專利名稱：：熱穩定可逆失活酶類的再激活的增強的制作方法熱穩定可逆失活酶類的再激活的增強相關申請的交叉引用本申請要求以2006年6月28日提交的美國臨時申請NO.60/817,043和2006年10月19日提交的美國臨時申請No.60/852，804作為優先權基礎，這兩份申請均通過援引全文納入本申請。
背景技術：
：一些分子生物學方法需要已存在于反應中的、可受控激活的酶。這使得可在預定的時間點在同一反應容器中起動相繼的酶解過程，或者避免由于過早開始酶反應而產生不良副產物。就使用經化學修飾的熱穩定酶類而言，對熱穩定DNA聚合酶的這兩類修飾已被描述(參見美國專利No.5,677,152、5,773,258和6，183，998，通過援引將其全文納入本文)。這種修飾還可應用于其它熱穩定酶，原因在于所有酶中所含的氨基酸例如具有游離NH2-基團的氨基酸可由這些化學物質所修飾，并且這些氨基酸通常涉及酶的催化中心。另外，美國專利No.6，183,998教導了用醛類交聯酶分子，該交聯一般適于修飾任何熱穩定酶。這種經化學修飾的酶類的活性可通過熱孵育步驟恢復，所述熱孵育步驟可斷裂連接到氬基酸殘基上的共價鍵，由此恢復酶的催化活性。但是，由于所選擇的修飾物濃度或失活方法，酶活性僅以緩慢速率恢復。發明人發現含氮化合物可顯著提高經化學修飾的酶類的酶活性，并且它們不影響未修飾的酶。因此，本發明首次描述了使經化學修飾的酶的再激活增強的機制，該機制適于多種應用例如用于提高酶反應速度。
發明內容依照本文所具體充分描述的公開的材料、化合物、組合物、物品和方法的目的，所公開主題一方面涉及化合物和組合物以及制備和使用所述化合物和組合物的方法。另一方面，所公開主題涉及使用一種或多種含氮化合物來增強可逆失活熱穩定酶類的再激活。其它優點一部分將在隨后的說明書中進行闡述，另一部分可顯而易見于說明書或者可通過實施下述各方面獲知。下述優點可通過在所附權利要求書中具體指出的要素和組合實現和獲得。應理解的是，上文的概述和隨后的詳述均是示例性的，僅僅用于解釋而無意于限定。納入本文并構成本說明書的一部分的附圖對下述幾方面進行了圖示。圖1為來自加入不同濃度三唑的快速PCR反應的瓊脂糖凝膠。圖2為一組表格和相應組圖，每個表格示出獲自加入不同濃度具體氨化合物的反應的平均Ct佳。圖3為一組獲自加入不同濃度氯化銨的三個快速PCR反應的三個瓊脂糖凝膠。圖4為獲自存在氯化銨和不同濃度三唑時的快速PCR反應的瓊脂糖凝膠。具體實施例方式通過參考下文的對所公開主題具體方面和其中包括的實施例的詳細描述并參考附圖，可更容易理解本文所述材料、化合物、組合物、物品和方法。公開和描述本發明材料、化合物、組合物、物品和方法之前，應理解的是下述各方面并不限于具體的合成方法或具體的試劑，因為它們理所當然可有所變化。還應理解的是，本文所使用的術語僅僅是為了描述具體方面，而無意于限定。還在通篇說明書中引用了多篇出版物。這些出版物的公開內容通過援引全文納入本申請，目的在于充分描述與所公開主題相關的現有技術的狀況。基于倚賴參考文獻的句子中所論述的包含在所述參考文獻中的素材，公開的參考文獻也通過引用的方式單獨地并特別地納入本說明書。總的定義在本說明書及隨后的權利要求書中，會提及一些術語，這些術語應被定義為具有下述含義整篇本說明書的描述和權利要求中，詞語"包含"和該詞的其它形式例如"包括"和"含有"意味著包括但不限于，而且無意于排除例如其它添加劑、組分、整數或步驟。除非上下文中另外明確指出，在本說明書和所附權利要求書中使用的單數形式的"一"、"一種"和"該"包括復數指代對象。因此，例如，提及"一種化合物"包括兩種或多種這類化合物的混合物，提及"一種酶"包括兩種或多種這類酶的混合物，提及"該引物"包括兩種或多種這類引物的混合物等等。本文所使用術語"取代的"，考慮包括有機化合物的所有容許的取代基。在一個大方面，容許的取代基包括有機化合物的無環與有環、支鏈與無支鏈、碳環與雜環以及芳香族與非芳香族取代基。示例性取代基包括例如下述的取代基。恰當有機化合物的容許取代基可有一個或多個，并且可相同或不同。就本發明公開內容的目的而言，雜原子例如氮可具有氫取代基和/或滿足雜原子化合價的本文所述有機化合物的任何容許取代基。該公開內容無意于以任何方式被有機化合物容許的取代基限定。同樣，術語"取代"或"被……取代"包含這樣一種隱含前提這種取代與所取代原子和取代基容許的化合價相一致，并且這種取代可得到穩定的化合物，例如不會通過例如重排、環化、消除等發生自發轉化的化合物。本文所使用的術語"烷基，，為1至24個碳原子的支鏈或無支鏈飽和烴基，例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。烷基基團還可以是取代的或未取代的。烷基基團可被一個或多個基團所取代，所述一個或多個基團包括但不限于本文所述的取代的或未取代的烷基、環烷基、烷氧基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、氧肟酸鹽、曱硅烷基、疏代-氧代(sulfo-oxo)或巰基。"低級烷基，，基團是含有一至六個碳原子的烷基基團。本文所使用的"烷氧基"為通過醚鍵鍵合的烷基或環烷基；也就是說，"烷氧基"基團可定義為一OA1，其中V為上文定義的烷基或環烷基。本文所使用的術語"鏈烯基"為其結構式含有至少一個碳碳雙鍵的2至24個碳原子烴基。不對稱結構例如(Al2)C=C(A3A4)旨在包括E和Z異構體。這可從存在不對稱烯的本發明結構式推定，或者可由鍵合符號C吒明示。鏈烯基可被一個或多個基團所取代，所述一個或多個基團包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、烷氧基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、由化物、鞋基、酮、疊氮化物、硝基、氧肟酸鹽、甲硅烷基、硫代氧代或巰基。本文所使用術語"炔基"為其結構式含有至少一個碳碳三鍵的2至24碳原子烴基。炔基可未被取代，或者被一個或多個基團所取代，所述一個或多個基團包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、烷氧基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、氧肝酸鹽、曱硅烷基、硫代氧代或巰基。術語"酰基"表示含10個或少于IO個連續C原子的相應酸的衍生物。這些酸部分可具有其它烷基基團或官能團例如羥基、氨基、羧基、磺酸、酯或醚基團。本文所使用術語"芳基"是包含任意基于碳的芳香族基團的基團，包括但不限于苯、萘、苯基、聯苯基、苯氧基苯(phenoxybenzene)等。術語"芳基"還包括"雜芳基'，，它被定義為含有芳香族基團、且所述芳香族基團的環內摻入了至少一個雜原子的基團。雜原子的實例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同樣，也包含在術語"芳基"中的術語"非雜芳基"定義為含有不含雜原子的芳香族基團的基團。芳基基團可為取代的或未取代的。芳基基團可被一個或多個基團所取代，所述一個或多個基團包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、烷氧基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、氧肟酸鹽、曱硅烷基、硫代氧代或巰基。術語"聯芳基"為特定類型的芳基基團，它包含在"芳基'，的定義之中。聯芳基指的是通過例如萘中的稠環結構鍵合在一起、或者通過例如聯苯中的一個或多個碳碳鍵連接的兩個芳基基團。術語"苯基"包含在芳基的含義之中，并指芐基部分，它可具有連接到環上的其它烷基鏈(含4個或少于4個連續C原子)或官能團例如羥基、氨基、硝基、H基、磺酸、酯、醚或鹵素基團。本文所使用的術語"胺"或"氨基"由式NAHs表示，其中A1、A2和/〖3可獨立地為氫或本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基或雜芳基基團。術語"M烷基"指具有烷基部分的M基團。術語"烷基"定義如上。同樣，氨基烷基的衍生物與烷基基團的衍生物相對應。本文所使用的術語"氮雜五元環(azole)"為在環上含有至少一個氮原子的取代的或未取代的或者稠合的五元環。本文所使用術語"羧酸，，由式一C(0)0H表示。本文所使用術語"酯"由式一0C(0)Y或一C(0)0^表示，其中(為本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基或雜芳基基團。本文所使用術語"醚"由式A^A2表示，其中V和f可獨立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基或雜芳基。本文所使用術語"面化物"或"囟素"指面素氟、氯、溴和碘。本文所使用術語"羥基，，由式一OH表示。本文所使用術語"酮"由式A^(0)AZ表示，其中V和A'可獨立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基或雜芳基。本文所使用術語"疊氮化物"由式一N3表示。本文所使用術語"硝基"由式一N02表示。本文所使用術語"腈"由式一CN表示。本文所使用術語"曱硅烷基"由式一SiAH3表示，其中A1、^和A3可獨立地為氬或本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、烷氧基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基或雜芳基。本文所使用的術語"硫代-氧代"由式一S(0)A1、一S(0)A1、一OS(0)A1或一0S(0)20^表示，其中Ai可為氫或本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基，炔基、環炔基、芳基或雜芳基基團。整個說明書中，"S(O)"是S-O的縮寫符號。本文所使用術語"磺酰基"指的是由式一S(0)^表示的硫代-氧代基團，其中V可為氬或本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基，炔基、環炔基、芳基或雜芳基基團。本文所使用術語"砜"可由式^S(0)2^表示，其中Y和Ai可獨立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基、炔基、環炔基、芳基或雜芳基基團。本文所使用術語"亞砜，，由式^S(0)Ai表示，其中^和V可獨立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環烷基、鏈烯基、環烯基，炔基、環炔基、芳基或雜芳基基團。本文所使用術語"巰基"由式一SH表示。本文所使用"R1，，、"R2，，和"X"可獨立地具有上述一個或多個基團。例如，若R1為烷基基團，則所述烷基的氫原子之一任選可被羥基基團、烷氧基基團、烷基基團、鹵化物等所取代。根據所選擇的基團，第一個基團可摻入第二個基團之中，或者第一個基團可懸吊于(即連接)第二個基團之上。例如短語"含氨基的烷基"為氨基摻入烷基的骨架之中。或者，氨基可與烷基的骨架相連。所選基團的性質可確定第一個基團是嵌于第二個基團之中還是與"M目連。現將以所公開材料、化合物、組合物、物品和方法的具體方面為詳細參考，它們的實例將在所附實施例和附圖中闡述。方法和纟且合物本發明提供了一種增強可逆失活熱穩定酶類的再激活的方法。具體而言，所公開的方法涉及使用其特征在于下式1-6的含氮化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中每個X各自獨立地為CH、CR、N、0或S;并且每個R各自獨立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卣素基團。如本文所公開的那樣，可使用這些化合物(包括其混合物在內)來增強熱穩定可逆失活酶的再激活。在多個實例中，本文公開了用于增強熱穩定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括在含氮化合物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶。適用于本文的含氮化合物的具體實施例包括但不限于氮雜五元環。合適的氮雜五元環可包括具有式1的含氮五元環化合物，其中每個X各自獨立地為CH、CR或N,并且R可為H，取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卣素基團。在另一實例中，合適的氮雜五元環可包括具有式2的含氮五元環化合物，其中每個X各自獨立地為CH、CR、N、0或S，并且每個R可各自獨立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或鹵素基團。在另一實例中，每個X可各自獨立地為任意組合的CH或N。在又一實例中，合適的氮雜五元環可包括具有式3的含氮二環化合物，其中每個X可各自獨立地為CH、CR、N、0或S，并且每個R可各自獨立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團，羥基，，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或鹵素基團。本文還公開了增強熱穩定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式4的吡啶的化合物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中每個X可各自獨立地為CH、CR或N，并且R可為羥基、氮基、巰基或氨基烷基基團，或其衍生物。另外，本文公開了增強熱穩定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式5的N-氫氧化物的化合物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中每個R可各自獨立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團，或酰基基團或其衍生物。在又一實施例中，本文公開了增強熱穩定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式6的肼的化合物的存在下激活至少一種熱穩定可逆失活酶，R、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中每個R可各自獨立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團，或酰基基團或其衍生物。在又一實例中，本文公開了增強熱穩定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括在銨鹽的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶。銨鹽可為包含式+服4的帶正電荷氮類和帶負電荷的無機反荷離子、有機反荷離子、金屬氧化物反荷離子或金屬^物反荷離子反荷離子的任何化合物，所述式+NR4的帶正電荷氮類中每個R各自獨立地為H，取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或鹵素基團。銨鹽的合適帶正電荷氮類為肌和四烷基銨。銨鹽中合適的反荷離子可帶一個或多個負電荷。合適的反荷離子的實例包括但不限于無機反荷離子如卣素(如F—、C廠、Br—和r)、擬卣素(如SCN—和0CN—)、高氯酸根(cior)、氯酸根(CIO,)、亞氯酸根(C1(V)、次氯酸根(C1(T)、溴酸根(Br03)、高硤酸根(I(V)、硫離子(S2—)、硫酸根(SO,)、亞硫酸根(SO廣)、硫酸氫根(HS04—)、磷離子(P3—)、磷酸根(P043—)、磷酸氫根(HP042—)、磷酸二氫根(H2P04—)、亞磷酸根(PO。、氮離子(N3—)、硝酸根(NOO、亞硝酸根(NO廣)、氫氧根(0H—)、過氧根(022—)、六氟磷酸根(PF「)和高錳酸根(MnOO。合適的反荷離子的其它實例包括但不限于有機反荷離子例如碳酸根(C032—)、碳酸氫根(HC03—)、甲酸根(CH(V)、乙酸根(CH3C02—)和其它烷基羧酸根(RCO「，其中R為烷基，如丙酸根、丁酸才艮等)、草酸才艮(C20,)、酒石酸才艮和蘋果酸才艮(C4H4062—)、檸檬酸才艮(C6H5073—)和苯曱酸才艮(C6H5C02)。其它適合的反荷離子包括但不限于金屬氧化物和金屬絡合物。金屬氧化物和金屬絡合物的實例包括原釩酸根、鉬酸根(Mo力24)、六氰亞鐵酸根(FeCN6廣和硝酸鈰。本文公開的任何反荷離子可與本文公開的任何銨類聯合形成銨鹽。合適的銨鹽的一些具體實例包括但不限于氯化銨(NIW:i)、磷酸二氫銨(NH4H2P04)、磷酸氳二銨((麗4)2肝0》、(匪4)艮(NH4)4(Fe(CN)6)、醋酸銨(NH4CH3C02)、碳酸銨((NH4)2C03)、鉬酸銨(NH4Mo7024)、高氯酸銨(NH4C104)、檸檬酸銨((NH4)3C6H507)、苯曱酸銨(NH4C6H5C02)和磷酸銨((NH4)3P04)。應該理解的是，可對本文所公開的方法作一些調整。例如，若銨鹽的反荷離子可與反應中的Mg(其作為輔因子是酶所必需的)螯合，則該鹽對再激活也具有相同作用。但是，必須提高反應中的Mg濃度以補償反荷離子的螯合作用。同樣，若反荷離子對酶有抑制作用，則可優化濃度，使其既有效又沒有抑制作用。在一個具體方面，銨鹽可與本文所公開的任何氮雜五元環、嘧啶、N-羥胺或肼一起使用。正如下文更充分描述的那樣，本文所公開的銨鹽與本文所公開的任何其它含氮化合物一起使用可產生協同效應。本文所公開的方法中，本文所7>開的氮雜五元環、嘧啶、N-羥胺和肼存在的濃度可為從約0.5mM至約1M,例如約O.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、,45、50、55、60、65、,70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1000mM，其中任何指明的數值可形成某個范圍的上限或下限端點。對于銨鹽而言，銨類可為所列出的任何濃度。在某些實施例中，銨化合物并非擰檬酸銨、磷酸氫二銨、苯曱酸銨、碳酸銨或硫酸銨。所公開方法可應用到涉及核酸操作如擴增、連接、核酸外切或核酸內切反應，或核酸拓樸學發生改變的S^1反應的所有應用中，其中通過在升高的溫度下、在本文所述含氮化合物的存在下，在預定酶促反應之前孵育反應混合物或將此孵育作為預定酶促反應的一部分，從而使所述失活酶得以再激活。實施例下面給出以下實施例以闡述所公開主題的方法和結果。這些實施例無意于嚢括本文所公開主題的所有方面，而意在闡述代表性的方法和結果。這些實施例無意于排除對于本領域的技術人員而言顯而易見的本發明的等價方案和變化方案。對于數字(例如數量、溫度等)，已經努力確保其準確性，但應該考慮到會存在一些誤差和偏差。除非另有說明，份數為重量份數，溫度以x:為單位或者為環境溫度，壓力等于或接近大氣壓。反應條件例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和可用于使自所述方法獲得的產品純度和產量最優化的反應范圍和條件等可有很多變化和組合。優化這些過程條件僅需要合理且常規的實驗。作為對本發明進行舉例說明的模型體系，選擇了熱啟動PCR和兩種可商購的酶。由于兩種聚合酶由不同的化學修飾物所失活，因此這表現出本發明的屬間適應性。AmpliTaqGold(AppliedBiosystems)可通過4吏用二羧酸酐以化學方式失活，而HotStarTaq(QIAGEN)可通過l吏用甲醛以化學方式失活。選擇熱啟動PCR作為模型體系是基于如下理由(i)聚合酶鏈反應是廣泛使用的分子生物學手段，因此可闡述本發明的經濟價值；(ii)基于反應所固有的高效率，PCR是一個很好的模型體系，該模型可表明本發明所使用的物質并不會影響含有未修飾酶的反應，并且在反應中含有經化學修飾的酶時還能更進一步增強這類反應的效率。為容易地說明酶反應效率的提高，選擇了實時PCR。在實時PCR中，酶促反應可通過測量整個反應中的熒光信號而被連續監測。PCR反應期間可形成雙鏈DNA分子。通過^吏用僅選擇性結合dsDNA的SYBRGreenI熒光染料可檢測這些PCR產物。因此，熒光的增強表明PCR產物量的提高，由此表明包含在反應中的DM聚合酶的活性提高。一旦總的熒光相對于背景熒光信號顯著增強，則達到了所謂的CT值。因此，CT值是在反應中所含的酶活性的一個量度低CT值表明反應中存在的酶活性較高，高Ct佳表明反應中存在的酶活性較低。另外，另一個實施例示出通過產生的濃度依賴PCR產物產量對一種所選擇物質(三唑)進行的滴定測定及其對提高PCR中酶活性的作用。實施例1使用HotSUrTaqDNA聚合酶(QIAGEN)或AmpliTaqGold(A卯liedBiosystems)進行基于SYBRGreenI的PCR反應，同時使用未修飾的TaqDM聚合酶(QIAGEN)作為對照反應。每個反應含有0.625單位的各DNA聚合酶、各DNA聚合酶的1xPCR反應緩沖系、每種dNTP各200一、0.5一引物A:5，-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3，(SEQIDNO:1)、0.5jiM引物B:5，-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3，(SEQIDNO:2)、PCR級水，在測試含氮化合物的實例中，加入終濃度為100mM的三唑。每個反應包含作為擴增底物的10ng人基因組DNA。以在951C進行5分鐘酶激活步驟來開始PCR反應，隨后進行50個如下循環94T，15秒；60n，60秒。通過比較未添加三喳和添加100mM三哇的反應，可從三個重復反應中測定平均Ct但。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結果在使用TaqDNA聚合酶時，加入三唑對酶活性沒有影響，但是在使用經化學修飾的酶HotStarTaqDNA聚合酶和AmpliTaqGold時，含有三唑的反應表現出明顯較高的酶活性。實施例2在不存在三唑以及存在濃度遞增的三唑的情況下，進行了含有經化學修飾的HotStarTaqDNA聚合酶的、循環時間顯著縮短的快速PCR反應。每個PCR反應含有1.5單位HotStarTaqDNA聚合酶、10ng模;fclA基因組DM、每種dNTP各200—、Q.5—引物A:5，-CACACAGCGATGGCAGCTATGC-3，(SEQIDNO:3)、0.5引物B:5，-CCCAGTGATGGGCCAGCTC-3，(SEQIDNO:4)、PCR級水，并且在測試含氮化合物的實例中，加入終濃度為100mM、200mM、300mM、400mM和500mM的三峻。以在進行5分鐘酶激活步驟來開始PCR反應，隨后進行35個如下循環96匸，5秒；60°C，5秒和68X:，30秒。在1%TAE瓊脂糖凝膠上分析PCR產物(圖1)。結果不存在三唑的快速PCR顯示僅形成非特異性副產物，而即便是在快速循環PCR條件下，加入其中任一濃度的三唑均會顯著提高形成所需PCR產物的酶活性。實施例34吏用HotStarTaqDNA聚合酶(QIAGEN)進4亍基于SYBRGreenI的PCR反應，同時使用未修飾的TaqDNA聚合酶(QIAGEN)作為對照反應。每個反應(反應體積20jiL)含有不含HotStarTAQDNA聚合酶和(冊4)2304的QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix、1.0單位的各腿聚合酶和0.5MM引物A:5，-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3，(SEQIDNO:5)、0.5引物B:5，-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3，(SEQIDNO:6)、PCR級水，并且在測試含氨化合物的實例中，加入不同的氨化合物(氨化合物和濃度參見表)。每個反應含有作為擴增底物的10ng人基因組DNA。以在951C進行10分鐘(該時間較QIAGENQuantiTectSYBRGreen實驗規程中所述的時間短5分鐘)酶激活步驟來開始PCR反應，隨后進行40個如下循環94。C,15秒；551C，39秒和721C，40秒。通過比較未添加氨化合物和添加了不同濃度的氨化合物的反應，可從三個重復反應中測定平均CT值(氨化合物和濃度參見圖2)。結果在使用未修飾TaqDNA聚合酶時，添加氨化合物對酶活性沒有影響(或者在較高濃度時起抑制作用)，但是在使用經化學修飾的酶如HotStarTaqDNA聚合酶時，含有氨化合物的反應表現出明顯較高的酶活性。實施例4在不存在氯化銨(對照反應，0mM氯化銨)以及存在濃度遞增的氯化銨(最終反應混合物中的濃度為10、20和30mM)的情況下，進行了含有經化學修飾的HotStarTaqDNA聚合酶的、循環時間顯著縮短的快速PCR反應。每個PCR反應含有1.5單位HotStarTaqDNA聚合酶、10ng模板人或小鼠基因組DNA、每種dNTP各200一、每個不同PCR分析的各個引物各0.5(分析A,引物Al:5，-GCTTGAGCAACCTGGCTAAGATAGAGG-3,(SEQIDNO:7),引物A2:5，-GAGTTAGCAGGAGGCTGGATGCAGATG-3，(SEQIDNO:8);分析B,引物Bl:5'-CCACAATGGACATCACACAAGTGAG-3，(SEQIDNO:9)、引物B2:5，一GATCTTTCTGCCCAGATACCATTCG-3，(SEQIDNO:10);分析C,引物CI:5，-CCTTGCCTTAGATGTGTCGGCA-3，(SEQIDNO:11)、引物C2:5，-CCCAAACCCAACCCATACACAC-3，(SEQIDNO:12))以及PCR級水。以在95。C進行5分鐘酶激活步驟來開始PCR反應，隨后進行35個如下循環96°C,5秒；60C5秒和681C，30秒/kbPCR產物大小。在1%TAE瓊脂糖凝膠上分析PCR產物。M:DNA分子大小標記(ladder)(圖3)。結果與不含任何氨化合物的反應相比較，加入含量逐漸增加的氯化銨會引起經化學失活的酶的總體酶活性增加。實施例5為了證明氨化合物和氮雜五元環的組合物的協同累積效應，在存在20mM氯化銨、不存在三唑(對照反應0)和存在濃度遞增的三唑(最終反應混合物濃度為100、200、300、400和500mM)的情況下，進4亍了含有經化學修飾的HotStarTaqDNA聚合酶、循環時間顯著縮短的快速PCR反應。將實施例4所示的體系C選作模型體系。每個PCR反應含有1.5單位HotStarTaqDNA聚合酶、10ng模板人基因組DNA、每種dNTP各200^M、每種引物各0.5jiM,引物A:5，-CCTTGCCTTAGATGTGTCGGCA-3，(SEQIDNO:11)、引物B:5，-CCCAAACCCAACCCATACACAC-3，(SEQIDNO:12)和PCR級水。以在95C進行5分鐘酶激活步驟達來開始PCR反應，隨后進行35個如下循環96°C,5秒；60'C，5秒和68。C，45秒。在1%TAE瓊脂糖凝膠上對來自兩個重復反應的PCR產物進行分析。M:DNA分子大小標記。由于在PCR設置期間的操作錯誤，在200mM三唑存在下指示分析的反應未給出結果(圖4)。結果與僅含20mM氯化銨、不含三唑的反應相比較，三唑的加入表現出對經化學修飾酶的酶活性具有明顯益處。盡管在500mM的極高濃度時，三唑的作用開始變得不太顯著，但是該活性依然高于未加入三唑的反應中的酶活性。該實施例表明氨化合物和氮雜五元環的組合物可協同增強經化學修飾酶的酶活性。其它經測試但為表現出改進的化合物為C6H17NA(檸檬酸銨)、H9N204P(磷酸氬二銨)、C7H9N02(苯甲酸銨)、(NH4)2C03(碳酸銨)、(NH4)2S04(硫酸銨)。對于本領域技術人員顯而易見的是，只要不背離本發明的范圍和精神，可對本發明進行各種修改和變動。通過考慮本文所一&開發明的說明書和實施本文公開的發明，本發明的其他實施方案對本領域技術人員來說是顯而易見的。本說明書和實施例應僅看作示例性的，本發明真正的范圍和精神在所附的權利要求書中說明。序列表<110>Q工AGENGmbHDIRKL加FERTRALFPEISTPATRICKBAUMHOF<120>熱穩定可逆失活酶類再激活的增強<130>17140.0010CN1<140>Unassigned<141>2007_05_22<150>60/817,043<151>2006-06-28<150>60/852,804<151〉2006_10_19<160>12<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序歹!j<220><223>人工序列的描述；注=合成構建體<400〉1gtcaccttcaccgttccagt20<210〉2<211>20<212>DNA<213〉人工序歹U<220><223>人工序列的描述；注=合成構建體<400>2ctcttccsgccttccttcct20<210〉3<211>22<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>人T.序列的描述；注=合成構建體<400>3C3C3C3gcg3tggcsgct3tgc22<210><211><212><213><220>419DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構建體<400>4cccagtgatgggccagctc19<210><212><213><220><223>520DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構建體<400>5gtcaccttcaccgttccagt20<210><211><212〉<213>620DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構建體<400〉6ctcttccsgccttccttcct20<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述；注=合成構建體<400>7gcttgsgcsscctggctssgatsgsgg27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>人工序列的描述；注=合成構建體<400>8gagttagcaggaggctggatgcagatg27<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>人工序列的描述；注=合成構建體<400>9ccacaatggacatcacacaagtgag<210><211><212><213><220><223>1025DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構建體<400>10gatctttctgcccagataccattcg<210><211><212><213><220><223>1122DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構建體<400>11ccttgccttagatgtgtcggca<210><212><213><220><223>1222DNA人工序列人T序列的描述；注=合成構建體<400>12CCC333CCC33CCC3t3C3C3C2525222權利要求1.一種使熱穩定可逆失活酶的再激活增強的方法，包括在氮雜五元環的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶。2.權利要求1的方法，其中所述氮雜五元環包括具有式1的含氮五元環化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中每個X各自獨立地為CH、CR或N;并且R為H，取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷M^l芳基，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯,磺酸，醚或卣素基團。3.權利要求1的方法，其中所述氮雜五元環包括具有式2的含氮五元環化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中每個X各自獨立地為CH、CR、N、0或S;并且每個R各自獨立地為H,:^代的或未^c代的絲、,基、姊、烷IU^l芳基，鞋基，絲，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或囟素基團。4.權利要求3的方法，其中每個X各自獨立地為任意組合的CH或N。5.權利要求1的方法，其中所述氮雜五元環包括具有式3的含氮二環化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中每個X各自獨立地為CH、CR、N、0或S;并且每個R各自獨立地合物6.7.8.9.10.11.12.13.為H,取代的或未取代的烷基、^#基、炔基、烷M^芳基，羥基，絲，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或面素基團。權利要求1的方法，其中絲銨鹽的存在下進行再激活。權利要求1的方法，其中所述氮雜五元環的濃度約2inM至約1M。權利要求1的方法，其中所述氮雜五元環的濃度為0.5慮至約0.5M。一種增強熱穩定可逆失活酶再激活的方法，包括在具有式4的吡咬4^物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中每個X各自獨立地為CH、CR或N;并且R為羥基、氨基、Sii^絲錄基團。權利要求9的方法，其中i^E銨鹽的存在下進行再激活。權利要求9的方法，其中所述p比咬化合物的濃度為約2mM至約lM。權利要求9的方法，其中所述他咬化^的濃度為約0.5mM至約0.5M。一種增強熱穩定可逆失活酶再激活的方法，包括在包括具有式5的N-氫氧化物的化合物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式5其中每個R各自獨立地為H，^L代的或未:lL代的;^、,基、g、烷l^芳基，或iti^其衍生物。14.權利要求13的方法，其中絲銨鹽的存在下進行再激活。15.權利要求13的方法，其中所述N-氫氧化物化合物的濃度為約2mM至約1M。16.權利要求13的方法，其中所述N-氫氧化物化^的濃度為約0.5mM至約0.5M。17.—種增強熱穩定可逆失活酶再激活的方法，包括在包括具有式6的肼的化合物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式6其中每個R各自獨立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷|1芳基，或ittil^^f生物。18.權利要求17的方法，其中M銨鹽的存在下進行再激活。19.權利要求17的方法，其中所i^JM匕合物的濃度為約2mM至約lM。20.權利要求17的方法，其中所^4^物的濃度為約0.5慮至約0.5M。21.—種增強熱穩定可逆失活酶再激活的方法，包括在包括銨鹽的化^的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶。22.權利要求21的方法，其中所述銨鹽包括無機反荷離子、有機Jl荷離子、金屬氧化物反荷離子或4，屬復^^^荷離子。23.權利要求21的方法，其中所述銨鹽的濃度為約2mM至約lM。24.權利要求21的方法，其中所述銨鹽的濃度為約0.5mM至約0.5M。25.—種試劑盒，含有至少一種熱穩定可逆失活酶和至少一種選自下列的化合物具有式l、式2或式3的氮雜五元環、具有式4的吡啶、具有式5的N-氫氧/f匕物或具有式6的肼，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中每個X各自獨立地為CH、CR、N、0或S;并且每個R各自獨立地為H，^代的或未^^代的絲、^)^基、錄、烷M^芳基，羥基，絲，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或囟素基團。全文摘要公開了增強熱穩定可逆失活酶再激活的方法，包括在一種或多種含氮化合物的存在下再激活至少一種熱穩定可逆失活酶。文檔編號C12N9/96GK101100662SQ200710123109公開日2008年1月9日申請日期2007年6月28日優先權日2006年6月28日發明者D·羅福特,P·鮑姆霍夫,R·派斯特申請人:奇亞根有限公司