專利名稱：：水楊酸-g-殼寡糖接枝物及其合成方法
技術領域：
：本發明涉及水楊酸-g-殼寡糖接枝物及其合成方法。(二)
背景技術：
：兩親性高分子聚合物膠束作為難溶性藥物載體材料，是近幾年用于提高難溶性藥物溶解度的一個新手段。聚合物膠束是由兩親基團在溶劑中自發形成的核-殼狀結構，和常用的表面活性劑相比，具有較低的臨界膠束濃度和穩定的空間結構，能夠體現出特有的生物穩定性。通過對親水、疏水二部分基團的選擇和修飾，可賦予聚合物膠束不同的特性，以滿足不同藥物結構和給藥部位的要求。納米尺寸的聚合物膠束還具有"增強了的滲透和滯留作用"，對于腫瘤靶向治療有特殊意義。殼聚糖，是天然存在的、陽離子多糖。可生物降解，具有良好的生物相容性。由于殼聚糖具有一系列特殊的化學和生物性質，適合作為藥物的控緩釋載體，被廣泛用于制劑研究。然而，由于殼聚糖呈高分子量、高粘性和高乙酰化，使得它不溶于一般的有機溶劑和水，這為其廣泛應用造成了很大困難。為了改進其溶解性，人們對其進行了許多改性工作，其中經過酸溶和酶解得到的低分子殼寡糖保留了殼聚糖的優點，改進了其缺點，是理想的親水性骨架材料，可用于聚合物膠束的構建。通過對殼寡糖分子量的調控，可實現膠束粒徑的人為控制；其具有打開細胞膜間隙的能力，有利于聚合物膠束跨膜的轉運；糖鏈上大量游離的自由氨基，為膠束接枝疏水性基團或其他功能基團提供可能。水楊酸是能將難溶性藥物溶解度提高的向水性化合物，它在水中呈微溶，化學結構為苯環上帶有相鄰的一個羧基和一個羥基。它不僅含有H鍵，而且是以難溶性藥物大都具有的苯環結構存在。它主要是通過M鍵與難溶性藥物的苯環相互作用，增加了和難溶性藥物之間的作用力，從而提高了難溶性藥物在水中的溶解度，同時也增加難溶性藥物進入水溶性介質后的穩定性。研究表明紫杉醇在3.5M水楊酸鈉水溶液中的溶解度為5.543mg/ml，這與紫杉醇在純水中的溶解度(0.3ug/ml)相比，增加了大約18，000倍。事實上，水楊酸鈉對于難溶性藥物的增溶性已廣為人知并加以利用，它常被加在體外釋放介質中營造漏槽條件。但是作為小分子化合物，水楊酸鈉作為藥物載體時，容易隨藥物進入細胞，產生毒性。因此，需要將水楊酸與其他化合物接枝或嵌段共聚成高分子化合物作為藥物載體材料。武雪芬等提出了一種殼聚糖-g-水楊酸及合成方法[合成化學，2005年第13巻第5期，461-463頁]，該方法是以高分子的殼聚糖和水楊酸為原料，在一定溫度下和無溶劑或適量溶劑中通過攪拌或研磨反應，使得殼聚糖上的氨基和水楊酸的羧基自動吸附脫水制得殼聚糖-g-水楊酸，但該方法產物后處理比較麻煩。并且，該方法由于采用高分子的殼聚糖為原料，所以制得的殼聚糖-g-水楊酸也不可避免地帶上了殼聚糖本身的一些缺陷，如溶解性能不佳等，在應用上面受到限制。中國專利申請200510107271.8公開了一種水楊酸與殼聚糖-2，6位接枝物及其制備方法，其接枝物的結構為不僅在殼聚糖糖元的2位的自由氨基上接枝水楊酸，而且在殼聚糖糖元的6位甲氧基上也接枝了水楊酸。其中以6位接枝物為主。
發明內容本發明要解決的技術問題在于提供一種水楊酸-g-殼寡糖接枝物及合成方法，該水楊酸-g-殼寡糖接枝物在水性介質中，通過自聚集形成水楊酸-g-殼寡糖膠團，可作為水難溶性藥物的載藥膠束。本發明所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物，其結構通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(I)其中R二所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物通過殼寡糖和水楊酸接枝聚合得到，所述殼寡糖的分子量為1100kDa，脫乙酰度為70100%，所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物中殼寡糖鏈上的部分自由氨基被水楊酰基取代，氨基取代度為180%。本發明還提供了一種水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的制備方法為選取分子量為1100kDa、脫乙酰度為70100%的殼寡糖，用水溶解，在595。C加入用有機溶劑溶解的水楊酸和碳二亞胺的溶液，在595。C反應280小時，反應液經分離純化得結構如通式(I)所示的水楊酸-g-殼寡糖接枝物；所述的有機溶劑能溶解水楊酸和碳二亞胺，也能與溶解殼寡糖的溶劑互溶，可以是乙醇、乙腈等，優選乙醇。本發明所述的反應物投料物質的量比殼寡糖糖元2位上自由氨基數水楊酸碳二亞胺為1:0.01-1:1-20。所述的分離純化可采取如下步驟反應液經透析純化，透析后的溶液冷凍干燥得到水楊酸-g-殼寡糖接枝物粗品，將水楊酸-g-殼寡糖接枝物粗品溶于水中，超聲處理，離心，取上清液冷凍干燥得到水楊酸-g-殼寡糖接枝物純品。所述的透析采用膜截留分子量為3500的透析膜，所述的超聲處理采用探頭超聲。本發明所述的殼寡糖可按照如下方法制備:選取脫乙酰度為701000%的殼聚糖，在40-60"C和pH4.0-6.0條件下，按纖維素酶與殼聚糖比例0.1-5:100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖，以粘度法控制殼聚糖的降解程度，所得殼聚糖的降解液，經過濾除去雜質，選擇合適的超濾膜超濾分級，超濾液冷凍干燥，得所述的殼寡糖。進一步，在40-6(TC和pH4.0-6.0條件下，最好先通過攪拌使殼聚糖充分溶脹，然后加入纖維素酶進行降解反應。與現有技術相比，本發明的有益之處主要體現在a)本發明選用分子量為1100kDa、理化性質相對穩定的殼寡糖作為原料，研究表明，分子量小于200kDa的殼寡糖，具備在較高pH環境下的良好水溶性，且細胞毒性隨分子量的下降而顯著降低。因此，本發明制備得到的水楊酸-g-殼寡糖接枝物，以向水性化合物水楊酸為疏水性部分，以殼寡糖為親水性部分，在水性介質中，能通過自聚集形成水楊酸-g-殼寡糖膠團，可作為水難溶性藥物(如一些抗癌藥物)的載體，將大大豐富給藥手段、提高療效。b)本發明所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物的合成方法簡單，后處理容易。(四)圖1是實施例1制得的殼寡糖的'H-NMR譜圖。圖2是水楊酸的iH-NMR譜圖。圖3是實施例1制得的水楊酸-g-殼寡糖的^-NMR譜圖。(五)具體實施例方式下面以具體實施例來對本發明的技術方案作進一歩的說明，但本發明的保護范圍不限于此實施例1(1)殼寡糖的制備取市售分子量為550kDa的殼聚糖(70%脫乙酰度)，在55。C和pH5.0條件下攪拌2小時，使殼聚糖充分溶漲后，按纖維素酶與殼聚糖比例0.5:100(w/V)加入纖維素酶(上海伯奧生物科技有限公司生產)，降解殼聚糖。以粘度法控制殼聚糖的降解程度。所得殼聚糖的降解液，經過濾除去雜質，使用分子量為10kDa和30kDa的超濾膜進行超濾分級。取分子量介于10kDa和30kDa的超濾液冷凍干燥，得脫乙酰度為70%、分子量18.0kDa的殼寡糖。(2)水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備精密稱取0.2756g碳二亞胺(EDC)和0.0397g水楊酸(Salicycleacid，SA)置于3ml的無水乙醇中(A液)，然后精密稱取0.1g的殼寡糖(CSO)置于6ml的蒸餾水(DW)中(B液)，在25"時，將A液滴加到B液中，25'C下反應53hr。冷卻后，轉入透析袋(MWCO=3500)透析24小時后，預凍，凍干即得粗產品。將粗產品溶于一定量的水中，探頭超聲(400w，超聲2s，間隔3s，40次)，4000rmp離心10min，取上清液預凍，凍干即得純化后的載體材料。采用氫譜核磁共振。H-NMR)確認CSO-g-SA的結構.實施例2-5按照表1所列的合成處方制備水楊酸-g-殼寡糖接枝物，其他條件同實施例1。表l:不同分子量和接枝率的水楊酸-殼寡糖(SA-g-CSO)的合成處方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例6:水楊酸-g-殼寡糖接枝物的理化性質測定分別以實施例1-5制得的水楊酸-g-殼寡糖接枝物作為測試對A.采用三硝基苯磺酸法，測定所得水楊酸-g-殼寡糖接枝物的氨基取代度。取不同重量的某分子量殼寡糖(0.59mg)，精密稱定，分別溶于2ml的蒸餾水中，加入4X(w/v)的碳酸氫鈉溶液2ml和0.l%(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37。C孵育2h。加入2N鹽酸2ml，搖勻，超聲趕走氣泡，在344nm波長處測定吸光度值(A)，得到該分子量殼寡糖的氨基取代度標準曲線。稱取適量該分子量殼寡糖的水楊酸接枝物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，測定344nm波長處的吸收值，按標準曲線計算殼寡糖-水楊酸嫁接物的氨基取代度。計算方法氨基取代度SD=N/X。其中X為每molCSO上含有游離NH2的個數，N為每molCSO被取代的NH2的個數，而A糖/A載體4(m糖/M糖)/(m載體/M載體)P[X/(X-N)]B.采用芘熒光法測定，水楊酸-g-殼寡糖接枝物的臨界膠團濃度。取0.5ml0.0012mg/ml芘放入10ml的試管中，放入5(TC烘箱揮干芘(約6hr)。配制0.05mg/ml500mg/ml不同濃度的空白載體溶液5ml,將5ml這些各濃度的空白載體溶液加入到已揮干芘的試管中，使芘的終濃度為7X10—7molL—'在37。C的搖床中振搖過夜。測定熒光。將激發光譜固定在339nm，激發光譜的狹縫固定在10nm,發射光譜的狹縫固定在2.5nm，掃描速度為1500nm/min，激發電壓為400V.掃描350-450nm發射光譜，測定芘在374nm、384nm處的熒光強度。根據測定得到的1374/1384計算臨界膠團濃度。C.測定水楊酸-g-殼寡糖接枝物膠團的粒徑及Zeta電位。取水楊酸-g-殼寡糖接枝物10mg，精密稱定，溶解于蒸餾水，探頭超聲20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制備1mg/ml的水楊酸-g-殼寡糖接枝物膠團溶液。Zetasizer3000HS分析儀測定殼寡糖-水楊酸接枝物膠團的粒徑及Zeta電位。經測定，殼寡糖-水楊酸接枝物的理化性質見表2表2.殼寡糖-水楊酸接枝物的理化性質(n二3)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1、一種水楊酸-g-殼寡糖接枝物，其結構通式如下其中id="icf0002"file="A2008100626480002C2.tif"wi="44"he="22"top="114"left="35"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物通過殼寡糖和水楊酸接枝聚合得到，所述殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70～100％，所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物中殼寡糖鏈上的部分氨基被水楊酰基取代，氨基取代度為1～80％。2、一種如權利要求1所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的制備方法為選取分子量為1100kDa、脫乙酰度為70100%的殼寡糖，用水溶解，在595'C加入用有機溶劑溶解的水楊酸和碳二亞胺的溶液，在595。C反應280小時，反應液經分離純化得所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物。3、如權利要求2所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的反應物投料物質的量比殼寡糖糖元2位上自由氨基數水楊酸碳二亞胺為1:0.01-1:1-20。4、如權利要求2所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的分離純化為反應液經透析純化，透析后的溶液冷凍干燥得到水楊酸-g-殼寡糖接枝物粗品，將水楊酸-g-殼寡糖接枝物粗品溶于水中，超聲處理，離心，取上清液冷凍干燥得到水楊酸-g-殼寡糖接枝物純品。5、如權利要求2所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的有機溶劑為乙醇或乙腈。6、如權利要求4所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的透析采用膜截留分子量為3500的透析膜。7、如權利要求4所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的超聲處理采用探頭超聲。8、如權利要求27之一所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于所述的殼寡糖按照如下方法制備選取脫乙酰度為70100%的殼聚糖，在40-60。C和pH4.0-6.0條件下，按纖維素酶與殼聚糖比例0.1-5:100(w/w)加入纖維素酶，降解殼聚糖，以粘度法控制殼聚糖的降解程度，所得殼聚糖的降解液，經過濾除去雜質，選擇合適的超濾膜超濾分級，超濾液冷凍干燥，得所述的殼寡糖。9、如權利要求8所述的水楊酸-g-殼寡糖接枝物的制備方法，其特征在于在40-6(TC和pH4.0-6.0條件下，攪拌使殼聚糖充分溶脹，然后加入纖維素酶進行降解反應。全文摘要本發明公開了一種水楊酸-g-殼寡糖接枝物及其合成方法，所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物的結構通式如式(I)所示。所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物通過殼寡糖和水楊酸接枝聚合得到，所述殼寡糖的分子量為1～100kDa，脫乙酰度為70～100％，所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物中殼寡糖鏈上的部分氨基被水楊酰基取代，胺基取代度為1～80％。本發明所述水楊酸-g-殼寡糖接枝物的合成方法簡單，后處理容易，制備得到的水楊酸-g-殼寡糖接枝物，以向水性化合物水楊酸為疏水性部分，以殼寡糖為親水性部分，在水性介質中，能通過自聚集形成水楊酸-g-殼寡糖膠團，可作為水難溶性藥物的載體，將大大豐富給藥手段、提高療效。文檔編號C12P19/16GK101314622SQ200810062648公開日2008年12月3日申請日期2008年6月26日優先權日2008年6月26日發明者杜永忠,胡富強,弘袁,魏曉紅申請人:浙江大學