專利名稱：一種動物源細菌對β-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術的制作方法
一種動物源細菌對3 -內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術 [發明領域j
本發明涉及動物源細菌8-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術，屬于醫學分f生
物學領域，具體是關于動物源細菌對e-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術方法及 其在耐藥性檢測中的應用。
B-內酰胺類藥物(B-lactam antibiotics)是指化學結構中具有B-內酰胺環的一大類抗生 素，根據B-內酰胺環側鏈的改變將其分為青霉素類、頭孢菌素類、頭,素類、單環內酰胺 類和非典型B-內酰胺類藥物。青霉素(penicillin)于1928年被Fleming發現，并于1939年 被Horey禾口 Chain提純，隨后開始應用于臨床，成為臨床上使用最早、用量最大的一種抗 生素，丌啟了一個偉大的抗生素時代。頭孢菌素類抗生素于20世紀60年代應用于臨床， 具有抗菌作用強、耐青霉素酶、臨床療效高、毒性低、過敏反應較青霉素類少等優點，尤 其是第三代頭孢菌素對革蘭陰性桿菌的抗菌活性強，為目前應用最廣的一類B-內酰胺類藥 物。世界衛生組織(WHO) 2003年統計數據表明B-內酰胺類藥物的使用量分別占動物源、 人源抗生素使用總量的約30%、 40%。我國這一比例更是達到30%-70%。
B-內酰胺類藥物主要作用機制是與細菌細胞膜上青霉素結合蛋白(penicillin binding proteins, PBP)結合，抑制細菌肽聚糖的合成，使細菌無法形成堅韌的細胞壁，導致細菌 死亡；而哺乳動物真核細胞無細胞壁，故不受影響。自B-內酰胺類藥物應用于臨床伊始， 細菌對該類藥物的耐藥性便隨之產生。90年代以來，幾乎所有的B-內酰胺類藥物均有相應 的水解酶出現并導致細菌耐藥。近年來，B-內酰胺類藥物的耐藥菌逐漸增多，多重耐藥現 象閂趨嚴重，已成為獸醫和人醫臨床抗感染治療的重要難題。
根據目前研究水平，細菌(尤其是革蘭氏陰性桿菌)對B-內酰胺類藥物的最主要耐藥機 制是產生B-內酰胺酶。近年來，隨著B-內酰胺類藥物的大量使用，B-內酰胺酶種類也在不 斷增加、新B-內酰胺酶亞型也在不斷涌現。由B-lactamases引起的細菌耐藥受到了最為廣 泛的重視，成為該類藥物耐藥機理的研究的重點、難點和關注焦點。
根據氨基酸序列的同源性，可將e-內酰胺酶分為不同的基因亞型。世界范圍內，不同 地區動物源性細菌產e -內酰胺酶有其地域特征。西班牙動物源性B-內酰胺酶多為TEM-1 、 SHV-1 (Zarazagaefa/， 2002);德國(Guerraete/， 2003)、美國(Bradfordefa/， 1999)和英 國(Ransallefa/， 2004)情況相似，TEM-1是最常見的動物源性B-內酰胺酶；葡萄牙動物源 性大腸桿菌中檢測出TEM-1和SHV (Antunesete/， 2004; Ferreiraete/， 2002)。 CTX-M型e-內酰胺酶在世界范圍內迅速傳播，在日本、葡萄牙、西班牙、法國等國均有報道
(Morenoete/， 2003; Costaete/' 2004; Bonnerefa/， 2004; Matsumotoefa/， 1988; Teshagerete/， 2000)。香港從豬、牛及鴿子分離了產CTX-M-23、 CTX-M-13、 CTX-M-14 或CTX-M-24大腸桿菌。四川大學動物疾病防控生物工程研究中心對我國19個省97個規 模化豬場分離的602株細菌分子流行病學調查發現，我國主要流行TEM、 SHV和CTX-M 型。本專利在以.匕分子流行病學調查的基礎上，建立了 TEM、 SHV禾PI CTX-M型6-內酰胺 酶耐藥基因三重PCR檢測技術和方法。
目前，細菌耐藥性檢測技術方法主要有常規藥敏試驗、抗性蛋白檢測技術和耐藥性分 子檢測技術等。常規藥敏試驗山于方便、簡捷、易判定等優點，尤其是藥敏紙片瓊脂擴散 法，常用于臨床指導用藥。但藥敏試驗是在體外用藥物試探性地檢驗細菌的表型耐藥特性， 不能檢測細菌潛在的耐藥性及耐藥基因的來源和傳播趨勢。抗性蛋白檢測法由于操作繁瑣， 儀器要求高，不夠穩定等原因， 一般主要用于對細菌的耐藥機理方面的研究。
我國畜禽耐藥性檢測控制與畜產品安全生產中，在藥物耐藥基因的研究開展得少，尚 無配套的檢測試劑盒。耐藥基因檢測技術主要有PCR(多重PCR)及PCR-限制性片段長度 多態性(PCR-RFLP)技術、PCR-單鏈構象多態性(PCR-SSCP)技術以及DNA序列測定等， 其中又以多重PCR技術最有研究前景和應用價值。因為抗菌藥物的廣泛使用以及耐藥基因 的多樣性和復雜性，單一臨床病原菌經常含有多種耐藥基因，為了提高檢測的準確性和特 異性，需要對多種耐藥基因同時進行檢測。多重PCR技術的發展正滿足了這種需求，其具 有敏感、特異、快速等優點，可以對極微量的目的基因進行檢測。自從Chamberlain (1988) 首次應用多重PCR擴增多個人類肌營養不良蛋白基因以來，多重PCR己發展成為一種通 用技術，廣泛應用于病原體鑒別、性別篩選、連鎖分析、法醫研究、模板定量和遺傳疾病 診斷。在病原體鑒別方面具有突出的優點，多重PCR技術可指示許多病原體中的某一個， 或區分同一屬中的種或株。近年來，多重PCR技術越來越廣泛的應用于細菌耐藥性的檢測 上。
本發明的目的是提供一種快速檢測動物源細菌對B-內酰胺類藥物耐藥基因的三重PCR 檢測技術方法
技術領域：
本發明的目的是通過以下技術方案達到的
一種動物源細菌對e -內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術，含有PCR模板制備 試劑和細菌耐藥基因三重PCR擴增試劑，其特征在于所述PCR模板制備試劑是由洗滌液、樣品處理液組成，所述細菌耐藥基因三重PCR擴增試劑包括10倍PCR緩沖液，其 組分為50mM KCI、pH8.3的10mM Tris.HCI和0.01%明膠，濃度均為2.5 mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP，濃度為25mM/L MgCI2，濃度均為25mmol/L三種耐藥基因特異 性上下游引物，即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因，濃度為5U/ULTaq DNA聚合酶
和超純水。所述動物源細菌B-內酰胺類藥物耐藥基因二 重PCR擴增試劑各組分的終濃度如 下1倍PCR緩沖液，dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP的終濃度各為0.25mmol/L， MgCI2 的終濃度為2.5mM /L， B-內酰胺類藥物耐藥基因CTX-M、 SHV和TEM的終濃度分別為 0.8mmol/L、 0.5 mmol/L、 0.25 mmol/L， Taq DNA聚合酶終濃度為0.8U/100UL。
一種優選技術方案，其特征在于所述樣品前處理方法只需離心收集菌體后，經相應 處理液處理即可備用。
一種優選技術方案，其特征在于所述PCR模板制備試劑洗滌液的成份為5%的甘油。
一種優選技術方案，其特征在于所述PCR模板制備試劑樣品處理液的成份為60%
的甘油。
一種優選技術方案，其特征在于所述的動物源細菌B-內酰胺類藥物耐藥基因的三重 PCR擴增是將濃度配比適當的三種B-內酰胺類耐藥基因上下游引物混在一起擴增。
一種優選技術方案，其特征在于所述三種耐藥基因即的特異性上下游引物序列如下
CTX-M:
For: 5'-AGTGAAAGCGAACCGAATC-3' Rev: 5'- CTGTCACCAATGCTTTACC -3' SHV:
For: 5'-ATGCGTATATTCGCCTGTG-3' Rev: 5'- CCTCATTCAGTTCCGTTTCC-3' TEM:
For: 5'-CAGAAACGCTGGTGAAAGTA-3' Rev: 5'- ACTCCCCGTCGTGTAGATAA -3'
一種動物源細菌對e -內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術包括以下步驟
1 .PCR模板的制備方法如下
(1) LB培養基搖瓶培養增菌，包括動物糞樣、組織液、血液或其它體液；
(2) 取1 ml經LB培養基搖瓶培養4-6 h的菌液于無菌1.5mlEP管中，8000-1 OOOOrin離心3min，
棄上清，再加入1mlPCR模板制備試劑洗滌液，重復離心一次，棄上清，最后加入50-200ul PCR模板制備試劑樣品處理液，震蕩混勻后備用。
2.動物源細菌B-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR擴增試劑的配置方法如下 (1)根據現有技術合成上述耐藥基因特異性引物CTX-M、 SHV禾[]TEM，用1 mmolTris.Hcl-0.1mmolEDTA緩沖液稀釋，使其濃度為25 mmol/L;
(2)取10倍的PCR緩沖液，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP混合物， 濃度為25mM/LMgCI2，濃度均為25mmol/L 3:類耐藥基因即CTX-M基閃、SHV基因、TEM
基因的特異性上下游引物，濃度為2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超純水^入無菌的PCR反 虔辨壁管中。
3. ^]物源細菌B-內酰fe類藥物財藥基因檢測試劑的保存:將動物源細W B-內酰胺類藥物耐藥 基因檢測試劑保存于-2(TC冰箱中。
4. 動物源細菌B-內酰胺類藥物fcl藥基因三重PCR檢測技術的試劑組成
(1) 取10倍的PCR緩沖液5/ul，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP混合 物4pl，濃度為25mM/LMgCI25/il，濃度為2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.8pl，濃度均為 25mmol/L三種耐藥基因即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因特異性上下游引物分別0.4pl、 0.25/il、 0.125)Ul于一無菌的PCR反應薄壁管中。
(2) 加入己制備好的模板5)Ul，補水至總體積50"l后加入20/il礦物油封頂即可。 5. PCR擴增循環參數為
(1) 94'C預變性5min ;
(2) 然后進入循環94 。C變性50s、 56 'C退火55s、 72 'C延伸60s，共30個循環，最后72°C 延伸5min后，取出于4'C保存。
6.耐藥基因檢測結果判定
(1) 取5iUlPCR產物，與1/;l Loading buffer混勻后，點樣于2 %瓊脂糖凝膠電泳板孔中，80V 電壓,電泳40min,于紫外熒光成相儀下拍照判定，結果可見365bp、 502bp、 719bp的條帶， 分別指示CTX-M基因、SHV基因和TEM基因；
(2) 直接測序鑒定法將經過純化的PCR產物50jul和20)Ul三基因的上下游引物一起送上海 生工生物有限公司進行DNA測序。
下面通過附圖對本發明做進一步說明，但并不意味著對本發明保護范圍的限制。
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圖1為日-內酰胺類耐藥基因三重PCR檢測技術結果判定電泳實例圖。其中l號泳道為 DL2000DNAMarker, 2號泳道為陽性對照，3號泳道為陰性對照，4號泳道為檢測陽性樣品 (含SHV基因)。
權利要求
1、一種動物源細菌對β-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術，含有PCR模板制備試劑和細菌耐藥基因三重PCR擴增試劑，其特征在于所述PCR模板制備試劑是由洗滌液、樣品處理液組成，所述細菌耐藥基因三重PCR擴增試劑包括10倍PCR緩沖液組分為50mMKCl、pH8.3的10mM Tris.HCl和0.01％明膠，濃度均為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，濃度為25mM/L MgCl2，三大類耐藥基因即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因的特異性上下游引物濃度均為25mmol/L，濃度為5U/ULTaq DNA聚合酶和超純水。所述動物源細菌β-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR擴增試劑各組分的終濃度如下1倍PCR緩沖液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的終濃度均為0.25mmol/L，MgCl2的終濃度為2.5mM/L，β-內酰胺類藥物耐藥基因CTX-M、SHV、TEM的終濃度分別為0.8mmol/L、0.5mmol/L、0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶終濃度為0.8U/100UL。
2、 根據權利要求1所述的耐藥基因三重PCR檢測技術，其特征在于所述樣品前處理中只需離心收集菌體后，經相應處理液處理即可備用。
3、 根據權利要求1所述的耐藥基因二重PCR檢測技術，其特征在于所述PCR模板制備試劑洗滌液的成份為5%的甘油。
4、 根據權利要求1所述的耐藥基因，其特征在于所述PCR模板制備試劑樣品處理液的成份為60%的甘油。
5、 根據權利要求1所述的耐藥基因三重PCR檢測技術，其特征在于所述的動物源細菌(3-內酰胺類藥物耐藥基因的三重PCR擴增是將濃度配比適當的三大類B-內酰胺類耐藥基因上下游引物混在一起擴增。
6、 根據權利要求1所述的耐藥基因三重PCR檢測技術，其特征在于所述三種耐藥基因即 CTX-M基因、SHV基因和TEM基因特異性上下游引物序列如下CTX-M:For: 5'-AGTGAAAGCGAACCGAATC-3' Rev: 5'- CTGTCACCAATGCTTTACC -3' SHV:For: 5'-ATGCGTATATTCGCCTGTG-3' Rev: 5'- CCTCATTCAGTTCCGTTTCC-3' TEM:For: 5'-CAGAAACGCTGGTGAAAGTA-3' Rev: 5'- ACTCCCCGTCGTGTAGATAA-3'。
7、 一種動物源細菌B-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術包括以下步驟[1] PCR模板的制備方法如下(1) LB培養基搖瓶培養增菌，包括動物糞樣、組織液、血液或其它體液；(2) 取1ml經LB培養基搖瓶培養4-6 h的菌液于無菌1.5mlEP管中，8000-10000rin離心3min，棄上清，再加入1mlPCR模板制備試劑洗滌液，重復離心一次，棄上清，最后加入50-200ulPCR模板制備試劑樣品處理液，震蕩混勻后備用。[2]動物源細菌對B-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR擴增試劑的配置方法如下(1) 根據現有技術合成上述耐藥基因特異性引物CTX-M、 SHV禾卩TEM，用1 mmol Tris.Hcl-0.1mmolEDTA緩沖液稀釋，使其濃度為25 mmol/L;(2) 取10倍的PCR緩沖液，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP混合物， 濃度為25mM /L MgCI2，濃度均為25mmol/L三大類耐藥基因即CTX-M基因、SHV基因、 TEM基因的特異性上下游引物，濃度為2.5U/ULTaq DNA聚合酶和超純水裝入一無菌的PCR反應薄壁管中。[3].動物源細菌B-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術中試劑的組成(1) 取10倍的PCR緩沖液5pl，濃度各為2.5mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP混合 物4/il，濃度為25mM/LMgCI25jul，濃度為2.5U/ULTaq DNA聚合酶0.8)Ul，濃度均為 25mmol/L三大類耐藥基因即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因特異性上下游引物分別0.4 yl、 0.25yl、 0.125ixl于一無菌的PCR反應薄壁管中。(2) 加入已制備好的模板5pl，補水至總體積50;ul后加入20pl礦物油封頂即可。 [4]. PCR擴增循環參數為(1) 94"預變性5min ;(2) 然后進入循環94 。C變性50s、 56 'C退火55s、 72 。C延伸60s，共30個循環，最后72°C 延伸5min后，取出于4'C保存。問耐藥基因檢測結果判定(1) 取5julPCR產物，與1pl Loading buffer混勻后，點樣于2 %瓊脂糖凝膠電泳板孔中，80V 電壓，電泳40min，于紫外熒光成相儀下拍照判定，結果可見365bp、 502bp、 719bp的條帶， 分別指示CTX-M基因、SHV基因和TEM基因；(2) 直接測序鑒定法:將經過純化的PCR產物50pl和20/7l三基因的上下游引物一起送上海生 工生物有限公司進行DNA測序。
全文摘要
本發明涉及一種動物源細菌對β-內酰胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測技術，該方法包括擴增待測細菌耐藥基因的三對PCR引物以及PCR模板制備試劑和細菌耐藥基因多重PCR擴增試劑。較傳統藥敏試驗，該多重PCR方法將檢測時間從3-4天縮短至1天內完成。病原菌經常含有多種β-內酰胺酶基因，而該技術滿足了同時檢測多種基因的需求，提高了檢測的準確性和特異性。該技術可用于檢測臨床分離菌中三種β-內酰胺類藥物耐藥基因。
文檔編號C12Q1/68GK101532050SQ20081004576
公開日2009年9月16日 申請日期2008年8月8日 優先權日2008年8月8日
發明者葉滿玉, 夏青青, 毅 張, 張安云, 曾瑜虹, 鑫 楊, 王紅寧, 田國寶 申請人:四川大學