專利名稱：一種納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種利用蠶絲絲素制備納米級的絲素蛋白粉的方法，屬于功 能納米材料技術領域。
背景技術：
功能納米材料是納米材料科學中最富有活力的領域，它可以應用于化工、 生物、能源、環境等高科技領域，產生深遠的影響并具有廣闊的應用前景。 如納米生物材料可以應用在組織工程、再生醫學材料以及生物相容界面材料 等領域。在生物相容界面材料的應用時，其主要是通過層層組裝技術，實現
包括蛋白質、DNA和聚電解質等在溫和的條件下在眾多基材上的組裝，不僅實 現了對天然生物材料的結構模擬，而且可以獲得表面層狀生物材料，解決一 些材料的生物相容性關鍵問題，可以應用于如細胞生長支架、藥物緩釋材料、 酶及仿酶載體以及生物傳感器材料等范圍。而納米化工材料，可以通過化學 反應或物理添加賦予化工材料如降解、催化、消臭抗菌等功能。
正因為功能納米材料具有極大的應用價值，如何制備及應用功能納米材 料便成了專家、學者的研究熱點。蠶絲絲素是由特殊的氨基酸構成，其具備 了作為生物、紡織、精細化工材料的很大的應用價值，對其納米級絲素蛋白 粉的制備工藝及方法研究極為活躍。目前工業上尚無納米級絲素蛋白粉制備 方法，現今工業上有采用機械粉碎法制備絲素蛋白粉的情況，但受到粉碎機 械技術的制約，只能制得微米級顆粒，而微米級顆粒與納米級顆粒，其應用 范圍及應用效果不一致。對于絲素蛋白粉納米級顆粒的制備，目前均處在實 驗室階段。比如申請號為"200610039191.8"、發明名稱為"固定化酶的絲 素納米顆粒及其制備方法"的中國發明專利申請就公開了這樣的一種方法，
它采用了水溶性絲素溶液與能與水混溶的質子型有機溶劑或極性非質子型有 機溶劑混合，形成乳白色的球形微粒分散在有機溶劑體系中，得到納米絲素 顆粒混合液或懸浮液，去除有機溶劑，得到絲素納米顆粒懸浮液或絲素納米
粉末，制得的納米顆粒約為35 125nm。該方法中，作為纖維蛋白的絲素蛋白 不溶或難溶于水，而該專利中未指出水溶性絲素溶液的制備方法，同時在水 溶性絲素溶液與能與水混溶的質子型有機溶劑或極性非質子型有機溶劑混合 過程中，絲素溶出低，損耗大，所以存在制備難度大、收率低、難以工業化 的不足。還有一件中國發明專利(專利號為"200410016856.4"、發明名稱為 "蠶絲蛋白納米微球及其制備方法")運用生物納米技術，使蠶絲蛋白質在適 當條件下發生自組裝形成納米微球，制得的納米顆粒約為80 3000nm。該方 法也存在制備難度大，難以工業化的不足，同時該專利還存在納米顆粒大小 差異大、不均勻的問題。
專利號為"02138016.3"、發明名稱為"一種生物活性肽-絲素肽的制備 方法"的中國發明專利也公開了一種制備絲素蛋白的方法，它以下腳蠶繭或 廢蠶絲為原料，經0. 3-1. 0% (w/v)的Na2C03溶液精練后，用20-60% (w/w)的 CaCL溶液加熱溶解得溶絲液，在pH2. 5-12.0， 30-80。C下用蛋白酶對溶絲液 進行酶水解反應，再用納濾技術脫除酶解液中高濃度的CaCl2鹽，對濃縮液噴 霧干燥即得。該方法雖然能制得絲素蛋白粉末，但顆粒大，無法達到納米級， 這是因為CaCl2這種金屬鹽，在溶解絲素時Ca離子會被絡合包裹于絲素中， 即便進行水溶液透析也無法將Ca離子除去，而該工藝是未除去CaCl2的情況 下進行的酶解反應，除了絲素-Ca離子絡合物的形成影響了酶解反應、降低了 酶解效果以外，CaCl2在整個酶解系統的存在還將使其Ca離子與蛋白酶形成絡 合結構，導致酶失去活性從而使酶解反應難以正常進行。即先酶解后除CaCh 的工藝流程，是無法達到制備納米級絲素蛋白粉末的目的的。
發明內容
針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的是提供一種利用蠶絲絲素
制備納米級的絲素蛋白粉的方法，本方法工藝簡單易行，適合工業化、大批 量生產，所得蛋白粉末顆粒均勻，大小適中，利于應用。
本發明的目的是這樣實現的 一種納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，其 特征在于，它包括以下歩驟
① 、將純凈的絲素原料加入足量的鹽溶液中進行鹽溶得到溶絲液，所述
鹽溶液為50 60wt%NaSCN或由LiBr、 CH30H和H刀三者按重量比40 60: 22 42: 10 30配成的有機無機混合溶劑；
② 、將第一步得到的溶絲液進行透析，得到絲素蛋白水溶液；
③ 、將第二步得到的絲素蛋白水溶液進行酶解，酶解用蛋白酶為a—糜 蛋白酶或者中性蛋白酶；
、將酶解液干燥收集即得絲素蛋白粉。
所述絲素原料的制備方法為將廢棄繭殼或廢絲用醚類化合物浸泡以除 去其中的蠟質物(廢棄繭殼浸泡48小時，廢絲浸泡24小時)，用水洗滌干 燥后再用乙醇煮沸1小時除去碳水化合物及灰分，經洗凈后再在水中煮沸以 脫去絲膠，將得到的純凈絲素用水洗滌干燥備用。
所述酶解方法為將絲素蛋白水溶液在70 80。C水浴中加熱5min后取出 并調整pH至酶解所需值，加入酶解所需量的蛋白酶，攪拌水解，經過一定反 應時間后將酶失活停止反應。
如果酶解用蛋白酶為a —糜蛋白酶，則pH值用25%氨溶液調至5. 5 7. 5， 加入蛋白酶在37。C土3。C下攪拌水解約1 1. 5h后，將溶液放入-4(TC凍庫中 讓酶失活停止反應。
如果酶解用蛋白酶為中性蛋白酶，則pH值用25%氨溶液調至6. 0 7. 5， 加入蛋白酶在50 55t:下攪拌水解約1 1. 5h后，將溶液放入-4CTC凍庫中 讓酶失活停止反應。
相比現有的制備方法，本發明具有如下有益效果
1、由于a -糜蛋白酶或者中性蛋白酶具有對絲素蛋白的酶切功能強、可 均勻酶切絲素蛋白的優點，故得到的絲素蛋白顆粒均勻，大小適中，利于應
用，顆粒大小為80 500nm。本納米絲素蛋白小于人皮膚毛孔尺寸，可以作為 化妝品添加劑。
2、 本方法工藝簡單，易于實現，單次制備量大，所用原料為廢棄蠶絲， 為下腳原料再利用范疇，具備了在功能材料領域的應用前景。
3、 本方法選用的鹽溶液和酶解蛋白酶價格便宜，制備成本低。
4、 本發明收率高，可達65 80%。
基于上述優點，因此本發明可進行大批量、工業化生產。
實驗表明，本方法制備的納米絲素蛋白粉末具有抗菌性能，可以作為生
物材料應用，也可以作為功能性纖維及其添加物質，同時也可作為食品添加、
精細化工制品添加材料加以應用。
圖1-本發明使用a —糜蛋白酶酶解得到的蛋白粉末顆粒； 圖2-本發明使用中性蛋白酶酶解得到的蛋白粉末顆粒； 圖3-試樣周圍培養金黃葡萄球菌后的抑菌效果圖。
具體實施例方式
本發明是用50 60wt%NaSCN鹽溶液或LiBr、 CH:,OH和H20 (重量比40 60: 22 42: 10 30)三者配成的混合溶劑將絲素蛋白溶解，透析濃縮后再 用a -糜蛋白酶或者中性蛋白酶進行酶解細化制備顆粒均勻的納米絲素蛋白 粉末，其納米顆粒大小為80 500nm。用本方法制得的納米級蠶絲絲素蛋白粉 末顆粒均勻，工藝簡單，所用原料為廢棄蠶絲，為下腳原料再利用范疇，具 備了在生物材料等功能材料領域的應用前景。
以下結合實施例詳細介紹本發明。
1.首先得到絲素纖維原料
將廢棄繭殼或廢絲用醚類化合物浸泡以除去其中的蠟質物(廢棄繭殼浸 泡48小時，廢絲浸泡24小時)，用水洗滌干燥后再用乙醇煮沸1小時除去
碳水化合物及灰分，經洗凈后再在水中煮沸以脫去絲膠，將得到的純凈絲素 用水洗滌干燥備用。用胭脂紅苦味酸溶液法檢驗絲膠脫凈后，將得到的純凈 絲素用水洗滌干燥備用。
絲素的制備不局限于上述方法，也可以采用傳統的其它絲素制備方法得到。
2. 絲素蛋白水溶液的制備
溶解絲素纖維的鹽溶液可以是按重量比40 60: 22 42: 10 30 (最佳 配比為50: 32: 10)配制LiBr、 CH3OH和H20三者形成的有機無機混合溶劑， 也可以是50 60wt%NaSCN鹽溶液。將上步驟中得到的純凈絲素纖維溶解于上 面配制的溶劑中。鹽溶液的量以能充分溶解絲素纖維即可。
3. 經透析、濃縮后待用。
4. 再生絲素蛋白粉末酶解(酶解可以采用兩種蛋白酶， 一種是a—糜蛋 白酶， 一種是中性蛋白酶)
(1) a—糜蛋白酶的酶解經定溶及測定，本發明所用絲素蛋白肽溶液 濃度均在2 5mg/ml范圍內。將裝有絲素蛋白水溶液的燒杯放在70 8(TC水 浴中加熱5min后取出，溶液用25。/。氨溶液調整pH至5. 5 7. 5，按照絲素蛋 白a—糜蛋白酶重量比為10:1 (實際中也可以采用其它比例加入，只要酶 的加入量能確保絲素蛋白粉末充分酶解)的比例加入a—糜蛋白酶，在37"C 下攪拌水解約1.5h后，將溶液直接放入-4(TC凍庫中讓酶失活停止反應。酶 解后絲素蛋白粉末用離心機離心后在6(TC下蒸發48小時得到干燥粉末。收率 約65 80%。粉末的尺寸觀察通過場發射掃描電鏡進行，觀察到其為80nm至 500nm之間大小球型粉末，見圖一，a和b為不同位置的截圖。
(2)中性蛋白酶的酶解經定溶及測定，本發明所用絲素蛋白肽溶液濃度 均在2 5mg/ml范圍內。將裝有絲素蛋白水溶液的燒杯放在70 8(TC水浴中 加熱5min后取出，溶液用25呢氨溶液調整pH至6.0 7. 5左右，按照絲素蛋 白中性蛋白酶重量比為10:1 (實際中也可以采用其它比例加入，只要酶的 加入量能確保絲素蛋白粉末充分酶解)的比例加入中性蛋白酶，在50 55°C
下攪拌水解約1.5h后，將溶液直接放入-4(TC凍庫中讓酶失活停止反應。酶 解后絲素蛋白粉末用離心機離心后在6(TC下蒸發48小時得到干燥粉末。收率 約65 70%。粉末的尺寸觀察通過場發射掃描電鏡進行，觀察到其為80mn至 500nm之間大小球型粉末，見圖二， a和b為不同位置的截圖。
絲素蛋白粉末除了上述的離心后蒸發干燥收集得到外，還可以采用冷凍 干燥法收集。
抗菌實驗
使用牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、水來制作培養基。瓊脂粉經溶解滅菌后 接種金黃色葡萄球菌，麥康凱瓊脂接種大腸桿菌。
將培養好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌取出，涂布方式將兩種細菌分別 接種到培養皿，將絲蛋白肽粉末、鋅酞菁粉末和鋅酞菁-絲素蛋白肽粉末分別 接種培養18小時，觀察細菌的生長情況。整個操作均在無菌操作臺進行。
實驗表明，本發明制備的納米蠶絲絲素蛋白粉具備較強的抗菌性能，如 圖三所示，其中圖a為50 60wt。/。NaSCN溶解得到的絲素蛋白肽粉末抗菌圖， 圖b為酶解后的絲素蛋白納米粉末抗菌圖。
權利要求
1、一種納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，其特征在于它包括以下步驟①、將純凈的絲素原料加入足量的鹽溶液中進行鹽解得到溶絲液，所述鹽溶液為50～60wt％NaSCN或由LiBr、CH3OH和H2O三者按重量比40～60∶22～42∶10～30配成的有機無機混合溶劑；②、將第一步得到的溶絲液進行透析，得到絲素蛋白水溶液；③、將第二步得到的絲素蛋白水溶液進行酶解，酶解用蛋白酶為α-糜蛋白酶或者中性蛋白酶；④、將酶解液干燥收集即得絲素蛋白粉。
2、 根據權利要求1所述的納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，其特征在于 將廢棄繭殼或廢絲用醚類化合物浸泡以除去其中的蠟質物，廢棄繭殼浸泡48 小時，廢絲浸泡24小時，用水洗滌干燥后再用乙醇煮沸l小時除去碳水化合 物及灰分，經洗凈后再在水中煮沸以脫去絲膠，將得到的純凈絲素用水洗滌 干燥備用。
3、 根據權利要求1或2所述的納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，其特征 在于所述酶解方法為將絲素蛋白水溶液在70 8(TC水浴中加熱5min左右 后取出并調整pH至酶解所需值，加入酶解所需量的蛋白酶，攪拌水解后使酶 失活停止反應。
4、 根據權利要求3所述的納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，其特征在于所述酶解用蛋白酶為a—糜蛋白酶，pH值用氨溶液調至5. 5 7.5，加入蛋白 酶在37。C土3。C下攪拌水解約1 1. 5h后，將溶液放入-4(TC凍庫中讓酶失活停止反應。
5、 根據權利要求3所述的納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，其特征在于: 所述酶解用蛋白酶為中性蛋白酶，pH值用氨溶液調至6.0 7.5，加入蛋白 酶在50 55。C下攪拌水解約1 1. 5小時后，將溶液放入-4(TC凍庫中讓酶失活停止反應。
全文摘要
本發明公開了一種納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法，即用50～60wt％NaSCN或LiBr∶CH<sub>3</sub>OH∶H<sub>2</sub>O(重量比40～60∶22～42∶10～30)混合溶劑溶解絲素蛋白——用水透析濃縮——用α-糜蛋白酶或中性蛋白酶酶解，最后用冷凍干燥法或經離心后蒸發干燥收集。本方法得到的納米顆粒大小為80～500nm。本項目具有制備工藝簡單易行，可大批量、工業化生產的優點，同時得到的納米絲素蛋白粉末顆粒均勻、大小適中，利于應用。
文檔編號C12P21/02GK101168763SQ200710092969
公開日2008年4月30日 申請日期2007年11月9日 優先權日2007年11月9日
發明者郝雪菲, 陳忠敏 申請人:重慶工學院