的肽生成酶得到的賴氨酰內肽酶消化產物所確定的氨基酸序列(SEQ ID NOs1和2)，分別制備具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中所示堿基序列的混合引物。
(2)微生物細胞的制備將短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)在CM2G瓊脂培養基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化鈉和20g/l瓊脂，pH 7.0)上，于30℃培養24小時。在含有50ml CM2G液體培養基(除瓊脂以外的上述培養基)的500ml坂口氏瓶中接種1鉑環所得微生物細胞，然后在30℃振蕩培養。
(3)從微生物細胞中制備染色體DNA首先，將50mL培養液離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集微生物細胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根據其說明書中所述步驟，從微生物細胞中獲得染色體DNA。
(4)通過PCR制備含有肽生成酶基因的一部分的DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生產)，通過PCR方法，獲得含有源于短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs3和4的堿基序列的引物，對源于短穩桿菌菌株FERMBP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的染色體DNA進行PCR。
采用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(Takara Shuzo生產)，按下述條件實施30個循環的PCR反應。
94℃ 30秒52℃ 1分鐘72℃ 1分鐘反應后，用3μl反應液進行0.8％瓊脂糖電泳。結果，證實擴增的DNA片段為大約1.5千堿基(kb)。
(5)由基因文庫克隆肽生成酶基因為了獲得全長肽生成酶基因，采用在PCR步驟中擴增的DNA片段作為探針進行Southern雜交。Molecular Cloning，2nd edition，ColdSpring Harbor Press(1989)中描述了Southern雜交的步驟。
由PCR步驟擴增的大約1.5kb DNA片段通過0.8％瓊脂糖電泳進行分離。然后切下靶條帶，純化DNA片段。采用DI GHigh Prime(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟，用探針地高辛(digoxinigen)標記DNA片段。
在用限制性酶HindIII在37℃反應16小時而完全消化本實施例28(3)的步驟(3)中所獲得的短穩桿菌的染色體DNA后，將所得DNA在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳。電泳后，將電泳的染色體DNA從瓊脂糖凝膠上印跡在帶正電的尼龍濾膜(Roche Diagnostics生產)上，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于50℃，對濾器預雜交1小時后，加入按上述制備的用地高辛標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用含有0.1％SDS的2×SSC于室溫下洗滌濾器20分鐘。此外，再通過0.1×SSC，65℃，15分鐘，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟對與探針雜交的條帶進行檢測。結果，能夠檢測到與探針雜交的大約3kb的條帶。
然后，用HindIII完全消化本實施例28(3)的步驟(3)中制備的染色體DNA。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳，分離出大約4kb的DNA，然后采用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA，然后將DNA溶于10μl TE中。然后將4μl該產物與pUC118 HindIII/BAP(Takara Shuzo生產)混合，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo生產)進行連接反應。混合5μl連接反應混合物和100μl大腸桿菌JM109感受態細胞(Toyobo生產)從而轉化大腸桿菌。然后將由此得到的轉化體置于適宜的固體培養基上來產生染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽生成酶基因，采用上述探針，通過菌落雜交篩選染色體DNA文庫。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落雜交的步驟。
將染色體DNA文庫的克隆轉至尼龍濾膜(用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜，(Roche Diagnostics生產))，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入上述用地高辛標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用含有0.1％SDS的2×SSC于室溫下洗滌濾器20分鐘。此外，再通過0.1×SSC，65℃，15分鐘，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所描述的解釋，對與標記的探針雜交的克隆進行檢測。結果證實有兩個克隆與標記的探針雜交。
(6)源于短穩桿菌的肽生成酶基因的堿基序列大腸桿菌JM109所含有的質粒由上述被證實與標記的探針雜交的兩個克隆通過采用Wizard Plus Minipreps DNA純化系統(Promega生產)制備，確定與探針發生雜交的部分和鄰近部分的堿基序列。采用CEQ DTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟實施測序反應。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生產)實施電泳。
結果證實，編碼包含肽生成酶的內部氨基酸序列(SEQ ID NOs1和2)的蛋白質的開放讀碼框確實存在。因此，開放讀碼框被確認為編碼肽生成酶的基因。SEQ ID NO5中顯示了全長肽生成酶基因的堿基序列以及相應的氨基酸序列。用BLASTP對所得開放讀碼框的同源性分析的結果顯示，兩種酶之間存在同源性；其顯示出在氨基酸序列水平上與巴氏醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)的α-氨基酸酯水解酶具有34％的同源性(參見Appl.Environ.Microbiol.，68(1)，211-218(2002))，以及在氨基酸序列水平上與側孢短小芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporum)的戊二酰-7ACA酰基轉移酶具有26％的同源性(參見J.Bacteriol.，173(24)，7848-7855(1991))。
(實施例29)源于短穩桿菌的肽生成酶基因在大腸桿菌中的表達用SEQ ID NOs7和8中所述寡核苷酸作為引物，通過實施PCR來擴增大腸桿菌W3110的染色體DNA上色氨酸操縱子的啟動子區上的靶基因區，將所得DNA片段連接至pGEM-Teasy載體(Promega生產)。然后在該連接液中轉化大腸桿菌JM109，從氨芐西林抗性株中選擇含有靶質粒的菌株，所述靶質粒中插入的trp啟動子的插入方向與lac啟動子的方向相反。然后，將通過用EcoO109I/EcoRI處理該質粒而得到的包含trp啟動子的DNA片段與pUC19的EcoO109I/EcoRI處理產物(Takara生產)連接。然后用該連接液轉化大腸桿菌JM109，從氨芐西林抗性株中選擇含有靶質粒的菌株。然后，將用HindIII/PvuII處理該質粒而得到的DNA片段與用HindIII/HincII處理pKK223-3(Amersham Pharmacia生產)而得到的包含rrnB終止子的DNA片段相連接。然后用該連接液轉化大腸桿菌JM109，從氨芐西林抗性菌株中選擇含有靶質粒的菌株，將該質粒命名為pTrpT。
使用短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo No ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的染色體DNA作為模板，SEQ IDNO9和10中所示的寡核苷酸作為引物，通過PCR擴增靶基因。然后用NdeI/PstI處理該DNA片段，然后將所得DNA片段與pTrpT的NdeI/PstI處理產物連接。然后用該連接液轉化大腸桿菌JM109，從氨芐西林抗性菌株中選擇含有靶質粒的菌株，將該質粒命名為pTrpT_Gtg2。
將含有pTrpT_Gtg2的大腸桿菌JM109在含有100mg/l氨芐西林的LB培養基中，于30℃預培養24小時。將1ml所得培養液接種在含有50ml培養基(2g/l D葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸銨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂，和100mg/l氨芐西林)的500ml坂口氏瓶中，然后在25℃培養24小時。培養液的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性為0.44U/1ml培養液，證實大腸桿菌表達克隆的基因。此外，在作為對照的僅導入pTrpT的轉化體中未發現活性。
(預測信號序列)當用Signal Pv1.1程序分析序列表中所述SEQ ID NO6的氨基酸序列時(參見Protein Engineering，Vol.12，No.1，pp.3-9，1999)，預測1-22位氨基酸發揮將肽分泌至周質中的信號功能，而估計成熟蛋白質位于23位氨基酸的下游。
(分泌的驗證)
含有pTrpT_Gtg2的大腸桿菌JM109在含有100mg/l氨芐西林的LB培養基中，于30℃預培養24小時。將1ml所得培養液接種在含有50ml培養基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸銨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂，和100mg/l氨芐西林)的500ml坂口氏瓶中，然后在25℃最終培養24小時以獲得微生物細胞。
在用20克/分升(g/dl)蔗糖溶液，通過滲透壓沖擊法裂解細胞后，將培養的微生物細胞分為周質部分和胞質部分。將浸入20g/dl蔗糖溶液中的裂解的微生物細胞浸入5mM MgSO4水溶液中。將離心的上清命名為周質部分(“Pe”)。此外，將離心的沉淀物重懸，然后進行超聲裂解。將該生成物命名為胞質部分(“Cy”)。將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(已知存在于胞質中)的活性用作證實胞質已被分開的指示物。通過，在包含1mM葡萄糖-6-磷酸，0.4mM NADP，10mM MgSO4，和50mMTris-Cl(pH 8)的反應液中加入適量的酶，在30℃下進行該檢測，然后檢測340nm吸光度從而檢測NADPH的生成。
圖4顯示了當將分離制備的無細胞提取物的活性值定為100％時，周質部分和胞質部分中酶的量。在周質中未發現葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。這提示周質部分未混入胞質部分中。在周質中恢復了大約60％的Ala-Gln生成活性，正如采用Signal Pv1.1程序從氨基酸序列所預測出的，Ala-Gln生成酶被證實分泌至周質中。
(實施例30)用鞘氨醇桿菌sp.的微生物細胞生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在500ml坂口氏瓶中，加入50mL每升(L)含有5g葡萄糖、5g硫酸銨、1g磷酸二氫鉀、3g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10g酵母提取物和10g胨的培養基(pH 6.2)，在115℃滅菌15分鐘用以培養鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)。然后在該培養基上接種1鉑環已在每升(L)含有5g葡萄糖、10g酵母提取物、10g胨和5g NaCl的斜面瓊脂培養基(瓊脂20g/L，pH 7.0)上，30℃培養了24小時的鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)的細胞，然后在30℃，120往復/分鐘下震蕩培養20小時。然后將1ml該培養液加入上述培養基(50mL/500ml坂口氏瓶)中，于30℃培養18小時。培養完成后，通過離心從培養液中分離微生物細胞，然后將其懸浮于含有10mM EDTA的0.1M硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，濃度為100g/L，以濕微生物細胞計。然后在0.1ml該微生物細胞懸浮液中加入0.1ml含有10mM EDTA、200mM L-丙氨酰甲酯鹽酸鹽和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)。將0.2mL所得混合物在25℃反應120分鐘。此時產生的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的濃度為62mM。
(實施例31)來自鞘氨醇桿菌sp.的酶的純化離心后的以下步驟在冰上或4℃實施。按照與實施例21相同的方法培養鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)，通過離心(10,000rpm，15分鐘)收集微生物細胞。在用20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)洗滌2g微生物細胞后，將其懸浮在8ml相同緩沖液中，然后以195W進行超聲裂解處理45分鐘。然后離心該超聲裂解液(10,000rpm，30分鐘)以除去細胞碎片，得到超聲裂解液上清。用20mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)對該超聲裂解液上清透析過夜，然后通過超速離心(50,000rpm，30分鐘)除去不溶部分，從而得到上清液形式的可溶部分。將得到的可溶部分加入預先用Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)平衡的Q-Sepharose HP柱(Amersham生產)中，然后從非吸附部分中收集活性部分。用20mM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)對該活性部分透析過夜，然后通過離心(10,000rpm，30分鐘)除去不溶部分，從而得到上清液形式的透析的部分。將該透析的部分加入預先用20mM醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)平衡的SP-Sepharose HP柱(Amersham生產)中，用含有0-1M NaCl的相同緩沖液的線性濃度梯度洗脫酶。
(實施例32)用活性部分生產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺將10μl實施例31中純化的SP-Sepharose HP部分(約27U/ml)加入90μl含有111mM L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，222mM L-谷氨酰胺和11mMEDTA的的111mM硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，使其在25℃反應120分鐘。結果，在加入酶的區中生成73mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。另一方面，在未加入酶的區中幾乎未觀察到L-Ala-L-Gln的任何生成，而反應120分鐘后酶濃度僅為大約0.07mM。
(實施例33)源于鞘氨醇桿菌sp.的肽生成酶基因的分離下面描述了肽生成酶基因的分離，將鞘氨醇桿菌sp.菌株FERMBP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)用作微生物。采用大腸桿菌DH5α作為宿主，pUC118作為載體實施基因分離。
(1)微生物的制備將鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)在CM2G瓊脂培養基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化鈉和20g/l瓊脂，pH 7.0)上于25℃培養24小時。在含有50ml CM2G液體培養基(除瓊脂以外的上述培養基)的500ml坂口氏瓶中接種1鉑環所得微生物細胞，然后在25℃震蕩培養。
(2)從微生物細胞中制備染色體DNA對50ml培養液進行離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集微生物細胞。然后采用Qiagen Genomic-Tip System(Qiagen)從微生物細胞中獲得染色體DNA。
(3)通過PCR制備探針DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生產)，通過PCR方法得到包含源于短穩桿菌菌株FERM BP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的肽生成酶基因一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs3和4的堿基序列的引物，對獲自短穩桿菌菌株FERMBP-8113(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 1-Chome，Japan，國際保藏轉送日期2002年7月8日)的染色體DNA實施PCR反應。
采用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(Takara Shuzo生產)，按下述條件實施30個循環的PCR反應。
94℃ 30秒52℃ 1分鐘72℃ 1分鐘反應后，用3μl反應混合物進行0.8％瓊脂糖電泳。結果證實擴增的DNA片段為大約1.5kb。
(4)由基因文庫克隆肽生成酶基因為了獲得全長肽生成酶基因，采用在PCR步驟中擴增的DNA片段作為探針進行Southern雜交。Molecular Cloning，2nd edition，ColdSpring Harbor Press(1989)中描述了Southern雜交的步驟。
由PCR步驟擴增的大約1.5kb DNA片段通過0.8％瓊脂糖電泳進行分離。然后切下靶條帶，純化DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟，用探針地高辛標記DNA片段。
在用限制性酶SacI在37℃反應16小時而完全消化本實施例33的步驟(2)中所獲得的鞘氨醇桿菌sp.的染色體DNA后，對其進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將電泳的染色體DNA從瓊脂糖凝膠上印跡在帶正電的尼龍濾膜(Roche Diagnostics生產)上，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)進行雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入按上述制備的用地高辛標記的探針，于37℃雜交16小時。隨后，用含有0.1％SDS的2×SSC于室溫下洗滌濾器20分鐘。此外，再用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟對與探針雜交的條帶進行檢測。結果，能夠檢測到與探針雜交的大約3kb的條帶。
然后，用SacI完全消化本實施例33的步驟(2)中制備的染色體DNA。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離大約3kb的DNA，然后采用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA，然后將DNA溶于10μl TE中。然后將4μl該產物與SacI在37℃下，反應16小時，以便完全消化，將其與已用堿性磷酸酶(大腸桿菌C75)處理的pUC118混合，37℃，30分鐘和50℃，30分鐘，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo生產)進行連接反應。混合5μl該連接反應液和100μl大腸桿菌DH5α感受態細胞(Takara Shuzo生產)從而轉化大腸桿菌。然后將由此得到的轉化體置于適宜的固體培養基上來產生染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽生成酶基因，采用上述探針，通過菌落雜交篩選染色體DNA文庫。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落雜交的步驟。
將染色體DNA文庫的克隆轉至尼龍濾膜(用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜，(Roche Diagnostics生產))，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入上述用地高辛標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所描述的解釋，對與標記的探針雜交的克隆進行檢測。結果，證實有6株克隆與標記的探針雜交。
(5)源于鞘氨醇桿菌sp.的肽生成酶基因的堿基序列采用Wizard Plus Minipreps DNA純化系統(Promega生產)從已被證實與標記的探針雜交的上述六株微生物細胞中制備大腸桿菌DH5α所含有的質粒，從而確定與探針雜交的鄰近堿基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟實施測序反應。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生產)實施電泳。
結果，發現存在編碼肽生成酶的開放讀碼框。SEQ ID NO11中顯示了源于鞘氨醇桿菌sp.的全長肽生成酶基因的堿基序列以及相應的氨基酸序列。源于鞘氨醇桿菌sp.的肽生成酶在氨基酸序列水平上與源于上述短穩桿菌的肽生成酶具有63.5％的同源性(如BLASTP程序檢測所示)。
(實施例34)源于鞘氨醇桿菌sp.的肽生成酶基因在大腸桿菌的表達采用鞘氨醇桿菌sp.菌株FERM BP-8124(保藏機構獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心，保藏機構地址ChuoDai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，國際保藏日期2002年7月22日)的染色體DNA作為模板，SEQ ID NOs13和14中所述寡核苷酸作為引物實施PCR，擴增靶基因。用NdeI/XbaI處理該DNA片段，將得到的DNA片段與pTrpT的NdeI/XbaI處理產物連接。然后用該連接液轉化大腸桿菌JM109，從氨芐西林抗性株中選擇含有靶質粒的菌株，將該質粒命名為pTrpT_Sm_aet。
通過將一鉑環的菌株細胞接種在含有3ml培養基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸銨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂，和100mg/l氨芐西林)的普通試管中的方式，將含有pTrpT_Sm_aet的大腸桿菌JM109在25℃培養20小時。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性為2.1U/1ml培養液的克隆的基因被證實由大腸桿菌表達。此外，在作為對照的僅導入pTrpT的轉化體中未發現活性。
(預測信號序列)當用Signal P v 1.1程序分析序列表中所述SEQ ID NO12的氨基酸序列時(參見Protein Engineering，Vol.12，No.1，pp.3-9，1999)，預測1-20位氨基酸發揮將肽分泌至周質中的信號功能，而估計成熟蛋白質位于21位氨基酸的下游。
(信號序列的證實)通過將一鉑環的菌株細胞接種在含有50ml培養基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸銨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂，和100mg/l氨芐西林)的普通試管中的方式，將含有pTrpT_Sm_aet的大腸桿菌JM109在25℃培養20小時。
離心后的以下步驟在冰上或4℃實施。培養完成后，通過離心從培養液中分離微生物細胞，用100mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)洗滌后，將其懸浮于相同的緩沖液中。然后對該微生物細胞以195W進行超聲裂解處理20分鐘，然后離心該超聲裂解液(12,000rpm，30分鐘)以除去細胞碎片，得到可溶部分。將得到的可溶部分加入預先用100mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)平衡的CHT-II柱(Biorad生產)中，用500mM磷酸緩沖液以線性濃度梯度洗脫酶。將混合活性部分和5倍體積的2M硫酸銨以及100mM磷酸鹽緩沖液而得到的溶液，加入預先用2M硫酸銨和100mM磷酸緩沖液平衡的Resource-PHE柱(Amersham)中，用0-2M硫酸銨以線性濃度梯度洗脫酶，從而得到活性部分溶液。根據這些步驟的結果，證實了通過電泳的方式將肽生成酶均勻地純化。
當通過Edman氏分解法確定上述肽生成酶的氨基酸序列時，得到SEQ ID NO15的氨基酸序列，如通過Signal P v 1.1程序所預測的，成熟蛋白質被證實位于21位氨基酸的下游。
(實施例35)源于解肝磷脂土地桿菌IFO 12017的肽生成酶基因的分離以下，將描述肽生成酶基因的分離。所用微生物為解肝磷脂土地桿菌菌株IFO 12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)。在基因分離中，將大腸桿菌JM-109用作宿主，而將pUC118用作載體。
(1)微生物的制備將解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)在CM2G瓊脂培養基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化鈉和20g/l瓊脂，pH 7.0)上，于25℃培養24小時。在含有50ml CM2G液體培養基(除瓊脂以外的上述培養基)的500ml坂口氏瓶中接種1鉑環所得微生物細胞，然后在25℃震蕩培養。
(2)從微生物細胞中制備染色體DNA
將50mL培養液離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集微生物細胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根據其說明書中所述步驟，從微生物細胞中獲得染色體DNA。
(3)通過PCR制備探針DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生產)，通過PCR方法，獲得含有源于解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs15和16的堿基序列的引物，對獲自解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色體DNA進行PCR。由PCR擴增的大約1kb DNA片段通過0.8％瓊脂糖電泳進行分離。然后切下靶條帶，純化得到的DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟，用探針地高辛標記該DNA片段。
(4)由基因文庫克隆肽生成酶基因為了獲得全長肽生成酶基因，采用上述PCR步驟中擴增的DNA片段作為探針進行Southern雜交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern雜交的步驟。
通過用限制性酶HindIII于37℃反應16小時而完全消化解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色體DNA后，對其進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將電泳的染色體DNA從瓊脂糖凝膠上印跡在帶正電的尼龍濾膜(Roche Diagnostics生產)，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)進行雜交。于50℃，對濾器預雜交1小時后，加入按上述制備的用地高辛標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟對與探針雜交的條帶進行檢測。結果，能夠檢測到與探針雜交的大約5kb的條帶。
然后，用HindIII完全消化解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色體DNA。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離大約5kb的DNA，然后采用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA，然后將其溶于10μl TE中。然后將4μl該產物與pUC118 HindIII/BAP(Takara Shuzo生產)混合，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo生產)進行連接反應。混合5μl該連接反應液和100μl大腸桿菌JM109(Takara Shuzo生產)，從而轉化大腸桿菌。然后將由此得到的轉化體置于適宜的固體培養基上來產生染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽生成酶基因，采用上述探針，通過菌落雜交篩選染色體DNA文庫。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落雜交的步驟。
將染色體DNA文庫的克隆轉至尼龍濾膜(用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜，(Roche Diagnostics生產))，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入上述用地高辛標記的探針，于37℃雜交16小時。隨后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所描述的解釋對與標記的探針雜交的克隆進行檢測。結果，證實有1株克隆與標記的探針雜交。
(5)源于解肝磷脂土地桿菌菌株IPO-12017的肽生成酶基因的堿基序列大腸桿菌JM109所含有的質粒由上述被證實與標記的探針雜交的微生物細胞菌株制備，確定與探針發生雜交的鄰近堿基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟實施測序反應。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生產)實施電泳。
結果，發現存在編碼肽生成酶的開放讀碼框。序列表中的SEQ IDNO17中顯示了源于解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的全長肽生成酶基因的堿基序列，以及相應的氨基酸序列。
(實施例36)源于解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017的肽生成酶基因在大腸桿菌中的表達使用解肝磷脂土地桿菌菌株IFO-12017(保藏機構發酵研究所，Osaka，保藏機構地址2-17-85 Jusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Japan)的染色體DNA作為模板，SEQ ID NO19和20中所示的寡核苷酸作為引物，通過PCR擴增靶基因。然后用NdeI/HindIII處理該DNA片段，然后將所得DNA片段與pTrpT的NdeI/HindIII處理產物連接。然后用該連接液轉化大腸桿菌JM109，從氨芐西林抗性菌株中選擇含有靶質粒的菌株，將該質粒命名為pTrpT_Ph_aet。
通過將一鉑環的菌株細胞接種在含有3ml培養基(2g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l酪蛋白氨基酸、5g/l硫酸銨、3g/l磷酸二氫鉀、1g/l磷酸氫二鉀、0.5g/l七水硫酸鎂，和100mg/l氨芐西林)的普通試管中的方式，將含有pTrpT_Ph_aet的大腸桿菌JM109在25℃培養20小時。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性為0.3U/1ml培養液的克隆的基因被證實由大腸桿菌表達。此外，在作為對照的僅導入pTrpT的轉化體中未發現活性。
(實施例37)來自Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ11116的肽生成酶基因的分離以下，將描述肽生成酶基因的分離。所使用的微生物是Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構DeutcheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)。在基因分離中，將大腸桿菌JM-109用作宿主，而將pUC118用作載體。
(1)微生物的制備將Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig，Germany)在CM2G瓊脂培養基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化鈉和20g/l瓊脂，pH 7.0)上于25℃培養24小時。在含有50ml CM2G液體培養基(除瓊脂外的上述培養基)的500ml坂口氏瓶中接種1鉑環所得微生物細胞，然后在25℃震蕩培養。
(2)從微生物細胞中制備染色體DNA對50mL培養液進行離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集微生物細胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根據其說明書中所述步驟，從微生物細胞中獲得染色體DNA。
(3)通過PCR制備探針DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生產)，通過PCR方法，獲得含有源于Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig，Germany)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs21和16的堿基序列的引物，對獲自Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg1b，38124 Braunschweig，Germany)的染色體DNA進行PCR。將由PCR擴增的大約1kb DNA片段通過0.8％瓊脂糖電泳進行分離。然后切下靶條帶，純化得到的DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟，用探針地高辛標記該DNA片段。
(4)從基因文庫克隆肽生成酶基因為了獲得全長肽生成酶基因，采用上述PCR步驟中擴增的DNA片段作為探針進行Southern雜交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern雜交的步驟。
在用限制性酶PstI在37℃反應16小時而完全消化Taxeobactergelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構Deutche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)的染色體DNA后，對其進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將電泳的染色體DNA從瓊脂糖凝膠上印跡在帶正電的尼龍濾膜(Roche Diagnostics生產)，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)進行雜交。于50℃，對濾器預雜交1小時后，加入按上述制備的用地高辛標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟對與探針雜交的條帶進行檢測。結果，能夠檢測到與探針雜交的大約5kb的條帶。
用HindIII完全消化Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ11116(保藏機構Deutche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)的染色體DNA。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離大約5kb的DNA，然后采用Gene Clean II試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA，將其溶于10μl TE中。然后將4μl該產物與pUC118 PstI/BAP(Takara Shuzo生產)混合，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo生產)進行連接反應。混合5μl該連接反應液和100μl大腸桿菌JM109(Takara Shuzo生產)而轉化大腸桿菌。然后將由此得到的轉化體置于適宜的固體培養基上來產生染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽生成酶基因，采用上述探針，通過菌落雜交篩選染色體DNA文庫。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落雜交的步驟。
將染色體DNA文庫的克隆轉至尼龍濾膜(用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜，(Roche Diagnostics生產))，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入上述用地高辛標記的探針，于37℃雜交16小時。隨后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗滌濾器兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所描述的解釋對與標記的探針雜交的克隆進行檢測。結果，證實有1株克隆與標記的探針雜交。
(5)源于Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116的肽生成酶基因的堿基序列大腸桿菌JM109所含有的質粒由上述被證實與標記的探針雜交的微生物細胞菌株制備，確定與探針發生雜交的鄰近堿基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟實施測序反應。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生產)實施電泳。
結果，發現存在編碼肽生成酶的開放讀碼框。序列表中的SEQ IDNO22中顯示了源于Taxeobacter gelupurpurascens菌株DSMZ 11116(保藏機構Deutche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，保藏機構地址Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)的全長肽生成酶基因的堿基序列，以及相應的氨基酸序列。
(實施例38)源于海圓桿菌菌株ATCC 25205的肽生成酶基因的分離以下，將描述肽生成酶基因的分離。所用的微生物為海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)。在基因分離中，將大腸桿菌JM-109用作宿主，而將pUC118用作載體。
(1)微生物細胞的制備將海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)在CM2G瓊脂培養基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化鈉和20g/l瓊脂，pH 7.0)上，于25℃培養24小時。在含有50ml CM2G液體培養基(除瓊脂以外的上述培養基)的500ml坂口氏瓶中接種1鉑環所得微生物細胞，然后在25℃震蕩培養。
(2)從微生物細胞中制備染色體DNA對50mL培養液進行離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集微生物細胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根據其說明書中所述步驟，從微生物細胞中獲得染色體DNA。
(3)通過PCR制備探針DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生產)，通過PCR方法，獲得含有源于海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United Statesof America)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQID NOs15和16的堿基序列的引物，對獲自海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色體DNA進行PCR。由PCR擴增的大約1kb DNA片段通過0.8％瓊脂糖電泳進行分離。然后切下靶條帶，純化得到的DNA片段。采用DIG HighPrime(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟，用探針地高辛標記該DNA片段。
(4)由基因文庫克隆肽生成酶基因為了獲得全長肽生成酶基因，采用上述PCR步驟中擴增的DNA片段作為探針進行Southern雜交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern雜交的步驟。
在用限制性酶HincII在37℃反應16小時而完全消化海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色體DNA后，對其分別實施0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將電泳的染色體DNA從瓊脂糖凝膠上印跡在帶正電的尼龍濾膜(RocheDiagnostics生產)，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)進行雜交。于50℃，對濾器預雜交1小時后，加入按上述制備的用地高辛標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟對與探針雜交的條帶進行檢測。結果，在PstI消化產物中檢測到與探針雜交的大約7k的條帶，而在HincII消化產物中檢測到與探針雜交的大約2k的條帶。
用PstI或HincII完全消化海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色體DNA。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離出大約7kb或2kb的DNA，然后采用Gene CleanII試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA，將其溶于10μl TE中。然后將4μl該產物與pUC118 PstI/BAP(Takara Shuzo生產)或pUC118HincII/BAP(Takara Shuzo生產)混合，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo生產)進行連接反應。分別混合5μl該連接反應液和100μl大腸桿菌JM109(Takara Shuzo生產)而轉化大腸桿菌。然后將由此得到的轉化體置于適宜的固體培養基上來產生染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽生成酶基因，采用上述探針，通過菌落雜交篩選染色體DNA文庫。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落雜交的步驟。
將染色體DNA文庫的克隆轉至尼龍濾膜(用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜，(Roche Diagnostics生產))，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入上述用地高辛標記的探針，于37℃雜交16小時。隨后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所描述的解釋對與標記的探針雜交的克隆進行檢測。結果，證實有1株克隆與標記的探針雜交。
(5)源于海圓桿菌菌株ATCC 25205的肽生成酶基因的堿基序列大腸桿菌JM109所含有的質粒由上述被證實與標記的探針雜交的微生物細胞菌株制備，確定與探針發生雜交的鄰近堿基序列。采用CEQDTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟實施測序反應。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生產)實施電泳。
結果，發現存在編碼肽生成酶的開放讀碼框。序列表中的SEQ IDNO24中顯示了源于海圓桿菌菌株ATCC 25205(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)的全長肽生成酶基因的堿基序列，以及相應的氨基酸序列。
(實施例39)源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359的肽生成酶基因的分離以下，將描述肽生成酶基因的分離。所用微生物為Psycloserpensburtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the UnitedStates of America)。在分離基因中，將大腸桿菌JM-109用作宿主，而pUC118用作載體。
(1)微生物的制備將Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)在CM2G瓊脂培養基(含有50g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、10g/l胨、5g/l氯化鈉和20g/l瓊脂，pH 7.0)上于10℃培養24小時。在含有50mlCM2G液體培養基(除瓊脂以外的上述培養基)的500ml坂口氏瓶中接種1鉑環所得微生物細胞，然后在10℃震蕩培養。
(2)從微生物細胞中制備染色體DNA對50mL培養液進行離心(12,000rpm，4℃，15分鐘)，收集微生物細胞。然后，采用QIAGEN Genomic-Tip System(Qiagen)，根據其說明書中所述步驟，從微生物細胞中獲得染色體DNA。
(3)通過PCR制備探針DNA片段采用LA-Taq(Takara Shuzo生產)，通過PCR方法，獲得含有源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的肽生成酶基因的一部分的DNA片段。然后采用含有SEQ ID NOs15和16的堿基序列的引物，對獲自Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色體DNA進行PCR。由PCR擴增的大約1kb DNA片段通過0.8％瓊脂糖電泳進行分離。然后切下靶條帶，純化得到的DNA片段。采用DIG High Prime(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟，用探針地高辛標記該DNA片段。
(4)由基因文庫克隆肽生成酶基因為了獲得全長肽生成酶基因，采用在上述PCR步驟中擴增的DNA片段作為探針進行Southern雜交。Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述了Southern雜交的步驟。
在用限制性酶EcoRI在37℃反應16小時而完全消化Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box 1549，Manassas，VA20110，the United States of America)的染色體DNA后，對其進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，將電泳的染色體DNA從瓊脂糖凝膠上印跡在帶正電的尼龍濾膜(Roche Diagnostics生產)，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)進行雜交。于50℃，對濾器預雜交1小時后，加入按上述制備的用標記的探針，于50℃雜交16小時。隨后，用包含0.1％SDS的0.1×SSC，60℃，洗滌兩次。
采用DIG核酸檢測試劑盒(Boehringer-Mannheim生產)，根據試劑盒的說明書中所述步驟對與探針雜交的條帶進行檢測。結果，能夠檢測到與探針雜交的大約7kb的條帶。
用EcoRI完全消化Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的染色體DNA。通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離大約7kb的DNA，然后采用Gene CleanII試劑盒(Funakoshi生產)純化DNA，將其溶于10μl TE中。然后將4μl該產物與pUC118 EcoRI/BAP(Takara Shuzo生產)混合，采用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo生產)進行連接反應。混合5μl該連接反應液和l00μl大腸桿菌JM109(Takara Shuzo生產)而轉化大腸桿菌。然后將由此得到的轉化體置于適宜的固體培養基上來產生染色體DNA文庫。
為了獲得全長的肽生成酶基因，采用上述探針，通過菌落雜交篩選染色體DNA文庫。Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Press(1989)中描述了菌落雜交的步驟。
將染色體DNA文庫的克隆轉至尼龍濾膜(用于菌落和噬菌斑雜交的尼龍膜，(Roche Diagnostics生產))，然后進行包括堿變性、中和和固定的處理。采用EASY HYB(Boehringer-Mannheim生產)實施雜交。于37℃，對濾器預雜交1小時后，加入上述用地高辛標記的探針，于37℃雜交16小時。隨后，用包含1％SDS的0.1×SSC于60℃洗滌兩次。
采用DIG Nucleotide Detection Kit(Boehringer-Mannheim生產)，根據說明書檢測與標記的探針雜交的克隆。結果，證實1株克隆與標記的探針雜交。
(5)源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359的肽生成酶基因的堿基序列大腸桿菌JM109所含有的質粒由上述被證實與標記的探針雜交的微生物細胞菌株制備，確定與探針發生雜交的鄰近堿基序列。根據說明書所述步驟，采用CEQ DTCS-Quick Start Kit(Beckman-Coulter生產)進行測序反應。此外，采用CEQ 2000-XL(Beckman-Coulter生產)實施電泳。
結果，發現存在編碼肽生成酶的開放讀碼框。序列表中的SEQ IDNO26中顯示了源于Psycloserpens burtonensis菌株ATCC 700359(保藏機構美國典型培養物保藏中心，保藏機構地址P.O.Box1549，Manassas，VA 20110，the United States of America)的全長肽生成酶基因的堿基序列，以及相應的氨基酸序列。
工業上的可應用性根據本發明，提供了通過減少諸如引入和消除保護基的復雜合成方法，而能夠容易地、高產率地和廉價地生產肽的新型酶。使用本發明的酶能夠實現肽的有效率的工業生產。
序列表<110>AJINOMOTO CO.，LTD.
<120>新型肽生成酶基因<130>PAMA-15377，PAMA-03030<150>JP2002-218957<151>2002-07-26<150>JP2003-016765<151>2003-01-24<160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>短穩稈菌<220>
<223>InventorHARA，SeiichiInventorYOKOZEKI，KenzoInventorABE，IsaoInventorTONOUCHI，NaotoInventorJOJIMA，Yasuko<400>1Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>短穩稈菌<400>2Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp1 5
<210>3<211>20<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述合成引物1<400>3ttyacngcna thtaycarcc20<210>4<21l>23<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述合成引物2<400>4tcnggcatng trtangtnac rtt23<210>5<21l>2024<212>DNA<213>短穩稈菌<220>
<221>CDS<222>(61)..(1908)<223>編碼肽合成酶的基因<400>5atttcttaat aaaaactgaa atcttaatac atttatacta tcgtaaaatt tattgaacac60gtg aaa aaa tta aca tta aaa gta act cta ctt aca ctt ttg ttg gga 108Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15
agt aca gtt gga ttt gcg caa gat gca aaa gca gat tct gct tat gtg156Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30cgc gac aat tac gaa aaa ata gaa caa gta att ccg atg cgc gat ggt204Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45aca aag tta ttt aca gct att tat cag cca aaa gat aaa aca aaa caa252Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60tat ccc gtt ttg tta aat cgt acg cct tat aca gtt gcg cct tat ggt300Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly65 70 75 80gta aat gaa tac aag aaa tcg tta gga aat ttt cct aca gaa atg cgc348Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95gaa ggt ttt att ttt gtt tac caa gat gtg aga gga aaa tgg atg agc396Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser100 105 110gaa ggc gaa ttt gaa gat gtt cga cct ata aat cct tca aaa agt aaa444Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys115 120 125aag gca att gac gaa agc aca gat aca ttt gat acg cta gaa tgg ctt492Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu130 135 140gct aaa aac ttg aag aat tac acg aaa aaa gct gga att tat gga att540Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile145 150 155 160tcg tat cct ggt ttt tat tcg aca atg agt ttg gtt aat tcg cat cca588Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro165 170 175act cta aaa gcc gtt tcg cca caa gcg ccc gtt acc aat tgg ttt tta636Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu180 185 190
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aaa gat aaa ggt aat ttt aaa cca acc gaa gct aca att ttt att acg1212Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr370 375 380gga tct aac gaa tgg aaa caa ttt gat gct tgg cca cca aaa aat gta1260Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gln Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Val385 390 395 400aca aca caa aaa att tat ttg caa caa aat ggt aaa ata gct ttt aat1308Thr Thr Gln Lys Ile Tyr Leu Gln Gln Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn405 410 415aaa acc aat aca aca act act ttt gac gaa tat gtt gca gat cca aat1356Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn420 425 430tct cca gtt cct tat tca gga gga gtt tta gaa act cgt tca aga gaa1404Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu435 440 445tat atg gtc gat gat caa cgc ttt gct tct act cgt cct gat gtt atg1452Tyr Met Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met450 455 460gtg tat caa tct gat att ttg aca gaa gat att acg ctt gct ggt cct1500Val Tyr Gln Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro465 470 475 480gtt atc aat cat tta gtg gtt tct act acg gga aca gac gct gat tat1548Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr485 490 495gtt gta aaa ttg att gat gtt tat cct gaa aac acg cca aaa ttt aat1596Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn500 505 510aac aaa tta atg gct gga tat caa aat ttg att cgt gca gaa att atg1644Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gln Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met515 520 525cgc gga aaa tat aga aat agt ttc tct aac ccc gaa gct atg gtt ccg1692Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro530 535 540
aat aaa gaa aca aat gta acg tac acg atg cca gat gtt gga cat aca1740Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr545 550 555 560ttt aag aaa gga cat cgc att atg att caa gtt cag aac agt tgg ttt1788Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe565 570 575cct tta gca gat cgc aat ccg caa caa ttt atg aat gtt tac gaa gca1836Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gln Gln Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala580 585 590act tct aaa gat tat tta aaa caa acg caa cga att tat cat act tct1884Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Thr Gln Arg Ile Tyr His Thr Ser595 600 605tat atc gaa att ccg gta ttg aaa taacaaaaaa atccagctaa ttagctggat 1938Tyr Ile Glu Ile Pro Val Leu Lys610 615tttttttata atgttacttt tcctattttt cctttatttc caactaaaat tacatatttt 1998ttatcgggcg aaaccgtaca agtatg 2024<210>6<211>616<212>PRT<213>短穩稈菌<400>6Val Lys Lys Leu Thr Leu Lys Val Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly1 5 10 15Ser Thr Val Gly Phe Ala Gln Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Val20 25 30Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gln Val Ile Pro Met Arg Asp Gly35 40 45Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gln Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gln50 55 60Tyr Pro Val Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ala Pro Tyr Gly
65 70 75 80Val Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg85 90 95Glu Gly Phe Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser100 105 110Glu Gly Glu Phe Glu Asp Val Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys115 120 125Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu130 135 140Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile145 150 155 160Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Val Asn Ser His Pro165 170 175Thr Leu Lys Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asn Trp Phe Leu180 185 190Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe195 200 205Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Val Lys Arg Pro Gln Pro Ile Thr Pro210 215 220Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg225 230 235 240Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Val Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gln245 250 255Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp260 265 270Gln Phe Trp Gln Asp Arg Asn Val Leu Pro His Leu Thr Asn Val Gln275 280 285Pro Ala Val Met Thr Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr290 295 300
Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gln Asn Pro Lys Ala305 310 315 320Thr Asn Ile Met Val Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Val Arg325 330 335Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gln Phe Ala Ser Asn Thr Ser340 345 350Glu His Tyr Gln Gln Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu355 360 365Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr370 375 380Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gln Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Val385 390 395 400Thr Thr Gln Lys Ile Tyr Leu Gln Gln Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn405 410 415Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Val Ala Asp Pro Asn420 425 430Ser Pro Val Pro Tyr Ser Gly Gly Val Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu435 440 445Tyr Met Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Val Met450 455 460Val Tyr Gln Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro465 470 475 480Val Ile Asn His Leu Val Val Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr485 490 495Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn500 505 510Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gln Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met515 520 525Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Val Pro530 535 540
Asn Lys Glu Thr Asn Val Thr Tyr Thr Met Pro Asp Val Gly His Thr545 550 555 560Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe565 570 575Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gln Gln Phe Met Asn Val Tyr Glu Ala580 585 590Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Thr Gln Arg Ile Tyr His Thr Ser595 600 605Tyr lle Glu Ile Pro Val Leu Lys610 615<210>7<211>40<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT的合成引物<400>7gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40<210>8<211>40<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT的合成引物<400>8ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40
<210>9<211>38<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>人工序列描述為制備pTrpT_Gtg2的合成引物<400>9gggaattcca tatgaaaaaa ttaacattaa aagtaact38<210>10<211>36<212>DNA<213>合成序列<220>
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<220>
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<213>Psycloserpens burtonensis<400>27Met Lys Thr Leu Phe Lys Leu Leu Leu Leu Phe Val Phe Val Leu Thr1 5 10 15Ser Cys Asn Lys Ala Asn Lys Asp Ala Thr Glu Ile Val Lys Thr Glu20 25 30Val Glu Asp Thr Tyr Val Lys Asp Asn Tyr Asn Lys Gln Glu Val Thr35 40 45Ile Glu Met Arg Asp Gly Ile Lys Leu His Thr Thr Ile Tyr Ser Pro50 55 60Lys Asp Glu Ser Gln Thr Tyr Pro Ile Leu Met Met Arg Thr Pro Tyr65 70 75 80Ser Ser Gln Pro Tyr Gly Asp Asn Glu Phe Lys Thr Lys Ile Gly Pro85 90 95Asn Val His Leu Met Lys Glu Gly Asn Ile Val Val Tyr Gln Asp Val100 105 110Arg Gly Arg Trp Met Ser Glu Gly Val Tyr Asp Asn Met Arg Ala Tyr115 120 125Ile Pro Asn Lys Thr Glu Asp Ser Gln Ile Asp Glu Ala Ser Asp Thr130 135 140Tyr Asp Thr Ile Asp Trp Leu Val Asn Asn Val Glu Asn Asn Asn Gly145 150 155 160
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權利要求
1.編碼選自(G)和(S)的蛋白質的DNA，其中所述蛋白質具有如下定義的氨基酸序列(G)由SEQ ID NO23的23-645位氨基酸殘基組成的氨基酸序列，或(S)由SEQ ID NO23組成的氨基酸序列。
2.一種包含根據權利要求1的DNA的重組DNA。
3.一種包含根據權利要求2的重組DNA的轉化細胞。
4.一種生產肽生成酶的方法，包括在培養基中，在適于生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求3的轉化細胞一段時期，和在培養基和/或轉化細胞中累積肽生成酶。
5.一種生產二肽的方法，包括在培養基中，在適于在培養物中生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求3的轉化細胞一段時期，和將培養物與羧基成分和胺成分混合，通過由所述DNA所編碼的肽生成酶所促進的酶催化作用，來合成二肽。
6.根據權利要求5的生產二肽的方法，其中所述細胞是屬于鞘氨醇桿菌屬的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
7.根據權利要求5或6的生產二肽的方法，其中所述細胞是從所述培養物中分離的。
8.根據權利要求5或6的生產二肽的方法，其中所述細胞是經處理的微生物細胞產物。
9.編碼選自(H)和(T)的蛋白質的DNA，其中所述蛋白質具有如下定義的氨基酸序列(H)在SEQ ID NO23的23-645位氨基酸殘基中，置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的，且在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO23的23-645位無突變的氨基酸殘基所對應的蛋白質的至少50％的肽生成活性的氨基酸序列，或(T)成熟蛋白質區，其具有在SEQ ID NO23的氨基酸序列中，包括置換、缺失、插入、添加，和/或倒位一個或多個氨基酸所得的的氨基酸序列，且其在50℃和pH 8下，具有無突變的SEQ ID NO23所對應的蛋白質的至少50％的肽生成活性。
10.根據權利要求9的DNA，其中所述多個是2-50個氨基酸殘基。
11.一種包含根據權利要求9的DNA的重組DNA。
12.一種包含根據權利要求11的重組DNA的轉化細胞。
13.一種生產肽生成酶的方法，包括在培養基中，在適于生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求12的轉化細胞一段時期，和在培養基和/或轉化細胞中累積肽生成酶。
14.一種生產二肽的方法，包括在培養基中，在適于在培養物中生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求12的轉化細胞一段時期，和將培養物與羧基成分和胺成分混合，通過由所述DNA所編碼的肽生成酶所促進的酶催化作用，來合成二肽。
15.根據權利要求14的生產二肽的方法，其中所述細胞是屬于鞘氨醇桿菌屬的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
16.根據權利要求14或15的生產二肽的方法，其中所述細胞是從所述培養物中分離的。
17.根據權利要求14或15的生產二肽的方法，其中所述細胞是經處理的微生物細胞產物。
18.選自(g)和(s)的DNA，其中所述DNA具有如下定義的堿基序列(g)由SEQ ID NO22的127-1995位堿基組成的堿基序列，或(s)由SEQ ID NO22的61-1995位堿基組成的堿基序列。
19.一種包含根據權利要求18的DNA的重組DNA。
20.一種包含根據權利要求19的重組DNA的轉化細胞。
21.一種生產肽生成酶的方法，包括在培養基中，在適于生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求20的轉化細胞一段時期，和在培養基和/或轉化細胞中累積肽生成酶。
22.一種生產二肽的方法，包括在培養基中，在適于在培養物中生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求20的轉化細胞一段時期，和將培養物與羧基成分和胺成分混合，通過由所述DNA所編碼的肽生成酶所促進的酶催化作用，來合成二肽。
23.根據權利要求22的生產二肽的方法，其中所述細胞是屬于鞘氨醇桿菌屬的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
24.根據權利要求22或23的生產二肽的方法，其中所述細胞是從所述培養物中分離的。
25.根據權利要求22或23的生產二肽的方法，其中所述細胞是經處理的微生物細胞產物。
26.選自(h)和(t)的DNA，其中所述DNA具有如下定義的堿基序列(h)在嚴緊條件下，與具有與SEQ ID NO22的127-1995位堿基的堿基序列互補的堿基序列的DNA雜交的，且編碼在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO22的127-1995位無突變的堿基所編碼的蛋白質的至少50％的肽生成活性的蛋白質的堿基序列，或(t)在嚴緊條件下，與具有與SEQ ID NO22的61-1995位堿基的堿基序列互補的堿基序列的DNA雜交的，且編碼在50℃和pH 8下，具有SEQ ID NO22的61-1995位無突變的堿基所編碼的蛋白質的至少50％的肽生成活性的蛋白質的堿基序列。
27.一種包含根據權利要求26的DNA的重組DNA。
28.一種包含根據權利要求27的重組DNA的轉化細胞。
29.一種生產肽生成酶的方法，包括在培養基中，在適于生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求28的轉化細胞一段時期，和在培養基和/或轉化細胞中累積肽生成酶。
30.制備二肽的方法，包括在培養基中，在適于在培養物中生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求28的轉化細胞一段時期，和將培養物與羧基成分和胺成分混合，通過由所述DNA所編碼的肽生成酶所促進的酶催化作用，來合成二肽。
31.根據權利要求30的生產二肽的方法，其中所述細胞是屬于鞘氨醇桿菌屬的具有由羧基成分和胺成分生成二肽的能力的微生物。
32.根據權利要求30或31的生產二肽的方法，其中所述細胞是從所述培養物中分離的。
33.根據權利要求30或31的生產二肽的方法，其中所述細胞是經處理的微生物細胞產物。
34.根據權利要求26的DNA，其中嚴緊條件是在相當于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下，于60℃進行洗滌的條件。
35.一種包含根據權利要求34的DNA的重組DNA。
36.一種包含根據權利要求35的重組DNA的轉化細胞。
37.一種生產肽生成酶的方法，包括在培養基中，在適于生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求36的轉化細胞一段時期，和在培養基和/或轉化細胞中累積肽生成酶。
38.制備二肽的方法，包括在培養基中，在適于在培養物中生產肽生成酶的條件下，培養根據權利要求36的轉化細胞一段時期，和將培養物與羧基成分和胺成分混合，通過由所述DNA所編碼的肽生成酶所促進的酶催化，來合成二肽。
全文摘要
本發明涉及不必通過復雜的合成方法即可容易地、廉價地和高產率地生產肽的新型酶。更具體地，本發明提供了催化由羧基成分和胺成分的肽合成反應的新型酶，產生該酶的微生物，和采用該酶或該微生物的廉價的二肽生產方法。本發明揭示了能從穩桿菌屬新發現的細菌中有效合成肽的新型酶，且揭示了簡易且廉價的生產二肽的方法。
文檔編號C12N1/21GK101067125SQ20071009367
公開日2007年11月7日 申請日期2003年7月25日 優先權日2002年7月26日
發明者原誠一, 橫關健三, 阿部巧, 外內尚人, 城島恭子 申請人:味之素株式會社