專利名稱：：強直性脊柱炎易感性檢測方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地涉及抗原肽轉運蛋白1(TransporterofAntigenP印tides1，TAP1)的單核苷酸多態性(singlenucleotidepolyraorphisra,SNP)及其與強直性脊柱炎的相關性。本發明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術：
：強直性脊柱炎又名別赫捷列夫氏(VonBechterev)病或馬-施二氏(Maritstrumpell)病，是一種慢性、進行性，中軸關節受累的慢性炎癥性疾病。主要影響骨盆的骶髂關節、脊柱關節和椎旁組織。主要癥狀為下腰痛、脊椎僵硬及運動范圍受限、X線顯示兩側骶髂關節炎(sacroilitis)為其特征。由于該病一般先侵犯骶髂關節，并重點累及脊柱，最終導致脊柱骨性強直，故目前國內外多稱之為強直性脊柱炎(AnkglosingSpondylitis,AS)。強直性脊柱炎有明顯的種族性，在不同民族中發病率的差異很大。印第安人發病率最高，北美印第安人發病率為2.7%6.3%。其次為白種人，白種人中發病率為0.1%1.4%。黃種人低于白種人，我國約為0.3%。而黑人發病率最低，約為白人的l/4，在非洲僅為0.2%。強直性脊柱炎好發于20至40歲的成年人，尤其是2030歲的青年男性。強直性脊柱炎呈常染色體顯性遺傳,有明顯的家族遺傳傾向,遺傳因素>90%。據調查，強直性脊柱炎病人親屬發病率比一般人高一倍左右，同胞復發風險比為82。90。/。以上的AS病人具有HLA-B27陽性，在正常人群中陽性率為8。/。；子女HLA-827陽性占50%，發生強直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定論，HLA-B27作為獨立的致病基因在AS的發病中起作用。因為在HLA-B27陽性個體中只有P/。5。/。發展成為AS，提示還有其他基因參與AS的發病。近年來，單核苷酸多態性(SNP)和單倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的廣泛運用，為在分子水平上研究強直性脊柱炎的發生和發展的機制開辟了全新的思路。同時，高通量、低成本的SNP檢測手段的不斷出現也為SNP大規模快速分型提供了可能。SNP的存在與否以及等位基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質性的存在，即同一疾病或性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。另外，不同人群中SNP及其單倍型的類型和頻率存在的這種差異可能與不同人群對藥物及環境因素的反應性不同密切相關。強直性脊柱炎作為一種遺傳因素起較大作用的疾病，尋找其相關基因進而闡明強直性脊柱炎發病的遺傳機制已經成為目前研究的熱點。雖然已有許多關于各種基因多態性與強直性脊柱炎的研究，但沒有證實TAP1基因與強直性脊柱炎相關性的報道，更沒有證實本發明所述的TAP1基因SNP與強直性脊柱炎相關性的報道。綜上所述，為了盡早診斷強直性脊柱炎，本領域迫切需要尋找強直性脊柱炎易感基因，并開發檢測強直性脊柱炎的方法和試劑盒。
發明內容本發明的目的就是提供一種輔助診斷(尤其是早期診斷)強直性脊柱炎的方法及檢測試劑盒。本發明的另一目的是提供一種新的治療強直性脊柱炎的方法。在本發明的第一方面，提供了一種對個體的強直性脊柱炎易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的TAP1基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的TAP1基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患強直性脊柱炎的可能性高于正常人群。在另一優選例中，所述的方法中檢測的是TAP1的基因或轉錄本，并與正常TAP1核苷酸序列比較差異。在另一優選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態性229位G—T;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。在本發明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在抗原肽轉運蛋白1(TAP1)的單核苷酸多態性的方法，包括步驟(a)用TAPl基因特異性引物擴增樣品的TAPl基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性229位G—T;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。在另一優選例中，所述的基因特異性引物具有SEQIDNO:2和3的序列。在另一優選例中，所述的擴增產物的長度為100-2000bp，且含有SEQIDN0:l中第229位。在本發明的第三方面，提供了一種檢測強直性脊柱炎的試劑盒，它包括特異性擴增TAP1基因或轉錄本的引物，更佳地，所述的引物擴增出長度為100-2000bp，且含有SEQIDNO:l中第229位的擴增產物。在另一優選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDNO:l中第229位的突變結合的探針；(b)識別SEQIDN0:l中第229位的突變限制性內切酶。在另一優選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態性229位G—T;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。具體實施例方式本發明人經過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發現和證明了TAP1的基因組序列與強直性脊柱炎密切相關，其中關聯研究結果顯示，在TAP1的SEQIDNO:l中第229位的SNP(229位G—T)(記為RS36229526)在對照組和病例組中的分布存在顯著性差異(代0.05)，因此可作為輔助性檢測強直性脊柱炎(或其易感性)的特異性SNP。在此基礎上完成了本發明。TAP1基因抗原肽轉運蛋白l(TransporterofAntigenP印tides1，TAP1)的序列是已知，其詳細序列和一些相關信息可參見網址hUp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/;http:〃窗.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。為了方便起見，在SEQIDNO:1給出TAP1中與本發明SNP相關的核苷酸序列。TAP1基因位于6P21.3，大小為8.7k，共有ll個外顯子。其編碼的蛋白屬于ABC(ATP-結合盒)超家族的MDR/TAP亞家族。TAP是一類轉運蛋白，分為TAP1和TAP2兩種形式，表達于內質網膜表面，參與內源性抗原肽的處理和加工。蛋白酶體水解產生的肽段在TAP1和TAP2組成的異二聚體的作用下轉運至內質網腔，經由內質網泵入膜分隔區，與HLAI類分子結合，形成穩定的HLA-Ag復合物，然后才能表達于細胞表面并提呈給T細胞。抗原多肽可能就是這樣呈遞給CD8+T淋巴細胞受體而導致了關節炎的產生。TAP的多態性可使不同的肽轉運至內質網。現有的研究已發現TAP1基因與糖尿病、多發性硬化、原發性開角型青光眼、青少年特發性關節炎、橋本氏甲狀腺炎、牛皮癬、白癜風等多種自身免疫性疾病及腫瘤的發生發展密切相關。其與AS(ankylosingspondylitis,強直性脊柱炎)的關系也是值得探討的研究方向。國外有研究發現TAP1某些位點在HLA-B27陽性者和具有脊柱外疾病的AS患者中增加。我國有學者在安徽人群中的研究發現HLA-B27陽性個體中TAP1333位Val/Val表型頻率可能具有顯著的AS抗性。本發明人對TAP1基因中的幾乎整個區域進行了測序，發現了許多SNP，其中大部分SNP與強直性脊柱炎易感性并不相關，然而關聯研究表明SEQIDN0:1中229位G—T卻是與強直性脊柱炎易感性關聯性非常高的SNP。具體而言，本發明揭示了TAP1基因一種單核苷酸多態性(SNP)以及該多態性與強直性脊柱炎的相關性。本發明的SNP是SEQIDNO:l所示序列的第229位的G/T多態，等位基因型T在強直性脊柱炎病人群中的頻率，要高于在正常對照人群中的頻率。基于本發明的新發現，TAP1蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)用于輔助性診斷強直性脊柱炎。另一方面，本發明還包括對人TAP1DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結合于人TAP1基因產物或片段。較佳地，指那些能與人TAP1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人TAP1蛋白的分子，也包括那些并不影響人TAP1蛋白功能的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人TAP1基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人TAP1蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發明的抗體包括能阻斷人TAP1蛋白功能的抗體以及不影響人TAP1蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人TAP1基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人TAPl基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。抗人TAP1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人TAP1蛋白的多少和/或突變與否。一種優選的抗TAP1抗體是不識別正常TAP1但識別突變TAP1的抗體，或者識別正常TAP1但不識別突變TAP1的抗體。利用這些抗體，可以方便地進行蛋白質水平的強直性脊柱炎易感性檢測。利用本發明TAP1蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與TAP1蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。本發明還涉及定量和定位檢測人TAP1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括ELISA等。一種檢測檢測樣品中是否存在TAP1蛋白的方法是利用TAP1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與TAP1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在TAP1蛋白。TAP1蛋白的多聚核苷酸可用于TAP1蛋白相關疾病的輔助診斷。在診斷方面，TAP1蛋白的多聚核苷酸可用于檢測TAP1蛋白的表達與否或在疾病狀態下TAP1蛋白的異常表達。如TAP1DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷TAP1蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用TAP1蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測TAP1蛋白的轉錄產物。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。TAP1蛋白突變的形式包括與正常野生型TAP1DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。最方便的檢測本發明SNP的方法，是通過用TAP1基因特異性引物擴增樣品的TAP1基因，得到擴增產物；然后檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性229位G—T，其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。應理解，在本發明首次揭示了TAP1基因的SNP與強直性脊柱炎的相關性之后，本領域技術人員可以方便地設計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產物，然后通過測序等方法確定是否存在229位G4T。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優選的，但是本領域技術人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發明范圍之內，只要該引物擴增出的擴增產物含有本發明SNP的對應位置。一種優選的引物對具有SEQIDN0:2和3的序列。雖然擴增產物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產物的長度為100-2000bp，較佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產物都應含有SEQIDN0:l中第229位。由于本發明的SNP與強直性脊柱炎具有非常高的關聯性，因此不僅可用于早期輔助性診斷強直性脊柱炎，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發病前就采取合理的預防措施，從而提高攜帶者的生存期和生存質量，因此具有極其重大的應用價值和社會效益。當然，最終還應當用常規檢測方法進行確診。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例l1.1研究對象病例樣本全部采集自門診病人，患者的診斷由仁濟醫院富有臨床經驗的風濕病科醫師根據1984年提出修訂的紐約標準作出，并通過多次隨訪確診。對照樣本選自南方中心樣本庫中年齡、性別匹配，無關節炎病史的個體。在知情同意的基礎上隨機收集了197個病人和475個正常對照個體的外周血樣本。1.2實驗方法和結果1.2.1DNA提取用常規酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規PCR擴增。1.2.2PCR及測序引物的設計根據GenBank中TAPl的基因組序列，設計和合成以下引物。具體引物如下表l所示。表l引物序列表引物名稱序列(5'-3')SEQIDNO:有義引物AAATAGGCTGCCCTGGAACT2反義引物GGCTGCTTTGAAGCCATTAG31.2.3TAP1基因的PCR擴增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp9700PCR儀上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應條件為94。C預變性2分鐘，94。C變性30秒，63。C退火40秒，72。C延伸40秒，共10個循環，每個循環退火溫度遞減0.5。C;以后94。C變性30秒，58"C退火40秒，72。C延伸40秒，共30個循環；最后72。C延伸7分鐘。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。結果，獲得TAP1的擴增產物。1.2.4SNP的發現和檢測PCR產物經Resin樹脂純化后，用ABI-3730DNA測序儀(美國應用生物系統公司appliedbiosystems(ABI))進行測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學http:〃droog.rabt.Washington,edu/Polyphred.html)進行序歹廿的判讀、基因分型和SNP確認。結果，發現存在數個SNP，其中包括以下SNP:SEQIDNO:l中229位G—T(RS36229526)。1.2.5SNP基因分型和關聯分析用直接單向測序法進行SNP基因分型。即在強直性脊柱炎病人和正常對照組中進行分型和關聯分析。對基因分型結果進行描述性統計分析，列聯表進行卡方檢驗。觀察基因型在病人和對照之間是否具有差異。分析結果如下在SEQIDNO:l的第229位上，在475例對照中，GG433例，GT41例，TTl例;在197例病例中GG164例，GT28例，TT5例，P=0.002。等位基因1在對照和病例中的頻率分別為4.53°/。和9.6%,具有顯著差異，卡方檢驗P=0.000332。(GG+GT)/TT在對照和病例中分別為474/1和192/5,P^0,014。GG/(GT+TT)在對照和病例中分別為433/42和164/33，P=0.003。在男性樣本中，對照和病例中GG/GT/TT的分布分別為344/35/l和134/17/5，P=0.012。等位基因T在對照和病例中的頻率分別為4.87y。和8.65%，P=0.017。(GG+GT)/TT在對照和病例中分別為379/1和151/5，P=0.013。在女性樣本中，對照和病例中GG/GT的分布分別為89/6和30/ll，P^0.001。等位基因T在對照和病例中的頻率分別為3.16%和13.41%，P=0.001。上述結果綜合表明G—T改變，增加了AS的易感性，等位基因型T與AS的發生顯著相關。換言之，SEQIDNO:1中229位的SNP與強直性脊柱炎的發生存在著相關性。實施例2強直性脊柱炎易感性檢測試劑盒如實施例l所述，SEQIDNO:1中229位G—T的突變與強直性脊柱炎疾病密切相關。因此，可基于這個突變設計TAP1基因特異性引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測。制備一試劑盒(100人次)，它含有:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反義引物SEQIDN0:3lOOpmolPCR反應液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應緩沖液隨機挑選100個人構成的測試組，其中包括未知是否患強直性脊柱炎的對象、已知患強直性脊柱炎病人和經檢測無強直性脊柱炎的正常人。抽取測試組中待檢測對象的外周血3ml,使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將強直性脊柱炎檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產物純化后，用ABI3730DNA測序儀進行測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。或者，將擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，也可檢測出229位G—T。檢測結果對于TAP1存在229位G—T的對象，進一步通過常規方法檢測以確認是否患有強直性脊柱炎情況。檢測結果表明，含229位G—T的檢測對象的強直性脊柱炎易感性比例明顯高于不含G正常人群(高出至少20(^)。因此，這表明通過檢測TAP1的229位G—T，可進行強直性脊柱炎的輔助性檢測。實施例3強直性脊柱炎易感性輔助性檢測重復實施例2的檢測，不同點在于隨機選取了70個人(檢測前不知道是否有強直性脊柱炎癥狀)進行檢測。制備一試劑盒(100人次)，它含有:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>抽取待檢測對象的外周血3ml，使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將強直性脊柱炎檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產物純化后，用ABI3730DNA測序儀進行測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。結果同樣證實了，含229位G—T的檢測對象的強直性脊柱炎比例明顯高于該位點為GG的檢測對象(高至少200。/0)。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉上海人類基因組研究中心<120>強直性脊柱炎易感性檢測方法和試劑盒1<130〉081330<160〉3<170〉Patentlnversion3.4〈210〉1<211>708<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>1aastaggctgccctggaactcactaccctgtggttgctctaccag肪ctttcaggatttt603ttagg33ggctgg3g3tcatga3gt3g肪犯gcctcctgttsgetgstgsggstgccccg120cccttcggccccagagca犯ggatttccccgcttccggcgtggcccaaagaatcaagacc180cggtcagcaatggagcccagaacctctggcccccgccagtccagtgccgtttcttctaca240ccgaagtggtgttccaaggtcccacgctaggagtccttctcctgctccacatttcccagaa300cccacgctactctaccttactgacaattacctttgattcctgtcccagtccccttgtgtc360ctcccctcttgccctgcgttccccttaccaag柳ggagagg3ccacc3ggaccagg肪c420agcgag鄉cggcgcgtctccgagcccaggcagcct柳agccgacgcacagggtttcca480gagccgccctgaccgccgggcacccag3ggctcccgagtttgtgccacagggctgctgcg540ggcagtgccgctgcataactgacaacgaaggcggtagggtgacttccccagtgcagtagc600ctggtgct3tccgcggacccgggggctccccatgagatcagctctcggaacaaggcaagt660cccggcagggcc幼gcccagtgccgcagctaatggcttcaaagcagcc708<210>2<211〉20<212〉DNA<213>引物<400〉2aaataggctgccctggaact20<210〉3<211〉20<212>DNA<213>引物〈400〉3ggctgctttgaagccatt3g20權利要求1.一種體外檢測樣品是否存在抗原肽轉運蛋白1(TAP1)的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用TAP1基因特異性引物擴增樣品的TAP1基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性229位G→T；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO1。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增產物的長度為IOO-2000bp且含有SEQIDN0:l中第229位。4.一種檢測強直性脊柱炎的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增TAP1基因或轉錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第229位的擴增產物。5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDN0:l中第229位的突變結合的探針；(b)識別SEQIDN0:l中第229位的突變限制性內切酶。6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態性229位G—T;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:l。7.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQIDNO:2和3的序列。8.—種對個體的強直性脊柱炎易感性進行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的TAP1基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的TAP1基因、轉錄本和/或蛋白相比較，其中，存在差異就表明該個體患強直性脊柱炎的可能性高于正常人群。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，檢測的是TAP1的基因或轉錄本，并與正常TAP1核苷酸序列比較差異。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態性229位G—T;其中，核苷酸位置編號基于SEQIDN0:1。全文摘要本發明公開了一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，它包括檢測個體的抗原肽轉運蛋白1(TAP1)、轉錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患強直性脊柱炎的可能性大于正常人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101525656SQ20081003422公開日2009年9月9日申請日期2008年3月5日優先權日2008年3月5日發明者牛振民,蓉雷,薇黃申請人:上海人類基因組研究中心