專利名稱：一種脫除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法
技術領域：
本發明屬于生物轉化領域 技術背景紫杉垸是含有紫杉烷母核的多個化合物的總稱，屬芋二萜類化合物。舉杉醇(paclitaxel,商品名taxol)是其中的一種，于1967年由美國化學家Wall 和Wani等從太平洋紫杉(又名短葉紅豆杉，Taxus. brevifolia)樹皮中提取 出來，是當前癌癥治療研究中的一線藥物(Wall ME， Wani MC， Taylor HL. Isolation and chemical characterizaticin of antitumor agent from plants. Cancer Treat R印.1976， 60:1011-1014; Wani MC， Taylor HL ， Wall ME, Coggon P， McPhai AT. VI: The isolation and structure of taxol， a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J. Am. Che血.Soc. 1971, 93: 2325—2327)。紅豆杉類植物由于生長緩慢，資源極其珍貴，已被列 入國家一級保護植物。為尋找替代資源，全世界做了大量的努力，目前尚無很 好的解決辦法(Ramesh N. Patel, Tour de paclitaxel biocatalysis for semisynthesis， A諷Rev.Microbiol, 1998, 98: 361—394)。 7-木糖紫杉烷類 化合物在紅豆杉枝葉中的含量十分豐富，能達到紫杉醇含量的10倍。將7-木糖 基紫杉烷類物質轉化成紫杉醇，是一種提高紅豆杉資源利用效率現實可行的方 法。將7-木糖基紫杉垸轉化為相應的紫杉烷，Murray等發明了用高碘酸鈉等化 學法水解脫去7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，(Murray ,Christopher K，Beckvermit ， et al . United States Patent: 5,412,116， 1995， 5， 2.)。 溆春芳^^mT氧化法水解紅豆杉浸膏中的7-木糖基紫杉醇生成紫杉醇的方法(趙春芳，余龍江，李麗琴等，氧化水解法提高紅豆杉浸膏中紫杉醇產率的研究，天然產物研究與開發，2006 , 18 : 95-99)。但化學法脫木糖基所需的時間長， 化學藥品有不同程度的毒性，還會污染環境；對于有多個手性中心的紫杉烷來 講，過量的氧化劑、酸度、溫度等條件會引起紫杉垸的降解，導致紫杉垸的收 率降低，對于紫杉醇這種昂貴的藥品來說，損失是很大的。施貴寶公司發明了一種用微生物或酶的方法分解7-木糖基紫杉烷中木糖基 的方法，并申報了相應的專利(US Patent 5700669, 1995, 4)。在他們的專利中， 報道了多個有水解7-木糖基紫杉烷中木糖基能力的細菌，分布在三個屬，艮P: 桿菌屬(》ac/"^)，莫拉氏菌屬Ufome77a )，微球菌屬(^'"ococcw力等。 本發明的目的在于獲得了一些新的產7-木糖基紫杉烷水解酶的微生物類群—— 鏈霉菌屬(5Tre/)/o邁7ce51 )，如馬特鏈霉菌(i^r"t咖yce《邁"e/2"'s0， 異硫 鏈霉菌(iSYre/^o邁yces a/fA/o〃cw力，i^re/7^7邁7"ces ^r/seo/^e/w1.類芽孢 桿菌屬 (/^e"/63"V/ws) 如 戶aefli6s"'"z/s ，6w// ， 無色桿菌屬假單胞菌屬(？"i^o邁o/7W),如惡臭假單胞菌(i^ew/o邁oi7as尸w"'^)， Aewfo邁朋^ a^7/朋2'/等，它們具有較高的分解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶 活。特別是以下的菌種馬特鏈霉菌[i^r印"邊/cef鵬,朋w's (x61)]，類芽孢 桿菌[戶ae"/^3"'"zwi7由"(m25)]，無色桿菌[JcAr咖o6a"er柳"^(m55)〗， 惡臭假單胞菌[/^e^^zw加;y戶tf"Va (ml29)]具有較高的水解7-木糖基紫杉烷 中木糖基的能力.發明內容本發明使用新的微生物類群——鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬、無色桿菌屬、 假單胞菌屬的微生物專^&地降解J二木糖基紫杉烷中木糖基,！ l位的糖苷基水解成羥基。本發明所述的7-木糖基紫杉烷降解成為相應紫杉烷的方法由以下步驟組成一、 從木聚糖含量較高的植物材料中提取出木聚糖或直接使用含有木聚糖 成分的植物性材料為唯一碳源配制培養基；滅菌。二、 接種鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬、無色桿菌屬、假單胞菌屬中的菌株于 已滅菌的培養基中。接種后，搖瓶在100—400rpm 15-37。C條件下培養3-7天， 誘發微生物產生相應的轉化酶。三、 將轉化底物7-木糖基紫杉烷用有機溶劑溶解后加入到發酵液中；或從 發酵液中提取出轉化酶的粗酶制劑，酶經固定化或不經固定化處理，酶溶于水 中或有機溶劑中，再將有機溶劑溶解的底物加入到酶液中進行轉化。四、 轉化后的產物經大孔樹脂吸附或有機溶劑萃取，也可直接將發酵液濃 縮，再經柱層析方法純化后即可進入后續的加工處理階段。在有機溶劑中轉化 的底物可以直接濃縮或經柱層析純化。在步驟一中，培養基含有木聚糖的目的在于使鏈霉菌、.類芽孢桿菌、假單 胞菌、無色桿菌等微生物能在木聚糖的誘導下產生木糖苷酶，這些微生物產生 的木糖苷酶能降解7-木糖基紫杉烷中的木糖基。木聚糖在培養基中的含量在 0. 1%-10%之間。本發明所述的木聚糖，可以是含木聚糖的甘蔗渣、玉米芯等植物材料，也 可以是這些植物材料經過堿如NaOH、 KOH等處理后提取出來的提取物。本發明所述的微生物屬于鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、無色桿 菌屬的微生物，在發酵液中的接種用量為0. 01%-10%.這些菌能夠產生專一性地 降解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶或能力，使7-冰糖基紫^^烷啦助木糖基能夠被有效脫除。本發明所指的含有木糖基的紫杉烷包括一系列含有紫杉烷母核且在7位含 有木糖基的化合物，主要有7-木糖基紫杉醇，7-木糖基-lO-脫乙酰紫杉醇， 7-木糖基三尖杉磷堿，7-木糖基-10-脫乙酰三尖杉磷堿等。'本發明所述的紫杉垸底物，可以純化到一定純度，如含量70 /。以上的7-木 糖基紫杉烷,也可以是含有7-木糖基紫杉烷的植物浸膏,含量可以低至1%左右。 加入的底物可以是含有一種7-木糖基紫杉垸的底物，也可以是幾種7-木糖基紫 杉烷的混合物。本發明中能溶解紫杉垸的有機溶劑包括甲醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二甲基亞砜等；或者是由幾種溶劑所組成的混合溶劑。本發明所指的紫杉垸木糖苷酶，是經發酵后由微生物分泌到發酵液中，使 用時可以是未經任何濃縮或提取的發酵液或發酵液的稀釋液，也可以是將轉化 酶濃縮或提純至不同純度的酶液或發酵液。也可以是用硫酸銨或其它方法提純 到較高純度的固體酶。提取出來的酶也可以是經過不同固定化方式處理或不經 固定化處理，轉化時的介質是水或有機溶劑。本發明要解決的技術問題是通過含有木聚糖的培養基培養新的產生紫杉垸7-木糖苷酶的微生物，能降解各種7-木糖基紫杉烷中的木糖基生成相應的紫杉 烷。該產物包括可經純化后直接作為藥用的紫杉醇，也可以包括經過半合成后 成為紫杉醇或多烯紫杉醇的前體化合物。該技術由以下的特征組成培養基中必須含有一定量的木聚糖，便于所接 種的微生物經誘導后產生木聚糖酶；必須接種純的鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬、 無色桿菌屬、假單孢菌屬中的一個微生物菌株；接種后必須培養一定時間(3-7 天)，接種微生物才能產生足夠多的酶；含有7-木糖紫杉垸必須用有機溶劑溶解 后加入到培養好的發酵液中或提取出來釣酶中。轉化定時伺后經提取純化即可。有益效果是通過微生物對7-木糖紫杉烷中木糖基的專一性降解，.脫掉了 其中的木糖基，可以直接用來生產紫杉醇，或者可用于合成紫杉醇或多烯紫杉 醇的前體物質，可以大幅度地提高紅豆杉資源的利用效率，增加了新的轉化微 生物類群，且后處理工藝十分簡便。為了更好的理解本發明,.下面用實驗數據進行說明用下列配方配制培養基甘蔗渣木聚糖3%，磷酸氫二鉀1%,磷酸二氫鉀 0. 5%,硫酸銨0. 1%,檸檬酸鈉G. G51配制培養基溶液3QG毫升，分裝入3個 500毫升的玻璃瓶中，每瓶裝量為100亳升，121-C高壓滅菌15min，將馬特鏈 霉菌(i^re/7^ ,es咖/朋".y X61)接入液體培養基中，28。C300rpm培養7 天。將7-木糖基紫杉醇30mg溶解于10ml的甲醇溶液中，分裝入三個已培養好 菌體的發酵液中，轉化30小時后，合并發酵液，用二氯甲烷150ml分3三次萃 取，萃取物用旋轉蒸發儀減壓濃縮后，濃縮物經柱層析純化，結構解析，確認 為紫杉醇。經高壓液相色譜儀定量測定，得紫杉醇22mg，產品收得率為73%。具體實施例1、將玉米芯粉碎成能過80目篩的粉未，按下列配方配制培養基溶液300 毫升.玉米芯粉7%，磷酸氫二鉀1%,磷酸二氫鉀0. 5%，硫酸銨0.1%，檸檬酸 鈉0. 05%。配制好的培養基分裝入3個500毫升的玻璃瓶中，每瓶裝量為100毫 升，121。C高壓滅菌15min，將馬特鏈霉菌(^re^咖yces咖^i^/力接入發酵 培養棊中，28。C300rpm培養6天。用紗布濾去菌體，合并濾液。用10ml丙酮溶 解7-木糖-10-脫乙酰紫杉醇50nig，加入到發酵濾液中，繼續轉化3天。用XAD 大孔樹月旨吸附，然后用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，用旋轉蒸發儀蒸干，經高 壓液相色譜儀定量測定，得10-脫乙酰紫杉醇35mg，產品收得率為70%。 10-脫乙酰紫杉醇經乙酰化后即可得到紫杉醇。二2、 用下列配方配制培養基玉米芯木聚糖3%，磷酸氫二鉀W，磷酸二氫 鉀0.5%，硫酸銨0.1%，檸檬酸鈉0.051配制培養基溶液300毫升，裝入3個 500毫升的玻璃瓶中，每瓶裝量為100毫升，12rC高壓滅菌15min，將無色桿 菌[JcAro邁o6a"er ^a/ /w;y(m55)]接入液體培養基中，28。C300rpm培養7天。收集發酵液，用紗布濾去菌體，加入硫酸銨至飽和，過濾收集沉淀，得轉化粗 酶制劑10mg，再將粗酶制劑溶于100ml水中，將7-木糖基紫杉醇30mg溶解于 15ml的甲醇溶液中，再加入配好的酶液中，轉化30小時后，用二氯甲烷150ml 分3三次萃取，萃取物用真空旋轉蒸發儀濃縮后，經高壓液相色譜儀分析測定， 得紫杉醇21mg。3、 用下列配方配制培養基甘蔗渣木聚糖3%,磷酸氫二鉀1%,磷酸二氫 鉀0. 5%,硫酸銨0. 1%,檸檬酸鈉0. 051配制培養基溶液300毫升，裝入3個 500毫升的玻璃瓶中，每瓶裝量為100毫升，121'C高壓滅菌15min,將惡臭〗叚 單胞菌[(Pseudomonas Putida (ml29)]接入液體培養基中，28'C300rpm培養 7天。合并發酵液，用紗布濾去菌體，加入硫酸銨至飽和，過濾收集沉淀，得轉 化粗酶制劑，將粗酶制劑加入到含有7-木糖基三尖杉磷堿30mg的50ml氯仿中， 轉化50小時后，用硅膠柱層析分離，得三尖杉磷堿20mg得，收率為66%。
權利要求
1、一種脫除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特征在于該方法由使用含有木聚糖成分的培養基培養鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的微生物，誘導所接種的微生物產生相應的酶后，加入7-木糖基紫杉烷到培養基中進行轉化，再將產物提取出來等步驟組成。
2、 根據權利要求1所述的酶法脫除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特征在 于所接菌種的微生物為鏈霉菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、類芽孢桿菌屬中 的一種。
3、 根據權利要求1或2所述的脫除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特征在 于轉化時7-木糖基紫杉垸底物的濃度百分比為0. 001-1%。或提取出轉化所需的 酶后，固定化后或直接以游離酶在有機溶劑中轉化，轉化濃度為0. 01-20%。
4、 根據權利要求1或2或3所述的脫除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特 征在于所述的溫度為10-7(TC,轉化菌的培養時間為3-10天，轉化時間為0.5 小時至150小時。
全文摘要
本發明涉及一種用微生物或酶法脫除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法。本發明所述的方法由以下步驟組成一、將含有木聚糖的培養基滅菌后，接種鏈霉菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、類芽孢桿菌屬中的一種微生物，培養3-10天；二、用溶劑溶解7-木糖基紫杉烷，加入到已培養好的培養液中，濃度為0.001％-0.2％，在15-37℃條件下培養3-7天；或提取轉化酶，制成粗酶制劑，固定化后或直接以游離酶在水中或有機溶劑中轉化0.5-150小時，濃度為0.001％-20％。本發明要解決的技術問題是通過鏈霉菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、類芽孢桿菌屬的微生物所產生的能分解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶，將7-木糖基紫杉烷中的木糖基降解，得到相應的紫杉烷。
文檔編號C12P17/02GK101215589SQ20081005800
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月7日 優先權日2008年1月7日
發明者周繼蓉, 煜 張, 松 李, 王興紅 申請人:云南大學