專利名稱：應用流式細胞術中的散射光及自發熒光參數進行粘孢子蟲分類的方法
技術領域：
本發明涉及魚類寄生粘孢子蟲的分類，具體的說，涉及一種通過流式細胞 術中的散射光及自發熒光參數進行粘孢子蟲分類的方法。
技術背景流式細胞儀是在上世紀70年代發展起來的一種對細胞特征及細胞或細胞器 的組成進行定性及定量分析的方法，其基本原理是光學和電學原理。近年來， 隨著細胞和分子生物學技術尤其是單克隆抗體技術的發展和分子探針的開發， 流式細胞技術日見成熟，在國內外被廣泛應用于醫學基礎研究和臨床實踐。目 前流式細胞儀在腫癌學、臨床細胞免疫學，血液病及相關病征的診斷和治療中 應用較多。粘孢子蟲是一類對水養殖業具有嚴重危害的一類病原孢子蟲。對粘孢子蟲 的研究，尤其對其系統地位的研究，是目前國際間研究的一個熱點，經典的形 態分類學一直將粘孢子蟲視為一種單細胞動物迸行研究，但在分子技術問世后， 粘孢子蟲的單細胞地位逐漸受到人們的質疑；直至目前，當分子手段亦用于揭 示某些粘孢子蟲分類學上的系統地位時，國際間大部分的分子數據都認為粘孢 子蟲應歸屬多細胞起源的動物。由于該蟲體孢子階段具備堅硬的幾丁質外殼， 如要破殼并保持其內的原生質體的完整性是實驗過程中難以攻克的一個環節， 因此，這成為人們始終對粘孢子蟲細胞學的數據知之甚少的主要原因。粘孢子蟲的形態分類學主要是人們以光鏡下蟲體的形態結構進行主觀能動 性的經驗判定，相對來說涉及的主觀因素較多，故有時難免會存在失誤或不準 確之處；分子手段雖可在一定程度上解決部分形態學上的疑難種或存疑種，但 其同樣存在主觀因素的類似問題，故引入一種可不依賴于人為因素的判定粘孢 子蟲的方法是亟待進行的。 發明內容本發明的目的在于提供一種運用流式細胞術進行粘孢子蟲分類的方法，該 方法應用流式細胞術檢測粘孢子蟲散射光及自發熒光參數以獲取散點圖與直方 圖進行直觀比較。本發明的技術方案如下首先收集需要區分的粘孢子蟲材料；將需要使用的相關儀器及設備進行校正儀器Nikon E-600生物顯微鏡，Nikon SMZ1500體視鏡，流式細胞儀(美 國BDFASCSCalibur)，離心機(Hermle Z323K)等；儀器校正及數據獲取分析檢測前應用流式細胞儀自帶程序并以標準校正微 球校正儀器；采用CdlQuest軟件獲取數據并進行數據分析。 步驟l，樣品的制備1) 破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將粘孢子蟲的孢囊壁戳破， 待其孢子完全流出。2) 提純制備單細胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內的孢子 清洗干凈，然后濾膜多次過濾去雜屑；超聲波振碎，離心，去上清，加 PBS后振蕩；以上過程3 5次重復；最后一次離心后加PBS懸浮孢子，待其單個孢子完全分散開后調整其濃度達1 X 105 1 X 106/ml 。 步驟2，上機檢測將制備好的粘孢子蟲的單細胞懸液進行上機檢測并用CellQuest獲取數據分 別以散點圖與直方圖顯示。其中散點圖分別以SSC與FSC (二者均為散射光) 為縱橫坐標顯示，并且具備相應的數值；而直方圖則分以收集細胞數目與自發 熒光強度為縱橫坐標顯示。步驟3，數據分析和比較，將各獲取的粘孢子蟲的單細胞懸液的散點圖和直 方圖分別進行比較研究，以此可提示兩點重要信息(1)有無自發光熒光可作為 一種類判定指標；(2)如果有自發熒光，則強度會以相應的峰值顯示。通過獲取 的各粘孢子蟲的單細胞懸液的散點圖和直方圖，以及疊加比較，便可比較容易 地判定所測的粘孢子蟲是否為同種。流式細胞儀要獲取的兩種重要的物理參數是散射光(FSC與SSC)與自發 熒光，其中散射光是不依賴于任何細胞樣品的制備技術(如染色)的參數，因 此，它具物種的穩定性；通常情況下，FSC常與被測細胞的大小有關，確切是 與細胞直徑的平方密切相關，故它常與細胞的大小呈正相關；SSC常與細胞內 的精細結構及顆粒性質相關，故它常與胞內的復雜程度呈正相關。而自發熒光 也具有物種或細胞特異性，并不是所有的粘孢子蟲都具有自發熒光，或者具有 自發熒光的不同蟲種的熒光強度(峰值)亦存在差異。有益效果本發明可直接從各數據及圖形的情況(如散點圖中細胞群的數 量、直方圖中峰的數目及峰值的分離等)進行觀察分析得出結果；同時也可通 過數據圖形進行疊加比較，亦可判斷每種粘孢子蟲的物理固有值(如FSC、 SSC 及自光熒光)的穩定性，通過這些物理固有值的比較即可獲得比較結果。該方法檢測方便、快捷。如果對每種粘孢子蟲的相關物理參數(如散射光及自發熒光)進行測定、分析、存檔；然后通過對待分析的多種粘孢子進行相同的測定后進 行對比分析，(如在已測定完足夠的蟲種的情況下)即可比較容易地判斷出為具 體的某一種粘孢子蟲。同時檢測中不需任何染色方法的介入即可排除人為主觀 因素對判定蟲體的影響。
圖1為粘孢子蟲Afyxo6o/wawyw〃/ca/ww/us的形態結構圖； 圖2為粘孢子蟲M^ra6o/w e/7&《縱wa/^的形態結構圖；圖3為茅占孢子蟲A^ao6o/wS訓戶///￡ ，1^ 的散點圖；圖4為粘孢子蟲Afyxo6o/ws aw/ w肌ca;ww/ws的自發熒光直方圖；圖5為粘孢子蟲A^o6o/ws ep/^wawato的散點圖；圖6為粘孢子蟲Afyjcok)/ws ep/^wa/wg/^的自發熒光直方圖；圖7為兩禾中茅占孢子蟲A^ao6o/ws a/wp"http://^/^/ ^禾口 A^:o6o/wj e/ /w""脂/z'j 的混合上樣散點圖；圖8為兩禾中茅占抱子蟲il^xo6o/ws am/ w〃/ca/ww/us禾口 Afyxo6o/ws 的混合上樣的自發熒光直方圖；圖9為圖1中Ml標注的為紅色細胞群；圖10為圖1中M2標注的為綠色細胞群。
具體實施方式
實施例11、材料所選取的兩種粘孢子蟲隸屬于碘泡蟲屬下的兩種不同的碘泡蟲，分別為綺jco6o/ms ampw〃/o 戸w/ws 及 A^o:o&o/ws wawa/Zs 。
其中 Afyxo6o/w5aw/w〃/ca/ww/ws采自重慶淡水鯽魚的魚暨絲，而A^xo6o/m ep/^wawa/Zs貝!j采自廈門沿海的海水淄魚之皮膚鱗片上，且二者都已形成孢囊。2、 儀器及儀器校正儀器Nikon E-600生物顯微鏡，Nikon SMZ1500體視鏡，流式細胞儀(美 國BDFASCSCalibur)，離心機(Hermle Z323K)等儀器校正及數據獲取分析檢測前應用流式細胞儀自帶程序并以標準校正 微球校正儀器；采用CdlQuest軟件獲取數據并進行數據分析。3、 樣品的制備及檢測破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將Af;o:o6o/iw ampw肌ca/ww/w;y 及Mjao6o/ws ep/wwama"s的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。提純制備單細胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內的孢子清 洗千凈，然后將孢子經過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎約5min， 12000 rpm/min 離心5min，加PBS懸浮，去上清；重復3次操作；最后一次離心后加PBS懸 浮，待其單個孢子完全分散開后調整其濃度達1X105 lX106/ml左右，然后 上樣檢測并獲取數據。就形態學特征而言，Afyjco6o/船ampM仿ca/ww/us屬于中到大型的淡水粘孢子 蟲，蟲體平均直徑均超過lOjxm (參見圖1)，而A^coZjo/mj e/ /ww"ma//j則屬于 相對小型的海水粘孢子蟲，其蟲體直徑均低于l(Him (參見圖2)。按如下設計方 案進行實驗研究。具體方案如下首先取采自淡水鯽魚的M;^o6o/w "w; w〃/ca戸w/附及海水淄 魚的il^xo6o/^e;^^^wafe的單細胞懸液上機檢測，分別獲取二者的散射光及 自發熒光的數據，以散點圖及直方圖分別顯示。其中圖3為A^;co6o/"《 ^^///a^w^的散點圖，圖4為其自發熒光的直方圖；同樣，圖5為M^co6o/"sepz'^w"wato的散點圖，圖6為其自發熒光的直方圖。通過圖3 (A^ro6o/w aw/w肌ca/ww/us)與圖5 (Afyjco6o/w ep/^wama/^s)的散點圖的比較可以看出 Afyxo6o/w fl附戸〃fca戸w/us的FSC值明顯大于Afyxofto/ws e/ —認則//51， 說明 A^ao6o/iw am/ 滿ca戸w/tw的個體普遍較Afyxo6o/ws e/7/5^wamafc大，這與二者的 形態學數據一致；同時A/丌o6o/附amp"〃/ca戸w/"s的SSC值也大于il^jco6o/船 ep/^Mamato ， 貝(J說明 A^x。6o/wj aw/w〃/ca/wiz/us 的胞內結構較 Afyxo6o/ws 印/^w"mafo復雜，這是單純的形態學手段難以觀察及揭示的特征。從各自的自 發熒光圖亦可看出二者的自發熒光強度明顯不同，其中A^jco6o/w flwpw//z'ca/ww/ws的自發熒光強度明顯強于Afyxo6o/"51 e/j/s^af/wa^s: Jl^xo6o/i^ ampw〃/ca/ww/"s的自發熒光峰值約在102處，而A^;co6o/ws e/ /ww"wa/^的自發 熒光峰值卻遠低于102 (介于10'與102之間)。 實施例21、材料；2、儀器及儀器校正；與實施例l相同， 3、樣品的制備及檢測破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將Mjao6o/ws am/w///ca/ww/Ms 及M;;jco6o/m印/wMamato的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。提純制備單細胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內的孢子清 洗干凈，然后將孢子經過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎10min， 6000 rpm/ min 離心10min，力HPBS懸浮，去上清；重復4次操作；最后一次離心后加PBS懸 浮，待其單個孢子完全分散開后調整其濃度達1X105 lX106/ml左右，然后 上樣檢測并獲取數據。具體方案如下將制備好的二者的單細胞懸液等比例混合后，再將此混合液進行上機檢測并獲取相關數據。(參見圖7)從散點圖可觀察到二者雖有交叉聚集，(參見圖8) 但從自發熒光直方圖則可觀察到兩個明顯的峰，說明獲取的混合單細胞懸液中 確實存在兩個不同的蟲種。根據兩個峰分別以Marker設門，便可輕易地將散點 圖中聚集的二者區別開來其中通過Ml設門可將紅色細胞群分辨及分離出來 (如圖9所示)；通過M2設門可將綠色細胞群分辨及分離出來(如圖IO所示)； 而且綠色細胞群的FSC及SSC值均大于紅色細胞群，則說明綠色細胞群的個體 大小及胞內復雜程度均明顯大于或強于紅色細胞群，這與分別上樣獲取數據結 果一致，根據該結果即可推斷Ml標注的紅色細胞群為M盧o6o/M甲/^""附"/&， 而M2標注的綠色細胞群貝U為A^x:o6o/ws aw/w肌ca; s"/"s。 比較研究為了驗證分別獲取及混合獲取數據時，兩種粘孢子蟲各自物理固有特征 (FSC， SSC及自發熒光)的穩定性，我們分別作了疊加比較研究(圖4)。疊加研究一單獨調出M盧o6o/w am/^///ca;ww/w的自發熒光圖，然后將之 與M^ro6o/M印/^觸m"to的自發熒光圖疊加，發現二者的自發熒光強度截然不 同Afyxo6o/us awpz^/Zcapsw/ws明顯強于Afyxo6o/ws卬&《"(3附<3/&，這與分另!j獲取 的自發熒光強度比較結果一致。疊加研究二單獨調取混合液的自發熒光圖，然后將之與二者先前獨立上 樣時的自發熒光圖進行疊加，分別獲取的自發熒光強度峰值恰好與以混合上樣 獲取的峰值相吻合。該研究結果表明每種粘孢子蟲都具各自獨立、穩定的自發 熒光。實施例31、材料；2、儀器及儀器校正；與實施例l相同； 3、樣品的制備及檢測破孢囊于Nikon SMZ1500體視鏡下用解剖針將A/yjcoZjo/w aw/ w〃/ca;w"/us 及M"o6o/ms e/7/^wamato的孢囊壁戳破，待其孢子完全流出。提純制備單細胞懸液用PBS清洗孢子及孢囊壁，盡量將孢囊內的孢子清 洗干凈，然后將孢子經過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎5min， 10000 rpm/ min 離心8min，加PBS懸浮，去上清；重復操作5次；最后一次離心后加PBS懸 浮，待其單個孢子完全分散開后調整其濃度達1X105 1X10Vml左右，然后上樣檢測并獲取數據。具體方案如下將制備好的二者的單細胞懸液按7: 3的比例混合后，再將 此混合液進行上機檢測并獲取相關數據。(參見圖7)從散點圖可觀察到二者雖 有交叉聚集，(參見圖8)從自發熒光圖仍可觀察到兩個明顯的峰，說明獲取的 混合單細胞懸液中確實存在兩個不同的種。根據兩個峰分別以Marker設門，便 可輕易地將散點圖中聚集的二者區別開來:其中通過M1設門可將紅色細胞群分 辨及分離出來如圖9所示；通過M2設門可將綠色細胞群分辨及分離出來如圖 10所示。而且綠色細胞群的FSC及SSC值均大于紅色細胞群，則說明綠色細胞 群的個體大小及胞內復雜程度均明顯大于或強于紅色細胞群，這與分別上樣獲 取數據結果一致，根據該結果即可推斷Ml標注的紅色細胞群為A/^oco6o/m 印is^a附a^，而M2標注的綠色細胞群貝!j為A^:vo6o/ws "wpw〃/ca戸w/1^。 比較研究為了驗證分別獲取及混合獲取數據時，兩種粘孢子蟲各自固有特征(FSC， SSC及自發熒光)的穩定性，我們分別作了疊加研究(圖4)。疊加研究一單獨調出^/>^060^"柳戸//&"戸"/ > 的自發熒光圖，然后將之 與A^xo6o/w epz^"amafe的自發熒光圖疊加，發現二者的自發熒光強度截然不 同Afy:w6o/us "附/ m〃/c";wm/"s明顯強于il^;co6。/wj《/ /5^"0/ 0/&，這與分另廿獲取 的自發熒光強度比較結果一致。疊加研究二單獨調取混合液的自發熒光圖，然后將之與二者先前獨立上 樣時的自發熒光圖進行疊加，分別獲取的自發熒光強度峰值恰好與以混合液獲 取的峰值相吻合。該研究結果仍表明每種粘孢子蟲的都具各自獨立、穩定的自 發熒光。
權利要求
1、一種應用流式細胞術中的散射光及自發熒光參數進行粘孢子蟲分類的方法，其特征在于包括如下步驟步驟1樣品的制備，收集進行分類的粘孢子蟲，將收集的粘孢子蟲的孢囊壁戳破，提取流出孢子；然后將孢子經過濾膜過濾去雜屑；超聲波振碎5～10min，6000～12000rpm/min離心5～10min，加PBS懸浮，去上清，以上過程3～5次重復，最后一次離心后加PBS懸浮，待其單個孢子完全分散開后調整其濃度達1×105～1×106/ml；步驟2將制備好的粘孢子蟲的單細胞懸液進行上機檢測，CellQuest獲取數據，且數據分別以散點圖與直方圖顯示；步驟3數據分析和比較。將各獲取的粘孢子蟲的單細胞懸液的散點圖和直方圖分別進行比較研究，得出結果。
2、 根據權利要求1所述應用流式細胞術中的散射光及自發熒光參數進行粘孢子蟲分類的方法，其特征在于步驟1所述將孢囊壁戳破，提取流出孢子是在Nikon SMZ1500體視鏡下，用解剖針將粘孢子蟲的孢囊壁戳破后待其孢子完 全流出，使用適合蟲體大小孔徑的濾膜過濾，超聲波破碎并將其制成單細胞懸 液。
3、 根據權利要求1所述應用流式細胞術中的散射光及自發熒光參數進行粘 孢子蟲分類的方法，其特征在于步驟2，散點圖分別以SSC為縱坐標，以FSC 為橫坐標，以揭示粘孢子蟲的蟲體大小及內部結構的復雜程度；直方圖以收集 細胞數目為縱坐標，以自發熒光強度為橫坐標，以揭示粘孢子蟲的自發熒光的有無或自發熒光的強度<
全文摘要
本發明公開了一種應用流式細胞術中的散射光及自發熒光參數進行粘孢子蟲分類的方法，步驟如下材料的收集、儀器校正、樣品的制備、上機檢測、流式細胞學數據分析；其中數據分析是先進行分別上樣獲取的散點圖與直方圖的比較分析，然后再進行與混合上樣獲取的散點圖與直方圖分別進行對比研究，并通過相關數據及圖形的比較研究，得出結果。本發明檢測方便、快捷。如果對每種粘孢子蟲的相關物理參數(如散射光及自發熒光)進行測定、分析、存檔，(如在已測定完足夠蟲種的情況下)然后通過對多種待測粘孢子進行相同的測定，并進行對比分析，即可比較容易地判斷出為具體的某一種粘孢子蟲。
文檔編號C12Q1/04GK101245368SQ20081006948
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月20日 優先權日2008年3月20日
發明者唐發輝, 唐安科, 趙元莙 申請人:重慶師范大學