專利名稱：：副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法
技術領域：
：本發明是一種對副干酪乳桿菌產生的抗菌肽進行分離和純化的方法。
背景技術：
：目前抗菌肽的潛在應用價值受到了國內外學者的廣泛關注，現已成為生命科學領域的一個研究熱點。
發明內容本發明的目的是提供一種本專利通過一系列分離手段的實施，從副干酪乳桿菌體內分離純化出具有抑菌活性的抗菌肽。上述的目的通過以下的技術方案實現副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其組成包括選取副干酪乳桿菌a"cto^i7/"s/mracflw')，制作培養基，其特征是利用最高產肽方式發酵獲得的發酵液在離心力10,000克，離心，冷藏并分離，發酵原液為陽離子交換層析的樣品；經陽離子交換層析并過積累濃縮，使用超濾離心管在冷凍低溫高速離心超濾除鹽，同時收集流出液和保留液，將保留液通過分離純化；高效液相色譜HPLC;采用蛋白濃縮試劑盒對樣品進行濃縮，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，12-垸基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE對分離到抗菌肽進行分子量估測，基質輔助激光解吸飛行時間質譜MOLDI-TOF-MS和串聯質譜Q-TOF2實驗測定氨基酸序列。所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，所述的制作培養基包括a.將20毫升水瓊脂倒入12厘米平板，作為下層培養基，待凝固后擺牛津杯；b.將新鮮的枯草芽胞桿菌及s"6制成菌懸液107菌落形成單位/毫升)混入30毫升牛肉膏培養基(0.75%瓊脂)中，倒在水瓊脂上，作為上層培養基；c.待上層培養基凝固后，輕輕的將牛津杯垂直拔出，在平板底部做好標記；d.用移液槍取120微升樣品(分別為發酵上清液，濃縮10倍的發酵上清液，過柱后各餾分濃縮樣，對應濃度的樣品緩沖液)垂直點樣孔點樣；e.將平板在4'C正置30分鐘，以使待檢樣品充分滲透進入培養基內，然后移入37'C培養箱中，正置培養16小時后測量抑菌圈大小，拍照。所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，所述的陽離子交換層析包括以下步驟a.離子交換介質處理；b.裝柱與平衡；C.上樣；d.洗脫a.離子交換介質的處理將弱陽離子交換樹脂CMSepharoseFF原包裝置于室溫下，使其溫度與室溫相同，由于CMSepharoseFF儲存于20X甲醇溶液中，需將甲醇溶液傾出，再用平衡緩沖液(0.05摩爾乙酸銨，pH6.0)代替，達到總體積32.5毫升(75XCMSepharoseFF;25%0.05M乙酸銨，pH6.0)。b.裝柱與平衡取一只層析柱(16亳米x200毫米)，先裝入l/4高度、0.05M乙酸銨緩沖液(pH6.0)，止住其流出，將上述處理好的CMS印haroseFF裝入柱內，等其完全沉淀后，放開下端流出口，以同一緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，流速控制在10毫升/分鐘，等流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，即可上樣分離；c.上樣將離心后的發酵液上清原液上樣，流速為3毫升/分鐘至飽和，上樣量約70毫升，然后用上述平衡緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定為止；d.洗脫層析柱流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，用0.05M1M乙酸銨pH6.0以1毫升/分鐘梯度洗脫(分管收集)，此時采用自動收集器定時收集餾分。所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，所述的凝膠層析系統包括以下步驟a.凝膠介質的選擇及溶脹；b.裝柱；C.上樣；d.洗脫a.凝膠介質的選擇及溶脹選擇顆粒均一，雜質含量低的凝膠介質，本實驗選擇的為葡聚糖凝膠層析SephadexG-50/G-25/G-10:稱取25克g凝膠干粉放入500毫升燒杯中，加入0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液(510倍體積)，在沸水浴中熱溶漲12小時，冷卻至室溫后，抽真空或髙壓滅菌脫去凝膠中殘留的空氣，備用；b.裝柱取一直長度為100厘米，內徑為1厘米的層析柱。洗凈，在柱的下端用夾子夾住，向柱內裝入1/4左右柱床體積的0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液，然后把溶漲處理好的凝膠濃漿，一次裝入層析柱內，使凝膠慢慢沉降，當凝膠沉降至柱床高度的1/2時，打開下端，然后用0.05M乙酸銨(pH6.0)以葡聚糖凝膠層析，0.8毫升/分鐘(S叩hadexG-25/G-50)或0.5毫升/分鐘(SephadexG-10)流速流動平衡；c.上樣擰開柱上端的螺旋帽，待柱內的緩沖液下降至與凝膠表面相切。取適當體積的上一步驟分離到的有活性的餾分濃縮樣品(3mLCMSepharoseFF分離餾分；2mLSephadexG-50/G-25分離餾分)溶液沿著管壁小心加在膠上面，用緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全進入凝膠，再加入幾毫升緩沖液，然后擰緊柱上端的螺旋帽接口并與儲液瓶連接，柱的出口端與紫外檢測儀和自動收集器相連；d.洗脫在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG-10)的流速用0.05M乙酸銨(pH6.0)進行洗脫，采用自動收集器收集，待層析結束后，合并高峰管以內的各管收集液。將過SephadexG-10的活性峰餾分收集并濃縮后，用超濾柱除鹽，進一步用HPLC分離純化。所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，所述的HPLC操作步驟如下a.向貯液瓶中倒入足夠當天操作用的溶劑，不同體積比的水一乙腈，并注意溶劑預先過濾并脫氣；b.紫外可見檢測儀應預熱30分鐘后，打開Waters公司生產的泵開關以及系統電源；c.向泵中充入新鮮溶劑水乙腈；d.沖洗儀器1.將泵出口管導至廢液瓶；2.將流量設在5毫升/分鐘，沖洗2分鐘，若色譜柱以前使用過，則至少要使30毫升溶劑通過此柱；3。設定分析條件；e.進樣1.將卡住插塞的手柄扳至開位置，取下插塞；2.用微量進樣器把所需體積的樣品充入進樣器中，插入插塞，并將卡住插塞的手柄板至關閉位置；3.將進樣注射手柄板至注射位置；f.記錄色譜圖，打印色譜經過對同類物質HPLC條件分析和摸索設定如下流動相系統表1副干酪乳桿菌抑菌肽類物質分離所用HPLC體系(上樣量15pL)線性梯度AB運行時間30min，40min(5%乙腈水)(80%乙腈水)0100%0%20/300%100%21/31100%0%本發明使用的菌種畐'J干酷乳桿菌(Zflrcto6fla7/ws/wwvicflwe/)。種子培養基大豆蛋白胨10克(g),牛肉膏10g，酵母提取物5g,D(+)G(D)(D(+)葡萄糖)20g，K2HP04(磷酸氫二鉀)2g，Na2S03(亞硫酸鈉)O.lg，NaAc(醋酸鈉)5g，MgS04(硫酸鎂)0.2g，MnS04(硫酸錳)0.05g，檸檬酸銨2g，吐溫801亳升(mL)，水lOOOmL，調pH5.5,121攝氏度(°C)滅菌15分鐘(min)。發酵培養基大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g,酵母提取物5g，K2HP042g，Na2S03O.lg，NaAc5g,MgS040.2g，MnSO40.05g，檸檬酸銨2g，吐溫801mL，水1000mL，調pH5.5，121。C滅菌15min。這個技術方案有以下有益效果-通過本發明，成功分離得到了副干酪乳桿菌的抗菌肽。抗菌肽(antibacterialpeptides,ABP)廣義上是指廣泛存在于生物體內具有抵御外界微生物侵害，清除體內突變細胞的一類小分子多肽，是生物天然的、非特異性防御系統的重要組成部分。這種小分子多肽氨基酸數目小于IOO，常帶正電荷。天然抗菌肽廣泛分布在細菌、病毒以及動植物等各種生物體內31。由于其具有相對分子質量小、對熱穩定、水溶性好和抗菌譜廣等特點，以及不同于抗生素的全新的抗菌機制。利用本發明成功的分理處抗菌肽，為抗菌肽，及其抗菌肽技術在人們生活和醫藥、農業等領域的進一步發展奠定了基礎。附圖l是CMSepharoseFF(弱陽離子交換樹脂)離子交換層析譜圖。附圖2是SephadexG-50(葡聚糖凝膠層析填料G-50)層析譜圖。附圖3是S印hadexG-25(葡聚糖凝膠層析填料G-25)層析譜圖緩沖液流速0.8mL/min。附圖4是SephadexG-10(葡聚糖凝膠層析填料G-10)層析譜圖。附圖5是S印hadexG-10洗脫峰II譜圖具體實施例方式實施例l:副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其組成包括選取副干酪乳桿菌(Z(K^M"7/附/;tfmawe/)，制作培養基，利用最高產肽方式發酵獲得的發酵液在10，000g，離心，冷藏并分離，發酵原液為陽離子交換層析的樣品；經陽離子交換層析并過積累濃縮，使用超濾離心管在冷凍低溫高速離心超濾除鹽，同時收集流出液和保留液，將保留液通過分離純化；HPLC;采用蛋白濃縮試劑盒對樣品進行濃縮，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE對分離到抗菌肽進行分子量估測，MOLDI-TOF-MS和Q-TOF2實驗測定氨基酸序列。本發明使用的菌種副干酪乳桿菌(丄acto6flc/〃MS/wimawe/)。保藏在CCTCC保藏號M205015保藏日期20050205保藏存活證明在200510009788.3肽類天然微生物防腐劑產生菌及應用和防腐劑的制備方法專利申請案巻中。種子培養基大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，D(+)G20g，K2HP042g，Na2SO30.1g，NaAc5g，MgS040.2g，MnSO40.05g，檸檬酸銨2g,吐溫801mL，水1000mL，調pH5.5，121'C滅菌15min。發酵培養基大豆蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HP042g，Na2S03O.lg，NaAc5g，MgS040.2g,MnSO40.05g,擰檬酸銨2g，吐溫801mL，水lOOOmL，調pH5.5，121。C滅菌15min。實施例2:以上實施例所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法中，所述的制作培養基包括a.將20ml水瓊脂倒入12厘米平板，作為下層培養基，待凝固后擺牛津杯；b.將新鮮的枯草芽胞桿菌As"6(以下簡稱5.s"Z0制成菌懸液107cfti/mL(菌落形成單位/毫升的縮寫)混入30mL牛肉膏培養基(0.75%瓊脂)中，倒在水瓊脂上，作為上層培養基；c.待上層培養基凝固后，輕輕的將牛津杯垂直拔出，在平板底部做好標記；d.用移液槍取120微升(fiL)樣品(分別為發酵上清液，濃縮10倍的發酵上清液，過柱后各餾分濃縮樣，對應濃度的樣品緩沖液)垂直點樣孔點樣；e.將平板在(C正置30min，以使待檢樣品充分滲透進入培養基內，然后移入37'C培養箱中，正置培養16小時后測量抑菌圈大小，拍照。實施例3:以上實施例所述的所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法中，所述的陽離子交換層析包括以下步驟a.離子交換介質處理；b,裝柱與平衡；C.上樣；d.洗脫a.離子交換介質的處理將CMSepharoseFF原包裝置于室溫下，使其溫度與室溫相同，由于CMS印haroseFF儲存于20X甲醇溶液中，需將甲醇溶液傾出，再用平衡緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)代替，達到總體積32.5mL(75%CMSepharoseFF;25%0.05M乙酸銨，pH6.0)。b.裝柱與平衡取一只層析柱(16毫米x200毫米)，先裝入l/4高度、0.05M乙酸銨緩沖液(pH6.0),止住其流出，將上述處理好的CMSepharoseFF裝入柱內，等其完全沉淀后，放開下端流出口，以同一緩沖液(0.05摩爾(M)乙酸銨，pH6.0)平衡，流速控制在10毫升/分鐘(以下標記為mL/min)，11等流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，即可上樣分離；c.上樣將離心后的發酵液上清原液上樣，流速為3mL/min至飽和，上樣量約70mL，然后用上述平衡緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定為止；d.洗脫層析柱流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，用0.05M1M乙酸銨pH6.0以lmL/min梯度洗脫(分管收集)，此時采用自動收集器定時收集餾分。實施例4:以上實施例所述的所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法中，所述的凝膠層析系統包括以下步驟a.凝膠介質的選擇及溶脹；b.裝柱；C.上樣；d.洗脫a.凝膠介質的選擇及溶脹選擇顆粒均一，雜質含量低的凝膠介質，本實驗選擇的為SephadexG-50/G-25/G-10:稱取25g凝膠干粉放入500mL燒杯中，加入0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液(510倍體積)，在沸水浴中熱溶漲12h,冷卻至室溫后，抽真空或髙壓滅菌脫去凝膠中殘留的空氣，備用；b.裝柱取一直長度為100cm，內徑為lcm的層析柱。洗凈，在柱的下端用夾子夾住，向柱內裝入1Z4左右柱床體積的0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液，然后把溶漲處理好的凝膠濃漿，一次裝入層析柱內，使凝膠慢慢沉降，當凝膠沉降至柱床高度的1/2時，打開下端，然后用0.05M乙酸銨(pH6.0)W0.8mL/min(SephadexG-25/G-50)或0.5mL/mm(SephadexG-10)流速流動平衡；C.上樣擰開柱上端的螺旋帽，待柱內的緩沖液下降至與凝膠表面相切。取適當體積的上一步驟分離到的有活性的餾分濃縮樣品(3mLCMSepharoseFF分離餾分；2mLSephadexG-50/G-25分離餾分)溶液沿著管壁小心加在膠上面，用緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全進入凝膠，再加入幾毫升緩沖液，然后擰緊柱上端的螺旋帽接口并與儲液瓶連接，12柱的出口端與紫外檢測儀和自動收集器相連；d.洗脫在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG畫IO)的流速用0.05M乙酸銨(pH6.0)進行洗脫，采用自動收集器收集，待層析結束后，合并高峰管以內的各管收集液。將過SephadexG-10的活性峰餾分收集并濃縮后，用超濾柱除鹽，進一步用HPLC分離純化。實施例5:以上實施例所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法中，所述的HPLC操作步驟如下意溶劑預先過濾并脫氣。)b.打開Waters泵開關以及系統電源。(注意紫外可見檢測儀應預熱30min)。c.向泵中充入新鮮溶劑(水乙腈)d.沖洗儀器1.將泵出口管導至廢液瓶。2.將流量設在5mL/min，沖洗2min。若色譜柱以前使用過，則至少要使30mL溶劑通過此柱。設定分析條件，例如:流速，檢測波長等。e.進樣1.將卡住插塞的手柄扳至開位置，取下插塞。2.用微量進樣器把所需體積的樣品充入進樣器中，插入插塞，并將卡住插塞的手柄板至關閉位置。3.將進樣注射手柄板至注射位置。f.記錄色譜圖，打印色譜圖。—經過對同類物質HPLC條件分析和摸索設定如下流動相系統表l副干酪乳桿菌抑菌肽類物質分離所用HPLC體系(上樣量15pL)Table.2誦lThesystemofHPLC線性梯度^^~運行時間30min，40min(5%乙腈水)(80%乙腈水)0100%0%20/300%100%21/31100%0%實施例6:一種副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，包括1、副干酪乳桿菌產生的抗菌肽抑菌方法的確定a.將20ml水瓊脂倒入12cm平板，作為下層培養基，待凝固后擺牛津杯；b.將新鮮的fi.s"6制成菌懸液10、fu/mL混入30mL牛肉膏培養基(0.75%瓊脂)中，倒在水瓊脂上，作為上層培養基；c.待上層培養基凝固后，輕輕的將牛津杯垂直拔出，在平板底部做好標記；d.用移液槍取12(HiL樣品(分別為發酵上清液，濃縮10倍的發酵上清液，過柱后各餾分濃縮樣，對應濃度的樣品緩沖液)垂直點樣孔點樣；e.將平板在4'C正置30min，以使待檢樣品充分滲透進入培養基內，然后移入37'C培養箱中，正置培養16h后測量抑菌圈大小，拍照。2、抗菌肽的分離純化方法2.1陽離子交換層析利用最高產肽方式發酵獲得的發酵液在10，000g，4'C離心10min后，于4'C冷藏并盡快進行分離，發酵原液作為陽離子交換層析的樣品。陽離子交換層析系統包括以下6個步驟a.離子交換介質處理；b.裝柱與平衡；C.上樣；d.洗脫；e.離子交換柱的再生；f.離子交換介質的再生。a.離子交換介質的處理將CMS印haroseFF原包裝置于室溫下，使其溫度與室溫相同，由于CMSepharoseFF儲存于20X甲醇溶液中，需將甲醇溶液傾出，再用平衡緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6,0)代替，達到總體積32.5mL(75XCMS印haroseFF;25%0.05M乙酸銨，pH6.0)。b.裝柱與平衡取一只層析柱(16mmx200mm),先裝入l/4高度、0.05M乙酸銨緩沖液(pH6.0),止住其流出，將上述處理好的CMSepharoseFF裝入柱內，等其完全沉淀后，放開下端流出口，以同一緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，流速控制在10mL/min,等流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，即可上樣分離。c.上樣將離心后的發酵液上清原液上樣，流速為3mL/min至飽和，上樣量約70mL，然后用上述平衡緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定為止。d.洗脫層析柱流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，用0.05M1M乙酸銨pH6.0以lmL/min梯度洗脫(分管收集)，此時采用自動收集器定時收集餾分。e.離子交換柱的再生當結束洗脫后，用0.05M乙酸銨(含12MNaCl，pH6.0)再生液以10mL/min流速沖洗層析柱，流量為100200mL，再生交換柱，然后此再生后的交換柱可以繼續進行下一輪的洗脫。f.離子交換介質的再生當進行多次洗脫后，須將交換介質進行再生。先將離子交換柱再生(步驟e)，再用lMNaOH以1.3mL/min沖洗柱子，流量為100mL，最后用70%甲醇溶液以同樣速度沖洗柱子，流量為80mL。用前再用100mL0.05M乙酸銨(pH6.0)沖洗，即可達到重復使用的要求。2.2凝膠層析經陽離子交換層析得到的有抑菌活性的餾分通過積累濃縮，首先通過SephadexG-50層析分離，之后將收集到的具抑菌活性的餾分通過S印hadexG畫25進行再次分離，由于收集到的SephadexG-25洗脫峰I經多次濃縮得到，樣液中含鹽量較高，使用超濾離心管UFC(產品編號)卯0508在冷凍低溫高速離心機4'C，4000g離心30min超濾除鹽，同時收集流出液和保留液，將保留液通過SephadexG-10凝膠層析柱進一步分離純化。凝膠層析系統包括以下4個步驟a.凝膠介質的選擇及溶脹；b.裝柱；C.上樣；d.洗脫。a.凝膠介質的選擇及溶脹選擇顆粒均一，雜質含量低的凝膠介質，本實驗選擇的為S印hadexG-50/G-25/G-10。稱取25g凝膠干粉放入500mL燒杯中，加入0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液(510倍體積)，在沸水浴中熱溶漲12h，冷卻至室溫后，抽真空或高壓滅菌脫去凝膠中殘留的空氣，備用。b.裝柱取一直長度為100cm，內徑為lcm的層析柱。洗凈，在柱的下端用夾子夾住，向柱內裝入1/4左右柱床體積的0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液，然后把溶漲處理好的凝膠濃漿，一次裝入層析柱內，使凝膠慢慢沉降，當凝膠沉降至柱床高度的l/2時，打開下端，然后用0.05M乙酸銨(pH6.0)以0.8mL/min(SephadexG-25/G-50)或0.5mL/min(SephadexG-10)流速流動平衡。C.上樣擰開柱上端的螺旋帽，待柱內的緩沖液下降至與凝膠表面相切。取適當體積的上一步驟分離到的有活性的餾分濃縮樣品(3mLCMSepharoseFF分離餾分；2mLSephadexG-50/G-25分離餾分)溶液沿著管壁小心加在膠上面，用緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全進入凝膠，再加入幾毫升緩沖液，然后擰緊柱上端的螺旋帽接口并與儲液瓶連接，柱的出口端與紫外檢測儀和自動收集器相連。d.洗脫在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG-10)的流速用0.05M乙酸銨(pH6.0)進行洗脫，采用自動收集器收集，待層析結束后，合并高峰管以內的各管收集液。將過SephadexG-10的活性峰餾分收集并濃縮后，用超濾柱除鹽，進一步用HPLC分離純化。2.3HPLC選擇Waters公司的HPLC系統，該系統包括Waters510HPLCpump(沃特斯510高效液相色譜泵)，WatersTM996PhotodiodeArrayDetector(沃特斯996紫外檢測器)，Delta-PakC18300A5jim3.9x150mmHPLCColumn(Delta-PakTMC18300A(埃)5jim(微米)3.9x150mm(毫米)高效液相色譜柱)。HPLC操作步驟如下a.向貯液瓶中倒入足夠當天操作用的溶劑(不同體積比的水一乙腈)。(注意溶劑預先過濾并脫氣。)b.打開Waters泵開關以及系統電源。(注意紫外可見檢測儀應預熱30min)。c.向泵中充入新鮮溶劑(水乙腈)d.沖洗儀器1.將泵出口管導至廢液瓶。2.將流量設在5mL/min，沖洗2mhi。若色譜柱以前使用過，則至少要使30mL溶劑通過此柱。設定分析條件，例如:流速，檢測波長等。e.進樣1.將卡住插塞的手柄扳至開位置，取下插塞。2.用微量進樣器把所需體積的樣品充入進樣器中，插入插塞，并將卡住插塞的手柄板至關閉位置。3.將進樣注射手柄板至注射位置。f.記錄色譜圖，打印色譜圖。g.結束工作1.若流動相為酸和堿，用蒸餾水先沖洗至中性。2.1000%甲醇或乙腈洗至吸光度穩定，約半小時。h.關機。經過對同類物質HPLC條件分析和摸索設定如下流動相系統表l副干酪乳桿菌抑菌肽類物質分離所用HPLC體系(上樣量15jiL)"""^"""*線性梯度"~"~"~~~~運行時間30min，40min(5%乙腈水)(80%乙腈水)20/300%100%21/31100%0%2.4抗菌肽的分離純化結果本專利采用蛋白濃縮試劑盒對樣品進行濃縮，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE對分離到抗菌肽進行分子量估測。MOLDI-TOF-MS和Q-TOF2實驗測定氨基酸序列。2.5抗菌肽的分離結果經過如上方法的分離，由副干酪乳桿菌產生的抗菌肽得到良好的分離。CMS印haroseFF陽離子交換層析得到一個活性峰，見圖1。繼續用S印hadexG-50凝膠層析也得到一個活性峰，見圖2;在S叩hadexG-25層析過程中，累積濃縮后通過蛋白質濃度測定得到峰II蛋白質含量極低判定其大部分為鹽分子，而峰I蛋白含量較高，且有抑菌效果，見圖3。用G25峰II餾分過G—10后，得到5個峰，只有峰2有明顯的抑菌效果，見圖4。對G-10峰2進一步用HPLC檢測分析表明，其具有單一組份，也是我們所獲得的組份。見圖5。對各個分離步驟的抗菌肽進行蛋白濃度的檢測結果見表2。表2蛋白質濃度步驟體積(mL')總蛋白(g/L)產率(％)發酵液上清原液700.108100%CMSepharoseFF0.03362.22%洗脫峰SephadexG-500.03152.08%SephadexG-25洗脫30.03081.22%峰ISephadexG-10洗脫10.01100.145%峰n隨著洗脫步驟的增多，蛋白含量在逐漸減少。從而也分析出得到的抑菌物質18在發酵液上清中的含量是0.145%。說明此菌株雖然產抗菌肽含量不高，但其具有的抑菌活性卻可在食品生產保藏中起到很強的抑菌作用。如對菌株進行改良，發酵條件進一步優化，提高其抗菌肽產量，將有望應用于食品防腐。經過電噴霧質譜(MOLDI-TOF-Ms和Q-TOF2)測定，該肽段質荷比為746.88的肽段序列為KSGYQCGFDEVFL，相對分子質量是1491.7444Da(道爾頓)。權利要求1.一種副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其組成包括選取副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，制作培養基，其特征是利用最高產肽方式發酵獲得的發酵液在離心力10,000克，離心，冷藏并分離，發酵原液為陽離子交換層析的樣品；經陽離子交換層析并過積累濃縮，使用超濾離心管在冷凍低溫高速離心超濾除鹽，同時收集流出液和保留液，將保留液通過分離純化；高效液相色譜HPLC；采用蛋白濃縮試劑盒對樣品進行濃縮，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，12-烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE對分離到抗菌肽進行分子量估測，基質輔助激光解吸飛行時間質譜MOLDI-TOF-MS和串聯質譜Q-TOF2實驗測定氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其特征是所述的制作培養基包括a.將20毫升水瓊脂倒入12厘米平板，作為下層培養基，待凝固后擺牛津杯；b.將新鮮的枯草芽胞桿菌fi.s"6制成菌懸液107菌落形成單位/毫升)混入30毫升牛肉膏培養基(0.75%瓊脂)中，倒在水瓊脂上，作為上層培養基；c.待上層培養基凝固后，輕輕的將牛津杯垂直拔出，在平板底部做好標記；d.用移液槍取120微升樣品(分別為發酵上清液，濃縮10倍的發酵上清液，過柱后各餾分濃縮樣，對應濃度的樣品緩沖液)垂直點樣孔點樣；e.將平板在4'C正置30分鐘，以使待檢樣品充分滲透進入培養基內，然后移入37'C培養箱中，正置培養16小時后測量抑菌圈大小，拍照。3.根據權利要求1或2所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其特征是所述的陽離子交換層析包括以下步驟a.離子交換介質處理；b.裝柱與平衡；C.上樣；d.洗脫a.離子交換介質的處理將弱陽離子交換樹脂CMSepharoseFF原包裝置于室溫下，使其溫度與室溫相同，由于CMSepharoseFF儲存于20X甲醇溶液中，需將甲醇溶液傾出，再用平衡緩沖液(0.05摩爾乙酸銨，pH6.0)代替，達到總體積32.5毫升(75%CMSepharoseFF;25%0.05M乙酸銨，pH6.0)。b.裝柱與平衡取一只層析柱(16毫米x200毫米)，先裝入l/4高度、0.05M乙酸銨緩沖液(pH6.0)，止住其流出，將上述處理好的CMSepharoseFF裝入柱內，等其完全沉淀后，放開下端流出口，以同一緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，流速控制在10毫升/分鐘，等流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，即可上樣分離；c.上樣將離心后的發酵液上清原液上樣，流速為3毫升/分鐘至飽和，上樣量約70毫升，然后用上述平衡緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)平衡，洗去未被吸附的蛋白，直到流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定為止；d.洗脫層析柱流出液在核酸蛋白質檢測儀上繪出的基線穩定后，用0.05M1M乙酸銨pH6.0以1毫升/分鐘梯度洗脫(分管收集)，此時采用自動收集器定時收集餾分。4.根據權利要求1或2或3所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其特征是所述的凝膠層析系統包括以下步驟a.凝膠介質的選擇及溶脹；b.裝柱；C.上樣；d.洗脫a.凝膠介質的選擇及溶脹選擇顆粒均一，雜質含量低的凝膠介質，本實驗選擇的為葡聚糖凝膠層析SephadexG-50/G-25/G-10:稱取25克g凝膠干粉放入500毫升燒杯中，加入0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液(510倍體積)，在沸水浴中熱溶漲12小時，冷卻至室溫后，抽真空或高壓滅菌脫去凝膠中殘留的空氣，備用；b.裝柱取一直長度為100厘米，內徑為1厘米的層析柱。洗凈，在柱的下端用夾子夾住，向柱內裝入1/4左右柱床體積的0.05M乙酸銨(pH6.0)緩沖液，然后把溶漲處理好的凝膠濃漿，一次裝入層析柱內，使凝膠慢慢沉降，當凝膠沉降至柱床高度的1/2時，打開下端，然后用0.05M乙酸銨(pH6.0)以葡聚糖凝膠層析，0.8毫升/分鐘(SephadexG-25/G-50)或0.5毫升/分鐘(S印hadexG-lO)流速流動平衡；c.上樣擰開柱上端的螺旋帽，待柱內的緩沖液下降至與凝膠表面相切。取適當體積的上一步驟分離到的有活性的餾分濃縮樣品(3mLCMSepharoseFF分離餾分；2mLSephadexG-50/G-25分離餾分)溶液沿著管壁小心加在膠上面，用緩沖液(0.05M乙酸銨，pH6.0)沿管壁洗一次，等溶液完全進入凝膠，再加入幾毫升緩沖液，然后擰緊柱上端的螺旋帽接口并與儲液瓶連接，柱的出口端與紫外檢測儀和自動收集器相連；d.洗脫在恒流泵的作用下以0.8mL/min(SephadexG-50/G-25)和0.5mL/min(SephadexG-10)的流速用0.05M乙酸銨(pH6.0)進行洗脫，采用自動收集器收集，待層析結束后，合并高峰管以內的各管收集液。將過SephadexG-10的活性峰餾分收集并濃縮后，用超濾柱除鹽，進一步用HPLC分離純化。5.根據權利要求1或2或4或3所述的副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法，其特征是所述的HPLC操作步驟如下a.向貯液瓶中倒入足夠當天操作用的溶劑，不同體積比的水一乙腈，并注意溶劑預先過濾并脫氣；b.紫外可見檢測儀應預熱30分鐘后，打開Waters公司生產的泵開關以及系統電源；c.向泵中充入新鮮溶劑水乙腈；d.沖洗儀器1.將泵出口管導至廢液瓶；2.將流量設在5毫升/分鐘，沖洗2分鐘，若色譜柱以前使用過，則至少要使30毫升溶劑通過此柱；3。設定分析條件；e.進樣1.將卡住插塞的手柄扳至開位置，取下插塞；2.用微量進樣器把所需體積的樣品充入進樣器中，插入插塞，并將卡住插塞的手柄板至關閉位置；3.將進樣注射手柄板至注射位置；f.記錄色譜圖，打印色譜圖；經過對同類物質HPLC條件分析和摸索設定如下流動相系統表l副干酪乳桿菌抑菌肽類物質分離所用HPLC體系(上樣量15jiL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>全文摘要副干酪乳桿菌產生的抗菌肽的分離純化方法。目前抗菌肽的應用已成為生命科學領域的一個研究熱點。本發明包括選取副干酪乳桿菌制作培養基，獲得的發酵液在離心力10,000克，離心，冷藏并分離，經陽離子交換層析并過積累濃縮，使用超濾離心管在冷凍低溫高速離心超濾除鹽，同時收集流出液和保留液，將保留液通過分離純化；高效液相色譜HPLC；采用蛋白濃縮試劑盒對樣品進行濃縮，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，12-烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE對分離到抗菌肽進行分子量估測，基質輔助激光解吸飛行時間質譜MOLDI-TOF-MS和串聯質譜Q-TOF2實驗測定氨基酸序列。本發明應用于抗菌肽的分離純化。文檔編號C12P21/02GK101451158SQ20071014473公開日2009年6月10日申請日期2007年12月4日優先權日2007年12月4日發明者凌宏志,剛宋,平文祥,李秀涼,杜春梅,葛菁萍,虹雷申請人:黑龍江大學