專利名稱：一種利用特定基因組合的表達特征鑒定腫瘤組織及亞型，以及用以預測患者預后與轉移 ...的制作方法
技術領域：
本發明是關于使用基因表達譜分析的方法，⑴使用含SEQ ID N0S:l-7、8-17或 1-17核酸序列的基因組合(gene set)確定人類樣本是否為腫瘤；(2)鑒定腫瘤組織是否 為腺癌(adenocarcinoma)(使用含SEQ ID NOS :15，18-21核酸序列的基因組合)或鱗狀 細胞癌(squamous cell carcinoma)(使用含SEQID NOS :22-27核酸序列的基因組合)； 及C3)預測存活的預后及在人體內腫瘤的轉移(使用含SEQ ID NOS 19、28-42或SEQ ID N0S:19J9、31、40及41核酸序列的基因組合)，特別是在早期肺癌的人類。較佳者為，基因 表達譜最好以cDNA微陣列(microarray)為基礎的技術和/或實時反轉錄聚合酶鏈式反應 (Real-Time RT-PCR)進行，并通過統計方法分析。
背景技術：
癌癥為一種無法控制生長及不正常細胞蔓延為特征的疾病群，若蔓延不受控制， 則可導致死亡。癌癥因外在因子(例如香煙、化學物質及放射線)及內在因子(遺傳突變、 荷爾蒙、免疫狀況及由代謝所發生的突變)引起，這些因子可一起或接續作用而開始或促 進癌化(carcinogenesis)，暴露于外在因子及可偵測到癌癥之間通常可經過10年以上。癌 癥可通過手術、放射線、化學療法及免疫療法治療。所有癌癥包含控制細胞生長及分裂的基因的機能不全。約5至10%的癌癥明確地 為遺傳性，遺傳性基因的改變使人類有罹患特定癌癥的高風險傾向，其它癌癥并非為遺傳 性，而是由于終其一生所發生的基因(突變)損傷所造成，或者是因為內在因子，例如荷爾 蒙或營養物在細胞內的消化作用，或外在因子，例如香煙、化學物質或陽光。肺癌是全世界癌癥死亡最常見的死因(Jemal et al.，CA Cancer J. for Clin. (2005)55 :10-30 ；Parkin et al. , European J. of Cancer (2001) 37 :S4_66)。在 2005 年， 肺癌占被診斷出的癌癥的13%，發生率在男性已明顯下降，由1984年每100，000人中有 102. 1人的高峰降至2001年的77. 7。在女性中，于長時間的增加之后，第一次減少的比例 由1998年的52. 8降至2001年的49. 1。在2005年報告指出超過163，000人死于肺癌，此約占所有癌癥死亡的四％，自從 1987年起，每年因肺癌死亡的女性已多于乳癌。從1991年起男性死亡率已持續以每年約 1. 9%明顯下降，女性肺癌死亡率在數十年間連續增加后近來已達到高原期，下降的肺癌發 病率及死亡率反映出過去30年間下降的吸煙率。吸煙顯然是肺癌最主要的風險因子，其它風險因子包括二手煙與在職業上或環境 上暴露于某些物質，如砷、苯類的有機化學物、氡及石綿；于職業、醫學及環境來源的放射線 暴露；空氣污染及結核病。肇始于肺部的癌癥根據在顯微鏡下的細胞外觀可區分成兩種主要類型，S卩非小 細胞肺癌(NSCLC, non-small cell lung cancer)及小細胞肺癌(SCLC，smallcell lung cancer)。每一類型的肺癌以不同方法生長及蔓延，且治療方法不同。非小細胞肺癌比小細胞肺癌更為普遍，且通常其生長及蔓延較為緩慢。非小細胞肺癌有三種主要類型， 其以癌癥發展中的細胞類型而被稱為鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas)、腺癌 (adenocarcinomas)及大細胞癌(large-cellcarcinomas) 0鱗狀細胞癌為一種肇始于鱗狀細胞的癌癥，其薄而平的細胞看起來類似魚鱗。鱗 狀細胞被發現于形成皮膚表面、身體中空臟器的內襯(lining)及呼吸道與消化道的通道 的組織。腺癌為一種肇始于內襯在某些內臟的細胞且具有腺體(分泌)特性的癌癥類型。 此外，大細胞癌為一種在顯微鏡視野下相較于周圍的細胞，細胞較大且看起來不正常的癌 癥類型。肺癌也可在癌癥的實際類型被鑒定之前，依據所在的位置而被分類，例如肺癌發 生于腫瘍的疾病種類，腫瘍為一種當細胞分裂比其應該分裂的多或當其應該死亡而未死亡 時所造成的不正常組織腫塊。依據細胞所在的位置，腫瘍可在進一步區分成胸腔腫瘍、呼吸 道腫瘍及肺腫瘍，這些位置間的差異與最后腫瘍存在的位置有關。例如，胸腔腫瘍存在于胸 腔區域，呼吸道腫瘍包括所有涉及呼吸的器官(即鼻、咽、喉、氣管、支氣管及肺)，而肺腫瘍 僅于胸腔內供應身體氧氣及移除二氧化碳的成對器官之一發現。過去在早期檢測上的努力仍不能證實降低死亡率的能力，胸腔X光、唾液中細胞 分析及支氣管通道的光纖檢測在改善存活率或確定預后已顯示有限的效力。較新的試驗， 例如低劑量螺旋計算機斷層攝影儀掃描及唾液的分子標識，在檢測早期(較可手術的階 段)肺癌上已產生有希望的結果，而較為可能存活。然而，當評估篩檢的風險及優點時，必 須考慮有大量關于肺穿刺病理切片及手術的風險。此外，當病人具有相同的臨床及病理特征時，NSCLC的臨床病理分期系統不能充 分預測結果，大約30%的NSCLC病人表達早期的疾病狀態且接受可能治愈的治療方式。然 而，其中有40%的病人將會在五年內復發(Hoffman etal.，Lancet (2000) 355 :479-485 ； Mountain, Chest(1997)111 1710-1717 ；andNaruke et al.，J.Throac. Cardiovasc. Surg. (1988)96 :440-447)。分子層面的研究對于鑒別治療后再復發或轉移高風險病人提供更多的信息，這將 有助于改善對NSCLC病人的管理。近年來，基因表達譜顯示能夠區分不同存活情形的病 人(Beer et al.，Nat. Med. (2002)8 :816_824and Wigle et al.，Cancer Res. (2002)62 3005-3008)。值得注意地，臨床上被分為早期的病人中有不少比例在基因表達譜方面被認 定為預后差的高風險群。盡管如此，基因表達譜方法的臨床應用仍受限于參與基因數量的 過于龐大(Ramaswamy, N. Engl. J. Med. (2004)350:1814-1816)。再者，多數被選中的基因 實際上在不同肺癌的研究中的結果是截然不同的，只有非常少的基因才能一致地被算進去 (Endoh etal.，J. Clin. Oncol. (2004)22 :811-9)。此外，幾個最近的微陣列研究顯示基因表達譜(gene expression profiling) 能夠用來區分肺癌的組織病理種類的亞型(如腺癌和鱗狀細胞癌)(Miattacharjee et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (2001)98 :13790-13795 ；Garber et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (2001)98 :13784-13789 ；McDoniels-Silvers et al.，Clin. Cancer Res. (2002)8 1127-1138 ；McDoniels-Silvers et al.，Neoplasia(2002)4:141-50 ；and Nacht et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. (2001)98 :15203-8)。目前的數據顯示，區別肺癌亞群的最佳基因表 達譜在不同的組中可能不同。舉例來說，在東亞民族(包括臺灣及日本)組中，發現表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor, EGFR)對于治療的反應率高于其它種 族(Chou et al. , Clin. Cancer Res. (2005) 11 :3750-7 ；Huang et al. , Clin. Cancer Res. (2004) 10 :8195-203 ；Shigematsu et al.，J. Natl. Cancer Inst. (2005)97 :339-46)。本發明者先前已鑒別超過600個與轉移有關連的基因，在本發明下一部份，將進 一步描述所發現的特定基因組合，其可決定在人類發展為腫瘤的風險；鑒別肺癌的亞型，尤 其是區別腺癌與鱗狀細胞癌；及預測具有腫瘤的人的預后。
發明內容
本發明提供(1)鑒定人類樣本是否為腫瘤的方法；( 鑒定人類腫瘤組織是否為 腺癌及鱗狀細胞癌的方法；及C3)預測具有腫瘤的人預后的方法。第一方法需要比較人類樣本的基因組合的基因表達與對照組中相同基因組合的 相應基因表達(對照組可為標準化的數據、在健康人類受試者中相應基因組合的基因表達 或相同人類受試者正常區域組織的基因表達。)本文所述的基因表達通過實時反轉錄聚合 酶鏈式反應(Real-Time RT-PCR)或基于cDNA微陣列技術測定，其使用PROC RANK統計軟件 SAS (版本9. 1 =SAS InstituteInc.，Cary, NC, USA)標準化，根據對數強度決定基因表達。7-基因組合及10-基因組合已被選用于通過威爾科克森帶符號秩檢驗(Wilcoxon signed-rank test)測定人類樣本是否為腫瘤，在7_基因組合或10-基因組合各基因 的基因表達與對照組中相應基因表達相互比較，并進一步通過判別分析(discriminant analysis)禾口 / JlKfti一^MMtMM (hierarchical clusteringanalysis) ^^，了― 1 組合包括 THBS2 (SEQ ID NO 1)、FAP (SEQ ID NO :2)、IGFBP3 (SEQ ID NO 3)、PLAU (SEQ ID NO :4)、MCM4(SEQ IDNO 5)、MMPl (SEQ ID NO 6)及 CDC20 (SEQ ID NO :7)，此組的基因特征 為在人類腫瘤組織中的基因表達高于對照組，較佳的為二倍且顯著(即ρ值小于0.05)高 于對照組。10-基因組合包括 ADARBl (SEQ ID NO 8)、THBD (SEQ ID NO :9)、NR4A1 (SEQ ID NO: 10)、TGFBR2(SEQ ID NO :11)、SPARCL1(SEQID NO : 12)、CAVl(SEQ ID NO :13)、ADRB2(SEQ ID NO 14) ,KlAAl 102 (SEQ ID NO 15) ,TGFBR3(SEQ ID NO :16)及 GPM6A(SEQ ID NO :17)，此組 的基因特征為在人類腫瘤組織中的基因表達低于對照組，較佳的為二倍且顯著(即P值小 于0. 05)低于對照組。或者是，合并7-基因組合與10-基因組合的17-基因組合，其也可用于測定人類 腫瘤。可被用于測定基因表達的人類樣本較佳為人體組織，可通過此方法測定的腫瘤類 型包括(但不限于)呼吸道腫瘍、胸腔腫瘍、肺癌、腺癌及鱗狀細胞癌。第二方法應用于在已預先被測定為類腫瘤的人類樣本中測定肺癌亞型，即腺癌或 鱗狀細胞癌。為了測定腫瘤組織是否為腺癌，在已預先被測定為類腫瘤的人類樣本中，使用 在5-基因組合各基因的微陣列技術的基因表達已被鑒定出來，5-基因組合包括MUCl (SEQ ID NO :18)、ErbB3(SEQ ID NO :19)、KIAAl 102 (SEQ ID NO 15)、PTPRU (SEQ ID NO :20) 及SCP2(SEQID N0:21)。5-基因組合是以威爾科克森帶符號秩和檢驗(Wilcoxon rank sumtest)挑選出來，在人類樣本中此組的基因會被正調控，較佳者為基因表達大于1.7倍 并具有顯著差異(較佳者為具有小于0. 05的顯著系數ρ值)。5-基因組合的基因表達譜以cDNA微陣列技術或實時RT-PCR完成，且進一步通過判別分析及任意一種系統聚類分析 分析之。為了測定樣本是否為鱗狀細胞癌，已預先被測定為類腫瘤的人類樣本中的6-基 因組合通過威爾科克森帶符號秩和檢驗挑選出來，此6-基因組合包括SLC43A3 (SEQ ID NO 22)、MXDl (SEQ ID NO :23)、S100A8 (SEQ IDNO :24)、ODCl (SEQ ID NO :25)、PIK3CA (SEQ ID NO 26)及CMKORl (SEQ ID NO :27)，此組的基因在人類樣本中被正調控，較佳者為大于1. 7 倍并具顯著差異(較佳者為具有小于0. 05的顯著系數ρ值)。6-基因組合的基因表達譜 通過cDNA微陣列技術或實時RT-PCR完成，且進一步通過判別分析及任意一種系統聚類分 析分析之。在SEQ ID NO :22中的序列可以SEQ IDNOS :44及45置換，該二者事實上為具有 長度些微不同的相同基因。第三方法適用于預測具有腫瘤的人的預后，其包括自人類獲得樣本，并測定在 16-基因組合中各基因的基因表達，16-基因組合包括ANXA5 (SEQ IDNO 28)、LCK (SEQ ID NO 29)、FRAPl (SEQ ID NO 30)、STATl (SEQID NO 31)、NFl (SEQ ID NO 32)、HGF (SEQ ID NO 33)、HMMR(SEQID NO :34)、IRF4(SEQ ID NO :35)、ZNF264(SEQ ID NO :36)、ErbB3(SEQ ID NO 19)、STAT2 (SEQ ID NO :37)、CPEB4 (SEQ ID NO :38)、RNF4 (SEQ ID NO :39)、DUSP6 (SEQ ID NO :40)、MMD (SEQ ID NO :41)、及DLG2 (SEQ ID NO :42)，在此 16-基因組合中每一基因個 別的基因表達可用于合并各基因的回歸系數，以計算風險分數，其具有下列方程式風險分數=-1.09xANXA5-0. 84xLCK_0. 77xFRAPl_0. 58xSTATl+0. 47xNFl+0. 5IxHG F+0. 52xHMMR+0. 52xIRF4+0. 55xZNF264+0. 55xErbB3+0. 59xSTAT2+0. 59xCPEB4+0. 65xRNF4+ 0.75xDUSP6+0. 92xMMD+l. 32xDLG2其中該ANXA5、該 LCK、該 FRAPl、該 STATU 該 NFl、該 HGF、該 HMMR、該 IRF4、該 ZN擬64、該ErbB3、該STAT2、該CP^4、該RNF4、該DUSP6、該MMD、及該DLG2于上述方程式中 代表該基因組合中該基因的基因表達，其基因表達可通過實時反轉錄聚合酶鏈式反應(實 時RT-PCR)或cDNA微陣列技術分析而得到。風險分數可用于將人類分成具有腫瘤的高風險或低風險組。由前述16-基因挑選出的5-基因組合，能通過實時反轉錄聚合酶鏈式反應(實 時RT-PCR)或cDNA微陣列技術分析預測預測具有腫瘤的人的預后。此5-基因組合包括 LCK(SEQ ID NO 29),STATl(SEQ ID NO 31)、ErbB3(SEQ ID NO :19)、DUSP6(SEQ ID NO :40)、 及MMD (SEQ ID NO :41)，其通過單變量Cox比例風險模型回歸分析法(univariate Cox，s proportionalhazards regression analysis)挑選，此5-基因組合的基因表達譜通過決策 樹模式(decision tree model)分析。前述腫瘤較佳為肺癌，最佳為非小細胞肺癌，且對象 為具有早期肺癌的人。用于預測具有腫瘤的人預后的5-基因組合，能以3-基因組合置換，該3-基因組 合包含但不限于(I)STATl (SEQ ID NO :31)、ErbB3 (SEQ ID NO :19)、及LCK (SEQ ID NO :29)； (2) STATl (SEQ ID NO :31)、ErbB3 (SEQID NO 19)、及 MMD (SEQ ID NO :41) ； (3) STATl (SEQ ID NO :31)、ErbB3(SEQ ID N0:19)、及 DUSP6 (SEQ ID NO :40) ； (4) LCK (SEQID NO :29)、 ErbB3 (SEQ ID NO : 19)、及 MMD (SEQ ID NO :41)；以及 LCK (SEQ ID NO :29)、ErbB3 (SEQ ID NO : 19)、及 DUSP6 (SEQ IDNO :40)。最后，本發明提供一種診斷試劑盒以用來預測具有腫瘤的人的預后。該診斷試劑盒包含實時反轉錄聚合酶鏈式反應(實時RT-PCR)的試劑，用以分析該5-基因組合中 各基因的個別基因表達，包含 LCK (SEQ ID NO 29)、STATl (SEQ ID NO :31)、ErbB3 (SEQ ID NO :19)、DUSP6(SEQ ID NO :40)及 MMD (SEQ ID NO :41)。該試劑包含針對 5-基因組合和 /或控制基因的特異性探針及引物，該控制基因較佳為編碼TATA-盒結合蛋白(TATA-box bindingprotein ；TBP)的內源性基因。前述5-基因組合能被3-基因組合置換。
圖1顯示卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活曲線(整體存活率于左欄，而無復發 的存活率于右欄)關于下列4個方案(A)以微陣列為基礎的16個基因在訓練數據組(n = 63)中，以具風險分數中間值作為次分群切點(cut-offpoint) ； (B)以微陣列為基礎的16 個基因在試驗數據組(n = 62)中，使用衍生自訓練數據組的相同切點；(C)以實時RT-PCR 為基礎的5個基因于次級樣本(n = 101)中以決策樹模式預測病患；(D)基于實時RT-PCR 的5個基因以決策樹模式由次級樣本(n = 59)將第I期及第II期病患分層以預測病患；圖2顯示在獨立組(n = 60)中，基于實時RT-PCR的5個基因的預測模式，及關于 整體存活的Kaplan-Meier存活曲線。(A)整群獨立組(n = 60) ； (B)由獨立組分層出來的 第I及第II期病患(n = 42)；圖3顯示關于下列三個方案的顏色圖(color-gram)(訓練資料組于左欄且試驗 資料組于右欄)，及(A)與(B)的二維系統聚類分析(欄代表基因，且列代表檢體及由藍 (低)至紅(高)代表基因表達程度)㈧關于癌癥鑒定及正常分布的檢體的17個基因表 達譜，-2. 7至2. 7 (任意單位)；(B)關于癌癥鑒定及正常分布的檢體的17個基因表達譜， 關于癌癥的亞群分類及正常分布的檢體的11個基因表達譜，"2. 4至2. 4(任意單位)；(C) 關于轉移及存活的預測的16個基因表達譜，上方白至紅的色譜代表病患的風險由低至高， 列表示風險及保護性基因，欄代表病患，且由-2. 3至2. 3的藍至紅的色譜代表基因表達程 度；圖4顯示決策樹模式，其以實時RT-PCR所分析的樣本為基礎而建構，每一結點中 的數據包括結點編號(記述于上方)及分類成高風險(以High指出)及低風險(以Low 指出)的樣本編號，其以使用微陣列試驗數據的預后預測模式分類。新樣本(或檢體)的 分類決定末端結點中可含有的新樣本(或檢體)。例如，結點1含完整亞群(101個相對基 因表達測量；57個來自高風險群及44個來自低風險群)。第一叉口是基于“ErbB3”基因的 表達相對基因表達測量(以實時RT-PCR)少于0. 15形成結點3而其它測量形成結點2。
具體實施例方式本發明一方面提供測定在人類身上腫瘤發展風險的方法，另一方面包括區別人類 二種腫瘤類型的方法，及預測具有腫瘤的人預后的方法。本發明所涉及的腫瘤包括胸腔腫 瘍、呼吸道腫瘍、肺腫瘍、肺癌、非小細胞肺癌、腺癌及鱗狀細胞癌。測定腫瘤發展風險的方法需要取自人類的樣本，樣本包括組織樣本，其包括(但 不限于)上皮組織、結締組織、肌肉組織及神經組織。上皮組織樣本包括單層上皮(即鱗狀、 立方及柱狀上皮)、假復層上皮(即柱狀上皮)及復層上皮(即鱗狀上皮)。結締組織樣本 包括胚胎結締組織(即間質結締組織及粘液狀結締組織)、一般結締組織(即疏松結締組織及致密結締組織)、及特殊結締組織(即軟骨、骨及動物性脂肪)。肌肉組織樣本包括平滑 肌(即不隨意肌)及橫紋肌(即隨意及不隨意肌)。神經組織樣本包括神經及支撐細胞。 此外，樣本可含肺部系統獨特的細胞，例如來自氣管、支氣管、小支氣管及肺泡的細胞，還包 括口及喉獨特的細胞，例如口腔中所有形式的細胞，其包括臉頰內襯、舌、口腔底部及頂部、 牙齦、喉及唾液樣本。本發明的方法也需要取自人類的正常樣本，正常樣本包含組織樣本，例如上皮組 織、結締組織、肌肉組織及神經組織。上皮組織樣本包括單層上皮(即鱗狀、立方及柱狀上 皮)、假復層上皮(即柱狀上皮)及復層上皮(即鱗狀上皮)。結締組織樣本包括胚胎結締 組織(即間質結締組織及粘液狀結締組織)、一般結締組織(即疏松結締組織及致密結締組 織)、及特殊結締組織(即軟骨、骨及動物性脂肪)。肌肉組織樣本包括平滑肌(即不隨意 肌)及橫紋肌(即隨意及不隨意肌)。神經組織樣本包括神經及支撐細胞。此外，樣本可含 肺部系統獨特的細胞，例如來自氣管、支氣管、小支氣管及肺泡的細胞，也包括口及喉獨特 的細胞，例如口腔中所有形式的細胞，其包括臉頰內襯、舌、口腔底部及頂部、牙齦、喉及唾 液樣本。正常樣本被定義為表達包含表1中這些基因的樣本，不論是來自相同病人或是健 康人類受試者。一旦分析模式被定義后，它將成為標準化的數據。這個時候僅需要分析病 患的腫瘤樣本，而不是相同病患的腫瘤樣本與正常樣本。關于自人類取得樣本，自樣本中分離并萃取總RNA及擴增，擴增程序根據反義 RNA(aRNA)擴增法，并涉及數組分析中造成極小的信使RNA (messenger RNA)的線性擴增的 一連串酶反應。此程序由被反轉錄的全部或聚(A)RNA起始，在第一鏈合成后，反應以RNase H處理，以切割mRNA成為小片段，這些小RNA片段在第二鏈合成反應時做為引物(primer)。一旦RNA由樣本中萃取，然后在上述程序中轉變成cDNA或cRNA，作為微陣列分 析的準備，其中微陣列的用途為定量自不同基因轉錄mRNA，該基因編碼不同蛋白質，復 制體(copies)也可通過RT-PCR擴增。隨后熒光標簽(Fluorescent tag)或地高辛配 基-dUTP (digoxigenin-dUTP)酶并入新合成的cDNA/cRNA中，或可化學連接至DNA或RNA 新鏈，然后含有與數組上單鏈探針序列互補的序列的cDNA或cRNA分子通過堿基配對被雜 交至互補報導子(reporter)被黏上的點，然后當使用微陣列掃描機檢測時，該點發出熒光 (或發光)。微陣列可使用不同技術制造，包括以細尖的針印刷于玻璃片上、使用預制光罩的 微影技術、使用動態微鏡芯片(dynamic micromirror device)的微影技術、噴墨打印、或在 微電極數組上的電化學。增加的或減少的熒光強度顯示樣本中細胞最近已轉錄或停止轉錄含偵測的序列 的基因(“最近”，因為在轉錄后不久細胞傾向于降解RNA)，熒光強度對于所存在特定mRNA 復制體的數量是概略的比例項，因此概略地顯示該基因的活性或表達程度。數組可繪制成 圖形或“圖譜”，其中可以比色分析觀察在特定細胞類型及特定情況下基因組中哪些基因具 有活性。本發明所針對的表達基因組合選自這些SEQ. IDs、Unigene組編號、Genbank登錄 編號及GI編號列于下表1。表I權利要求
1.一種測定人類腫瘤的方法，其包含由所述人類獲得樣本；測定在所述樣本中基因組合中各基因的基因表達；其中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 1-7的核酸序列；比較在所述基因組合中的基因表達與對照組中所述基因組合中的相應的基因表達；藉此當在所述人類樣本的基因組合中各基因的基因表達大于所述對照組的基因組合 中各基因的相應的基因表達時，所述人類具有所述腫瘤。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述人類樣本為組織。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述腫瘤選自由呼吸道腫瘍、胸腔腫瘍、肺癌、腺 癌及鱗狀細胞癌所組成的組。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基因表達通過實時反轉錄聚合酶鏈式反應 測定。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基因表達程度使用cDNA微陣列技術測定。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對照組為標準化數據、來自所述人類周邊正 常區域或含所述基因組合的健康人類的正常組織。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基因組合通過威爾科克森帶符號秩檢驗選取。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，所述人類樣本中基因組合的基因表達約為所述 對照組中所述基因組合的相應的基因表達的二倍。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，在所述人類樣本中基因組合的基因表達明顯不 同于對照組中所述基因組合的相應的基因表達，具有小于0. 05的顯著系數ρ值。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達進一步通過 判別分析和/或系統聚類法分析。
11.一種測定人類腫瘤的方法，其包含由所述人類獲得樣本；測定在所述人類樣本中基因組合中各基因的基因表達；其中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 8-17的核酸序列；比較在所述基因組合中各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應 的基因表達；藉此當在所述人類樣本的基因組合中各基因的基因表達低于所述對照組的基因組合 中各基因的相應的基因表達時，所述人類具有所述腫瘤。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述基因組合通過威爾科克森帶符號秩檢驗 選取。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述對照組中所述基因組合中各基因的相應 的基因表達約為所述人類樣本中基因組合的基因表達的二倍。
14.根據權利要求12所述的方法，其中在所述人類樣本中基因組合的基因表達明顯不 同于所述對照組中所述基因組合的相應的基因表達，具有小于0. 05的顯著系數ρ值。
15.一種測定人類腫瘤的方法，其包含由所述人類獲得樣本；測定在所述人類樣本中第一基因次組合中各基因的第一基因表達； 測定在所述人類樣本中第二基因次組合中各基因的第二基因表達； 其中，所述第一基因次組合包含SEQ ID NOS :1-7的核酸序列，而所述第二基因次組合 包含SEQ ID NOS 8-17的核酸序列；比較在所述人類樣本中第一基因次組合中各基因的第一基因表達與對照組中所述第 一基因次組合中各基因的相應的第一基因表達；比較在所述人類樣本中第二基因次組合中各基因的第二基因表達與所述對照組的所 述第二基因次組合中各基因的相應的第二基因表達；藉此當在所述第一基因次組合中各基因的第一基因表達大于所述對照組中所述第一 基因次組合中各基因的相應的第一基因表達，且在所述第二基因次組合中各基因的第二基 因表達低于所述對照組中第二基因次組合中各基因的相應的第二基因表達時，所述人類具 有所述腫瘤。
16.一種在人類腫瘤樣本中鑒定腺癌的方法，其包含 獲得所述人類腫瘤樣本；測定在基因組合中各基因的基因表達；其中，所述基因組合包含SEQ IDNO 18, SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 20 及 SEQ ID NO 21 的核酸序列；藉此當所述基因組合的基因表達在所述人類腫瘤樣本中被正調控時，所述人類腫瘤樣 本被鑒定為所述腺癌。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述基因組合通過威爾科克森帶符號秩和檢 驗選取。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達被正調控 約大于1.7倍。
19.根據權利要求17所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達顯著地被 正調控，具有小于0. 05的顯著系數ρ值。
20.根據權利要求17所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達進一步通 過判別分析和/或系統聚類法分析。
21.根據權利要求16所述的方法，其中，所述人類腫瘤樣本為人類肺癌組織。
22.根據權利要求16所述的方法，其中，所述人類腫瘤樣本通過比較所述樣本中基因 組合中各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應的基因表達而測定；其 中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 1-7的核酸序列。
23.根據權利要求16所述的方法，其中，所述人類腫瘤通過比較在所述樣本中基因組 合中各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應的基因表達而測定；其 中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 8-17的核酸序列。
24.根據權利要求16所述的方法，其中，所述人類腫瘤樣本通過比較在所述樣本中基 因組合各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應的基因表達而測定；其 中，所述基因組合包含SEQ ID NOS :1-17的核酸序列。
25.一種在人類腫瘤樣本中鑒定鱗狀細胞癌的方法，其包含 獲得所述人類腫瘤樣本；測定在基因組合中各基因的基因表達；其中，所述基因組合包含SEQ IDNO 22, SEQ IDNO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 26 及 SEQID NO 27 的核酸序列；因此當所述基因組合的基因表達在所述人類腫瘤樣本中被正調控時，所述人類腫瘤樣 本被鑒定為所述鱗狀細胞癌。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述基因組合通過威爾科克森帶符號秩和檢 驗選取。
27.根據權利要求沈所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達被正調控 約大于1.7倍。
28.根據權利要求沈所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達顯著地被 正調控，且具有小于0. 05的顯著系數ρ值。
29.根據權利要求25所述的方法，其中，所述基因組合中各基因的基因表達進一步通 過判別分析和/或系統聚類法分析。
30.根據權利要求25所述的方法，其中，所述人類腫瘤樣本為人類肺癌組織。
31.根據權利要求25所述的方法，其中，所述人類腫瘤樣本通過比較所述樣本中基因 組合中各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應的基因表達而測定；其 中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 1-7的核酸序列。
32.根據權利要求25所述的方法，其中，所述人類腫瘤通過比較在所述樣本中基因組 合中各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應的基因表達而測定；其 中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 8-17的核酸序列。
33.根據權利要求25所述的方法，其中，所述人類腫瘤樣本通過比較在所述樣本中基 因組合中各基因的基因表達與對照組中所述基因組合中各基因的相應的基因表達而測定； 其中，所述基因組合包含SEQ ID NOS 1-17的核酸序列。
34.根據權利要求25所述的方法，其中，以SEQID NO 44或SEQ ID NO :45置換所述 SEQ ID NO :22。
35.一種對具有腫瘤的人預測轉移及存活預后的方法，其包含獲得所述人的腫瘤樣本；測定在基因組合中各基因的基因表達；其中，所述基因組合包含ANXA5(SEQ ID NO 28),LCK(SEQ ID NO :29)、FRAPl(SEQ ID NO :30)、STATl(SEQ ID NO :31)、NFl(SEQ ID NO: 32),HGF(SEQ ID NO :33),HMMR(SEQ ID NO :34)、IRF4(SEQ ID NO :35)、ZNF264(SEQ ID NO 36)、ErbB3(SEQ ID NO :19)、STAT2 (SEQ ID NO :37)，CPEB4 (SEQ ID NO :38)，RNF4 (SEQ ID NO :39)、DUSP6(SEQ ID NO :40)、MMD (SEQ ID NO :41)及 DLG2 (SEQ ID NO :42)的基因序列；根據所述基因表達產生所述人的風險分數；將具有所述腫瘤的人的風險分數編入高風險或低風險組別。
36.根據權利要求35所述的方法，其中，所述腫瘤為非小細胞肺癌。
37.根據權利要求35所述的方法，其中，所述風險分數根據所述基因組合中各基因的 基因表達與所述基因的回歸系數的乘積的總和計算。
38.根據權利要求37所述的方法，其中，所述風險分數根據下列方程式計算風險分數=-1. 09x ANXA5-0. 84x LCK-0. 77x FRAP1-0. 58x STAT1+0. 47x NF1+0. 5Ix HGF+0. 52xHMMR+0. 52x IRF4+0. 55x ZNF264+0. 55x ErbB3+0. 59x STAT2+0. 59x CPEB4+0. 65x RNF4+0. 75x DUSP6+0. 92xMMD+l. 32x DLG2其中，所述ANXA5、所述LCK、所述FRAPl、所述STATl、所述NFl、所述HGF、所述HMMRjjf 述IRF4、所述ZNF264、所述ErbB3、所述STAT2、所述CP^4、所述RNF4、所述DUSP6、所述MMD、 及所述DLG2于上述方程式中代表所述基因組合中所述基因的基因表達。
39.根據權利要求35所述的方法，其中，所述基因組合是通過單變量Cox比例風險模型 回歸分析法挑選。
40.根據權利要求35所述的方法，其中，所述基因表達通過基于cDNA微陣列的技術分析。
41.一種對具有腫瘤的人預測轉移及存活預后的方法，其包含獲得所述人的腫瘤樣本；測定在5-基因組合中各基因的個別基因表達；其中，所述5-基因組合包含LCK(SEQ ID NO 29)、STATl(SEQ ID NO :31)、ErbB3 (SEQ ID NO :19)、DUSP6 (SEQ ID NO :40)及 MMD(SEQ ID NO 41)的核酸序列；使用在5-基因組合中各基因的所述個別基因表達，預測所述具有腫瘤的人為高風險 或低風險。
42.根據權利要求41所述的方法，其中，所述個別基因表達通過實時反轉錄聚合酶鏈 式反應(實時RT-PCR)測定。
43.根據權利要求41所述的方法，其中，所述各基因表達通過cDNA微陣列技術分析。
44.根據權利要求41所述的方法，其中，所述預測通過決策樹模式預測所述具有腫瘤 的人為高風險或低風險。
45.根據權利要求41所述的方法，其中，所述腫瘤為肺癌。
46.根據權利要求45所述的方法，其中，所述肺癌為非小細胞肺癌。
47.根據權利要求45所述的方法，其中，所述具有腫瘤的人為具有早期肺癌的人。
48.根據權利要求41所述的方法，其中以3-基因組合置換所述5-基因組合，其中， 所述 3-基因組合選自由(I)STATl (SEQ ID NO :31)、ErbB3 (SEQID NO 19)、及 LCK(SEQ ID NO 29) ； (2) STATl (SEQ ID NO :31)、ErbB3 (SEQ ID NO :19)、及 MMD (SEQ ID NO :41)； (3) STATl (SEQID NO :31)、ErbB3 (SEQ ID NO : 19)、及 DUSP6 (SEQ ID NO :40) ; (4) LCK (SEQ ID NO :29)、ErbB3(SEQ ID NO : 19)、及 MMD (SEQ ID NO :41)；以及 LCK(SEQ ID NO :29)、 ErbB3 (SEQ ID NO : 19)、及 DUSP6 (SEQID NO :40)的核酸序列所組成的組。
49.根據權利要求35所述的方法，其中，所述基因表達通過實時反轉錄聚合酶鏈式反 應(實時RT-PCR)測定。
50.一種診斷試劑盒，其包含實時反轉錄聚合酶鏈式反應(實時RT-PCR)的試劑，所述 試劑盒是用以分析如權利要求41所述的所述5-基因組合中各基因的個別基因表達。
51.根據權利要求50所述的診斷試劑盒，其中，所述試劑包含針對5-基因組合的特異 性探針及引物。
52.根據權利要求50所述的診斷試劑盒，其中，所述試劑進一步包含分析TATA-盒結合 蛋白基因表達的特異性探針及引物。
53.一種診斷試劑盒，其包含實時反轉錄聚合酶鏈式反應(實時RT-PCR)的試劑，所述 試劑盒是用以分析如權利要求48所述的所述3-基因組合中各基因的個別基因表達。
54.根據權利要求53所述的診斷試劑盒，其中，所述試劑進一步包含分析控制基因表達的特異性探針及引物，而所述控制基因編碼TATA-盒結合蛋白。
全文摘要
本發明提供用于基因表達譜分析的方法，(1)使用含SEQ ID NOS1-7、8-17或1-17核酸序列的基因組合(gene set)確定人類樣本是否為腫瘤；(2)鑒定腫瘤組織是否為腺癌(adenocarcinoma)(使用含SEQ ID NOS15，18-21核酸序列的基因組合)或鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)(使用含SEQID NOS22-27核酸序列的基因組合)；及(3)預測存活的預后及在人體內腫瘤的轉移(使用含SEQ ID NOS19、28-42或SEQ ID NOS19、29、31、40及42核酸序列的基因組合)，特別是在早期肺癌的人類。基因表達譜優選以cDNA微陣列(microarray)為基礎的技術和/或實時反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-Time RT-PCR)進行，并通過統計方法分析。
文檔編號C12P19/34GK102099484SQ200780018571
公開日2011年6月15日 申請日期2007年2月9日 優先權日2006年5月22日
發明者俞松良, 周業自, 楊泮池, 杰里米·J·W·陳, 滕涵菁, 陳璇宇 申請人:怡發科技股份有限公司, 達生藥物開發公司