專利名稱：一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系及其建系方法
技術領域：
本發明涉及微生物動物細胞領域，具體涉及來源于人肝癌門靜脈癌栓 的肝癌細胞系及其建系方法。
背景技術：
原發性肝癌(HCC)是最常見的惡性肺瘤之一，未經治療的病人中位生 存期不到一年。手術切除是目前肝癌治療最有效的措施。但即使切除了 腫瘤，術后大多數病人仍死于術后腫瘤復發轉移。肝癌轉移的主要特征 是向門靜脈內生長而形成門靜脈癌栓。上海東方肝膽外科醫院對5524例 肝癌患者行肝腫瘤切除術，切除標本發現門靜脈內已形成癌栓的比例達 67. 1% (中華外科雜志,2001, 39: 25 - 28 );通it^t肝癌門靜脈癌栓生 長特征的研究提出了癌栓分為5型8個亞型(中國現代普通外科進展， 2003, 6: 171 - 173 ),對肝癌合并門靜脈癌栓的患者的臨床治療及預后 判斷提供了重要的參考。但是目前對肝癌門靜脈癌栓形成的分子機制方 面的研究還不夠深入，縱觀國內外人肝癌細胞系模型，尚無來自門靜脈 癌栓轉移灶的人肝癌細胞系，無法對原發肺瘤細胞系和癌栓來源細胞系 的生物學行為進行對比研究，也就難以了解癌栓傾向性生長的分子機制，無法尋找癌^r形成的防治策略。
CN1338512A公開了利用人肝癌原位接種至棵鼠肝臟，從棵鼠的肺轉 移灶中取材建立了人肝癌細胞系，為肝癌肺轉移的機理和防治肺轉移提供 了適宜的實驗材料。CN1232874A公開了利用人肝癌高轉移的棵鼠模型移 植瘤作為建系瘤源，采用體外培養結合動物體內再接種生長的方式交替進 行，建成具有高轉移潛能的細胞系MHCC97。而來源于人肝癌門靜脈癌栓 的肝癌細胞系及其建系方法方面未見寺艮道。
發明內容
本發明的目的在于
(1 )、提供一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系； (2 )、 一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系的建系方法。 本發明的技術方案如下
一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系，它保藏在中國典型培養 物保藏中心，保藏號為CCTCCNO: C200814。
一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系的建系方法，包括以下步
驟
(1) 、癌栓細胞的獲取及原代培養；
(2) 、腫瘤細胞島的克隆擴大培養；
(3) 、腫瘤細胞的傳代培養。
所述，步驟(1 )和步驟(2 )使用D/F培養液，步驟(3 )使用D/F 培養液和羅M培養液。步驟(3)中肝癌細胞用D/F培養液培養，到20代以后，用DMEM培養液進行培養。
所述D/F培養液含有DMEM/F12，胎牛血清，其中還含有胰島素，EGF。 胰島素為4-6ug/ml， EGF10-30ng/ml。胰島素優選為5ug/ml， EGF優選為 20ng/ml。
本發明所公開一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系及其建系
方法，其優點表現在1、 CSQT-1細胞是從人門靜脈癌栓取材的，對肝癌
門靜脈癌栓形成機制及傾向性生長機制有其他現存肝癌細胞系無法比擬
的優點。(目前所存的肝癌細胞系多從人肝癌原發灶、人肝癌移植棵鼠模
型及該模型形成的肺轉移灶中取材，比如S畫C7721、 MHCC97、 HCCLM3 )。
2、 CSQT-1細胞中穩定表達CD133 +的細胞亞群約為20%。目前多數學者
認為CD133 +的肝癌細胞亞群具有肝癌干細胞樣活性。這4朱細胞系在研究
門靜脈癌栓形成過程中肝癌干細胞的作用及干細胞在腫瘤轉移機制中的
作用研究方向具有廣泛的應用前景。3、在原代培養時期，由于腫瘤細胞 經歷一個從體內到體外微環境的改變過程，腫瘤細胞不容易存活，在一般
體外培養條件下要使腫瘤細胞傳代是非常困難的。本發明使用了 DMEM/F12培養液添加適量的EGF和月夷島素，后兩者在所給出的濃度范圍 里能有效地維持肺瘤細胞在體外存活，并使其獲得永生性的可能大大增 力口。經過體外穩定傳代20代以后， 一般培養條件就能使細胞存活并傳代， 還能降低使用前一種培養液帶來的昂貴費用，故采用兩種培養液交替使 用，能有效、經濟地建立肝癌細胞系。4、取材方法的特異性從人肝癌 門靜脈癌栓取材建立的細胞系，具有門靜脈癌栓背景，對門靜脈癌栓的形 成機制研究提供了適宜的材料。
圖l:原代細胞培養l周后形成的"細胞島"(200 x )。
圖2:單層貼壁生長的CSQT-1細胞(200 x ),細胞為簇樣生長，細
胞成典型的上皮樣細胞，其形狀不規則，排列緊密，界限清楚，接觸性
抑制喪失。
圖3: CSQT-l掃描電鏡(2000 x )，細胞表面有鈹褶，周圍有微絨 毛或指狀突起，可見細胞間緊密連接。
圖4: CSQT-1細胞的生長曲線圖，在DMEM培養條件下，細胞群體倍 增時間為48. 2小時。
圖5: CSQT-1細胞^^妻種后貼壁率隨時間變化圖，種植4小時后大部 分細月包(95%以上)均可以貼壁生長。
圖6:第15代CSQT-1細胞中CD133 +的細胞亞群流式圖，該細胞中 一部分亞群細胞CD133 + ,可能具有肝癌干細胞樣活性。
圖7:第35代CSQT-1細胞中CD133 +的細胞亞群流式圖，該細胞中 一部分亞群細胞CD133+，可能具有肝癌干細胞樣活性。
圖8: CSQT-1細胞的核型分析圖，染色體為90條。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。 實施例l來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系的建立 一、材料
1.兩種不同的細胞培養液及其配制方法
1. 1培養液D/F: DMEM/F12 (1: 1)(美國GIBCO公司)，10% ( v/v )胎 牛血清(美國Biochrom AG公司)，EGF (Epidermal Growth Factor, 表皮生長因子)20ng/ml (美國Sigma公司)，5ug/ml胰島素，0. 30g/L的 L-谷氨酰胺，100U/L青霉素，100ug/L鏈霉素；
1.2培養液DMEM:高糖DMEM培養基(美國GIBC(VA司)，10% ( v/v ) 胎牛血清(美國BiochromAG公司)，0. 30g/L的L-谷氨酰胺，100U/L青霉 素，lQGug/L鏈霉素。
2. 其余細胞培養材料
細胞篩(美國BD公司)；程序凍存盒(美國NALGENE公司)；0. 05%1型 月交原酶溶液(美國Sigma Chemical />司，St. Louis， MO);月夷蛋白酶 消化液0. 25%胰酶(美國GIBCO公司)+ 0. 02%EDTA, PH值為7. 3;細胞凍 存液(DMEM: FBS: DMSO = 7: 2: 1 ); D-Hank， S洗液(PH值為7. 2-7. 4 );
3. 標本來源
上海東方肝膽外科醫院患者陳x x (住院號115360 ),男，43歲，術 前征得患者本人同意，簽署知情同意書，術中切除的肝癌及門靜脈癌栓 標本。術后病理診斷為肝細胞癌伴門靜脈癌纟全(病理號075074 )。
4. 實^驗動物
BALB/c-nu/nu棵鼠，鼠齡為4~ 5周，由中國科學院上海斯萊克實 驗動物中心提供。二、方法
乂A^肝癌和門靜脈癌栓中分別取材，釆用消化法獲取癌栓細胞，通 過原代培養、腫瘤"細胞島"的克隆擴大培養、腫瘤細胞的傳代培養等 步驟建立一抹能在體外穩定傳代的細胞系，具體的方法如下
1. 癌栓細胞的獲取及原代培養
將新鮮癌栓組織剔除血污及壞死組織，用含5倍濃雙抗(500u/mL青 霉素和500 ug/mL鏈霉素)D-Hank， S沖洗3次后剪成約1 mm3大小，用 0.1%的月交原酶(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)在37 。C下消化 30min,加入培養液DMEM (含l0°/。胎牛血清)終止消化，用75um孔徑的細胞 篩(cell strainer)過濾，除去未消化組織，在濾液中力口入D—Hank， s 液3ml， 1000rpm離心5min,棄去上清，用D-Hank， s液漂;先重懸細月包;;咒淀l 次，1000rpm離心5min，棄去上清，將沉淀細胞懸浮于培養液D/F，接種于 一次性塑料培一中(d=35mm),放入37。C， 5%0)2的空氣環境、飽和濕度 的細胞培養箱中培養。
2. 腫瘤"細胞島"的克隆擴大培養
培養數天后，通過腫瘤細胞克隆消化法，獲取純種的腫瘤細胞，對 肺瘤細胞進行擴大培養，避免了成纖維細胞對肺瘤細胞的抑制作用。具 體方法如下先將細胞接種到培養孤，培養5天 7天后，^艮多腫瘤細胞 凋亡，但出現了一些生長旺盛的"細胞島"(見圖l),在倒置相差顯孩丈鏡 下對這些"細胞島"位置在平孤底部用油性筆定位標記。將培養液吸棄， 加入2ml胰蛋白酶消化液預消化，使用20ul移液槍吸取10ul培養液，讓消 化液保持在槍頭管口處，將槍頭置于所標記的"細胞島"上面，吹出少量培養液，隨即將培養液重新吸回移液槍的槍頭內。將含細胞的培養液
種入24孔板內，加入約lml的D/F培養液繼續培養。每隔3 ~ 4天換2/3的D/F 培養液，細胞長滿皿底的80% ~ 90%后進行擴大培養。 3.腫瘤細胞的傳代培養
根據細胞的狀態及培養液顏色的變化，每隔3-4天更換2/3的D/F培養 液，細胞長滿亞底的80%-90%即應及時消化傳代，分種率1:2，接種細胞 密度為5xl0V皿(d = 100mm)。凍存液體外培養到20代以后，細胞生長 穩定，改換用DMEM培養液進行培養。
三、結果
來源于肝癌原發灶的細胞未能在體外連續傳代，而來源于門靜脈癌 栓的細胞則在體外連續傳代半年多，目前已傳至60多代，命名為CSQT-1。 具體如下
1. 癌栓細胞的原代培養
原代細胞貼壁生長，l周后出現6個較大的"細胞島"(見圖l)。
2. 胂瘤"細胞島"的克隆擴大培養
經過"細胞島"的克隆擴大培養法，在6孔板中有一個"細胞島，，來 源的細胞在5天后長滿皿底，傳代到小皿，6天后傳代到中亞，4天后傳代 到大皿(d = 100mm)，在大皿里4天后長滿皿底的80%, 4要1: 2傳代(已經 第六代)。此后細胞生長開始加速。
3. 肺瘤細胞的傳代培養
從第六代開始，每隔3天傳代一次，每次分種率為1:2，培養液使用D/F培養液。細胞生長穩定，到20代后，改換成DMEM培養液，細胞經過5 天的生長緩慢期，然后繼續以每3天一代的速度進行傳代，目前已經在體 外培養維持半年多，傳代至60余代，命名為CSQT-1。
實施例2
來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系生物學特性 在本實施例中，用常規方法對保存號為CCTCCNO: C200814的細 胞系CSQT-l進行生物學特性的;f全測。方法如下 一、實-瞼方法
1. 形態學 (1)大體形態
細胞接種2天后，觀察群體細胞的生長形態。 (2 )光鏡
在倒置相差顯微鏡下觀察培養的活細胞形態結構及其生長特點。 (3 )電鏡
取40代細胞，掃描及透射電鏡觀察細胞的超微結構。
2. 細月包動力學
(1)細胞生長曲線的繪制及細胞群體倍增時間 取生長良好的對數生長期細胞(第20代)，胰蛋白酶消化細胞，輕輕 吹勻，倍比稀釋，以每孔100ul ( 0. 6 x 1(T)接種于96孔板，每孔再加入 DMEM完全培養液lOOul,使細胞終濃度為3 x 107mL，每組3個復孔。另外 一組使用D/F培養液做對照，培養^li文入孵箱。24h后，在每組的3孔細胞中加入MTT20uL (5mg/mL),置孵箱培養4h后取出，吸盡上清，加入DMSO 150uL，置孵箱30min后取出，吸盡孔內液體至一空白96孔板，微型振蕩 儀上振蕩5min，選擇波長為550nm,在ELISA儀上測定吸光值，取均值， DMSO做空白對照。其余細胞每2天更換培養液。以后每24h測定吸光值， 連續7天，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。用半高度 法計算群體倍增時間。
(2 )細胞貼壁率
取對數生長期細胞，觀察細胞生長良好，胰蛋白酶消化細胞，輕輕 吹勻,稀釋懸液，計數，以每孔l. 2 x 104接種于24孔板中，共5孔，第0. 25h、 0. 5h、 lh、 2h、々h分別計數貼壁細胞數，計算出每個時間點的貼壁率， 并繪制貼壁率隨時間變化圖(見圖5)。
3. 染色體分析
第40代對數生長期的CSQT-1細胞經矛火水仙素(終濃度0. 05ug/mL)處 理1小時后，10%胰蛋白酶消化，1000r/min離心10min,吸去上清液。然 后用0. 075mol/L KCI ^f氐'滲處理30min,加入固定液(曱醇；水乙酸=3: l)混勻預固定，同前離心，吸去上清，再重復固定兩次，最后用適量固定 液，輕輕吹勻制成細胞懸液，水濕片滴片，室溫老化后將標本》文入預溫 87. 5。C的Earle， s溶液中溫育，片與片之間留有空隙，進行R顯帶，標 本溫育60min后，每隔5 ~ 10min取出1 ~ 2片，流水下沖洗。溫育時間約 在60~ 120min之間。用新鮮配制的10%Giemsa染色液染色8 ~ 10min,取 出水洗，待干，用Leica CW4000 Karyo分析軟件鏡檢分析。
4. AFP與HBsAg才企測分別取第10代和第40代的CSQT-1細胞的培養上清，1200轉/分離心12 分鐘，取上清，送第二軍醫大學東方肝膽外科醫院檢^r科，檢測AFP、 HBsAg等。
5. 凍存與復蘇
細胞的凍存每隔2-3代，留一皿細胞消化后進行凍存，具體方法如 下取一皿細胞常規胰酶消化后加入含血清的培養液終止消化后，進行 細胞計數，按1000轉/分離心5分鐘，棄上清，用凍存液重懸細胞，最后 凍存密度為l x 1()6個/ml,每個凍存管lml。凍存管放置到程序凍存盒(美 國NALGENE公司)內，-80。C過夜，次日放置到液氮中，長期保存。
細胞的復蘇從液氮中取出凍存管，在41。C水浴鍋中用力振蕩，在l 分鐘內使凍存液溶解，用1000轉/分離心5分鐘，棄上清，用培養液重懸 細胞，利用胎盤藍染色計數活細胞存活率，按1乂106個/皿(d = 100mm) 接種，》t^培養箱內培養，次日2/3量換液。
6. 異體成瘤
(1) 將對數生長期的CSQT-l細胞，用O. 25%胰蛋白酶消化后，1000 轉/分離心5分鐘，棄上清，用無血清的DMEM重懸細胞并加入等體積的 Matrix gel (美國BD公司)混合制成l x 1(^細胞/mL細胞懸液，備用；
(2) 實驗動物與動物飼養BALB/c-nu/nu棵鼠，4-6周齡，購自上 海中科院斯萊克實驗動物研究中心。實驗過程中，棵鼠飼養于局部IOO 級凈化飼養拒中，自由進水、進食。細胞接種及給藥均在局部100級凈化 工作臺中進行。
(3) 細胞異體接種4 6周齡BALB/c-nu/nu棵鼠，雌雄不拘，每組5只，每只在雙側鼠蹊部皮下接種CSQT-1細胞懸液，按細胞數量分為3 組，A組細胞數為8 x 104, B組細胞數8 x l o5, C組細胞數為8 x l o6。
(4)接種后第八天開始觀察成瘤情況。出現腫瘤塊，每隔4天稱棵 鼠體重，并用游標卡尺測量瘤塊的長徑(U和短徑(W)。體積(v)計算采用 經-險/>式v=(W、L)/2匪3。
7. 克隆形成率
接種分敉均勻的第40代CSQT-1細胞于6孔板中，每孔1000個細胞，加 入2mlDMEM培養液，靜止培養2-3周。當培養板中出現肉眼可見的克隆時， 終止培養。曱醇固定加適量結晶紫染料染色5分鐘，計凄t克隆凄t，取平均 值。集落形成率=克隆數/接種細胞數x 100%。
8. 腫瘤干細力包組分測定
利用目前通用的肝癌干細胞表面標記物CD133對CSQT-1細胞進行流 式細胞儀分析。分別對第15代和第35代細胞進行檢測。
二、實驗結果 1.形態學 (1)大體形態
細胞接種2天后，腫瘤細胞排列成索狀生長，與肝小葉排列相似(見 圖2)。
(2 )光鏡
在倒置相差顯微鏡下觀察培養的活細胞，大多呈多角形，胞漿豐富， 核大，iD形，核仁多個而明顯，可見核分裂和瘤巨細胞。(3 )電鏡
掃描電鏡顯示細胞表面有鈹褶，周圍有微絨毛或指狀突起。透射電 鏡顯示細胞外形不規則，核大有畸變，核質比例增大，核膜有凹陷，有 多個核仁，胞質內有豐富的游離核糖體、線粒體、內質網、溶酶體等細
胞器，細胞表面有微絨毛，可見細胞間緊密連接(見圖3)。
2. 細胞動力學
(1)細胞生長曲線的繪制
細胞在兩種不同培養基中的生長曲線見圖4。在DMEM培養條件下，利 用半高度法計算細胞群體倍增時間為48. 2小時。 (2 )細胞貼壁率
種才直4小時后大部分細胞(95%以上)均可以貼壁生長，細胞貼壁率 隨時間變化見圖5。
3. 染色體分析
染色體為三倍體和四倍體之間，主流在76-90條，占總數的58°/。，見圖8。
4. 肺瘤標志物及乙肝表面抗原檢測
第10代和第40代CSQT-l細胞培養上清均未檢測到AFP和HBsAg的分泌。
5. 凍存與復蘇
凍存后的細胞復蘇，細胞的存活率約為70%,活細胞培養狀況良好。
6. 異體成瘤
A組5只老鼠1個月未見明顯成瘤(0/5); B組有3只棵鼠^v第3周開始出現肺瘤塊，其余2只注射部位的注射包塊隨時間而逐漸消失，1
個月成瘤率為60% (3/5) ;C組棵鼠從第10天5只均開始出現明顯的 腫瘤塊，且有明顯的血供，至l個月時棵鼠成瘤率為100% (5/5)。
7. 克隆形成率
通過計算得到腫瘤細胞的克隆形成率為20 ± 3. 0% 。
8. 腫瘤干細胞組分測定
利用流式細胞儀檢測，第15代和35代細胞的CD133 ( + )細胞含量在 20%左右，見圖6，圖7。 實施例3
培養液D/F ( — )
DMEM/F12 ( 1: 1 )(美國GIBC(VA司)
10% (v/v)胎牛血清(美國Biochrom AG公司)
EGF (美國Sigma公司)20ng/ml
胰島素5ug/ml
L-谷氨酰胺O. 30g/L
青霉素1G0U/L
鏈霉素100ug/L
制備方法按上述濃度可制得培養液D/F。 實施例4
培養液D/F ( 二 )
DMEM/F12 (1: 1)(美國GIBCO公司)
10% (v/v)胎牛血清(美國Biochrom AG公司)EGF (美國Sigma公司)30ng/ml 胰島素4ug/ml L-谷氨酰胺O. 30g/L 青霉素1QGU/L
制備方法按上述濃度可制得培養液D/F。 實施例5
培養液D/F (三)
DMEM/F12 (1: 1 )(美國GIBC0/^司)
10% (v/v)胎牛血清(美國Biochrom AG公司)
EGF (美國Sigma公司)10ng/ml
胰島素6ug/ml
L-谷氨酰胺O. 30g/L
青霉素100U/L
鏈霉素100ug/L
制備方法按上述濃度可制得培養液D/F。
權利要求
1、一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系，其特征在于它保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NOC200814。
2、 一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系的建系方法，包括以下步驟(1) 、癌栓細胞的獲取及原代培養；(2) 、肺瘤細胞島的克隆擴大培養；(3) 、腫瘤細胞的傳代培養。其特征在于步驟(1)和步驟(2 )使用D/F培養液，步驟(3 )使用D/F 培養液和DMEM培養液。
3、 才艮據權利要求2所述的建系方法，其特征在于步驟(3)中肝癌細 胞用D/F培養液培養，到20代以后，用DMEM培養液進行培養。
4、 根據權利要求2所述的建系方法，其特征在于D/F培養液含有 DMEM/F12，胎牛血清，其特征在于還含有力夷島素，EGF。
5、 根據權利要求2所述的建系方法，其特征在于胰島素為4-6ug/ml, EGF10-30ng/ml。
6、 根據權利要求5所述的建系方法，其特征在于胰島素為5ug/ml, EGF20ng/ml。
全文摘要
本發明涉及微生物動物細胞領域，具體涉及來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系及其建系方法。本發明的技術方案如下一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系，它保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNOC200814。一種來源于人肝癌門靜脈癌栓的肝癌細胞系的建系方法，包括以下步驟(1)癌栓細胞的獲取及原代培養；(2)腫瘤細胞島的克隆擴大培養；(3)腫瘤細胞的傳代培養。其優點表現在CSQT-1細胞是從門靜脈癌栓取材的，對肝癌門靜脈癌栓形成機制及傾向性生長機制有其他現存肝癌細胞系無法比擬的優點。這株細胞系具有廣泛的應用前景。它的核型分析顯示為亞4倍體，占總數58％。
文檔編號C12N5/08GK101597591SQ20081003868
公開日2009年12月9日 申請日期2008年6月6日 優先權日2008年6月6日
發明者吳孟超, 程樹群, 胡華生 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院