專利名稱：：創傷血清對炎性細胞NF-κB的激活作用檢測及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種創傷血清對炎性細胞NF-icB的激活作用檢測及其用途，用于早期判定嚴重創傷患者炎癥反應狀態。技術背景大量研究證實，核因子kB(nuclearfactorkB，NF-kB)的活化在介導促炎細胞因子的分泌方面扮演重要角色。有學者基于對NF-kB的過度活化在膿毒癥發生發展中的重要性認識，早期測定了嚴重膿毒癥患者外周血中單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)中的NF-kB活性，發現其NF-kB活性的急劇增高與隨后的死亡密切相關，表明其活性測定對嚴重膿毒癥95患者的不良結局具有重要的預測價值。但對于嚴重創傷患者，PBMC中的NF-icB活性測定對其預后判定并無參考價值。Adib-Co叫uy等發現，嚴重創傷患者PBMC中的NF-!cB活性于傷后1、3、5、IO天降低，但該變化與創傷血清中升高的抗炎細胞因子白細胞介素10(interleukin-lO，IL-10)和轉化生長因子(3(transforminggrowthfactor-p，TGF-p)并無明顯相關性，同時發現創傷患者PBMC細胞核內的p65p50/p50p50比值降低，但在傷后感染者與未感染者之間、死亡者與存活者之間并無差異；Biberthaler等發現，嚴重多發傷患者外周血中的單核細胞的NF-icB活性于傷后6小時內急劇增高，但12小時后至傷后3天即減低到難以檢測的水平。Stegmaier等發現嚴重創傷患者外周血中的多型核嗜中性粒細胞(polymorphonuclearneutrophil,PMN)的NF-kB活性于傷后1.5小時及6小時時相點內急劇增高，且在死亡者組增加更為明顯，存活組在24小時時相點PMN的NF-kB出現第二次增高，48小時即降至難以測定水平。但PMN的NF-KB活性與新的損傷嚴重度積分(newinjuryseverityscore,NISS)及多器官衰竭(multipleorganfailure,M0F)積分均無明顯的相關性。表明嚴重創傷患者外周血白細胞NF-icB活性于傷后早期(6小時內)急劇升高而隨后降低(即免疫麻痹狀態)的變化對于創傷機體的預后判定，參考價值較小。盡管創傷后肝、肺組織白細胞中NF-kB的活化常持續更長的時間，但由于取材不便，古j[對其進4丁測定的JIS/宋豐旨導價值不大。業已證明，促炎細胞因子/抗炎細胞因子比值的測定較單一測定血清中促炎細胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNFa等)、抗炎細胞因子(如IL-IO、sTNFR、IL-lRa)更能客觀地反應機體的炎癥反應狀態，并進而預測機體的器官功能的炎性損害及死亡結局。但對創傷機體的反應而言，創傷血清中內毒素、TGF-p、PGE2、兒茶酚胺、糖皮質激素、膽堿、神經肽等水平均可出現不同程度的增高，這些因子均參與介導了機體的促炎/抗炎反應過程并分別對免疫細胞的NF-icB活性產生正向/負向調節作用。因此如能綜合測定嚴重創傷患者外周血清中上述眾多因子(包括其他尚未發現的體液因子)共同對炎性細胞NF-icB活性的影響，則可更加客觀地反映創傷機體的炎癥反應狀態，并用于預測創傷患者的不良結局。這對于指導嚴重創傷患者早期干預措施的實施、挽救其生命具有重要的臨床意義。
發明內容本發明的目的是提供能夠早期判定嚴重創傷患者炎癥反應狀態的方法。本發明的另一目的是提供該方法的應用。本發明的另一目的是提供一種試劑盒，含有pNF-icB-LUC質粒，Lipofectamine2000轉染試劑，細胞培養裂解試劑，熒光素酶分析試劑。其中所述pNF-kB-LUC質粒，Lipofectamine2000轉染試劑，細胞培養裂解試劑，熒光素酶分析試劑，等均為現有技術，可以在市場上購買得到。將市場上購買到的試劑組成在一起包裝，每個包裝中，各試劑的量為i份到io份，本發明還提供本發明的試劑盒在檢測創傷血清對炎性細胞NF-kB的激活度數值中的應用。其中所述的炎性細胞，是指單核/巨噬細胞、多型核白細胞、淋巴細胞、內皮細胞等細胞株或上述各類細胞的原代細胞。其中所述的炎性細胞是離體培養的炎性細胞。其中的激活度數值能夠判定早期嚴重創傷患者炎癥反應狀態。其中所述分析，是將正常血清組與創傷血清組對NF-kB的激活度數值進行比較。其中所述比較，是將正常血清組與創傷血清組對NF-kB的激活度數值進行比較，與正常血清組相比，創傷血清組對NF-KB的激活度數值明顯增大，與正常血清組相比，MODS組、死亡組中所述增大分別較非MODS組、存活組更為明顯。以上應用是用在創傷患者器官功能炎性損害及死亡結局的判定中。其中所述創傷患者器官功能炎性損害是指創傷患者腦、心、肺、肝、腎、胃腸功能的繼發性炎性損害。本發明還提供一種創傷血清對炎性細胞NF-icB的激活度數值的檢測方法，其特征在于，用本發明的試劑盒中的試劑進行檢測，檢測方法包括以下步驟1、細胞培養將炎性細胞接種于96孔細胞培養板，調整細胞數為0.7X105/孔，分為炎性細胞組、炎性細胞+pNF-KB-LUC(0.48ug)組、炎性鄰胞+PNF-kB-LUC(0.48ug)+正常血清(10%)組、炎性細胞十pNF-kB-LUC(0.48ug)+創傷血清(10%)組。2、質粒轉染將0.48ugpNF-kB-LUC質粒加入50y1無血清無抗生素的1640培養基中，混勻；將1.2u1Lipofectamine2000轉染試劑加入50y1無血清無抗生素的1640培養基中，在室溫下混勻，放置5rain;將二者在室溫下混勻，放置20min;加入到上述相應細胞培養孔中，培養24h。3、加入血清離心培養板，將各孔中的液體吸出，用D-Hanks液洗細胞1次，于上述相應細胞培養孔加入正常/創傷血清20u1，并補加RPMI-1640完全培養基至200ul/孔，使血清終濃度為10%，培養細胞6h。4、裂解細胞離心培養板，將各孔中的液體吸出，用PBS洗細胞1次，于上述各孔加入細胞培養裂解試劑100u1，作用10min;吸出液體至0.5mlEp管中，冰浴、旋渦振蕩lmin，室溫12000r.p.m離心2min;小心吸取上清，直接檢測或放入一70"C冰箱保存。5、熒光素酶活性檢測放好檢測板，每孔加入100ul上清，再加入100ul熒光素酶分析試劑，于免疫發光檢測儀上立刻讀數，打印或記錄數據。本發明提供的檢測方法是根據以下實驗內容得到的。創傷血清對NF-kB的刺激活性測定選擇既往無心肺疾患、糖尿病、自身免疫性疾病史，ISS評分〉=16的多發傷患者47例。傷后7天21天并發多器官障礙綜合征(MODS)者18例；未發生MODS者29例；死亡13例；存活34例；正常對照組24例為接受體檢的健康人。所有創傷患者均按損傷的解剖部位計算ISS值，計算24小時APACHEII分值，于傷后24小時左右收集外周血清，-8(TC凍存待測。巨噬細胞株RAW264.7細胞(購自中國科學院上海細胞所)在37'C、5%C02的條件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培養基(GIBCO-服L)中貼壁生長。用Lipofectamine2000(購自Invitrogen公司)介導NF-kB-LUC質粒(本所徐祥博士惠贈)轉染RAW264.7細胞，每次轉染設3組平行對照，設立對照組和v'i'必^FI加恥i葛4厶；士5117fwarwFM"yt;;站九站九Q/ike/V幼l左'、中g4相夂了l中加入相應的創傷病人血清(10%)，在對照組各孔中加入相應的正常人血清(10%)。血清刺激6h后裂解細胞，離心收集細胞裂解液上清。應用Dual-LuciferaseAssaySystem檢測試劑(購自Promega公司)，化學發光檢測儀檢測熒光素酶活性。為減小批間測定的差異，以正常血清組的熒光素酶活性為100%。計算各組熒光素酶的相對活性。結果表明，與正常血清組相比，創傷血清組對NF-KB的刺激活性明顯增強;且在M0DS組、死亡組該變化分別較非MODS組、存活組更為明顯(見表l)。創傷血清對NF-kB的刺激活性與各指標的相關性分析細胞因子ELISA檢測試劑盒(購自服D公司)測定各組血清細胞因子及內源性拮抗劑水平。結果表明，創傷血清中IL-1(3、IL-lRa、IL-lRa/IL-l(3、TNFa、sTNFRI、IL-10水平均明顯升高；MODS組血清中IL-1(3、IL-lRa、IL-10水平較非MODS組增加更為明顯；死亡組血清中IL-1Ra、IL-lRa/IL-1(3、sTNFRI、sTNFRI/TNFa水平較存活組降低更為明顯，但TNFci水平較存活組升高更為明顯(見表l)。創傷血清對NF-kB的刺激活性與傷后24小時的APACHEII評分呈明顯的正相關關系，但與ISS積分及血清中各細胞因子水平無明顯的相關性(見表2)。表1各組指標的變化(3^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>預測創傷后MODS發生及死亡結局的ROC曲線分析運用SPSS12.0軟件繪制ROC曲線。結果表明，圖1表示在預測創傷后MODS的發生方面，創傷血清對NF-kB的刺激活性的ROC曲線下面積為0.904，，明顯大于創傷后24小時的APACHEII評分ROC曲線下面積(0.835)，其它各指標的ROC曲線下面積均小于0.750,明顯低于上述二者的ROC曲線下面積；圖2表示在預測創傷后死亡結局方面，創傷血清對NF-kB的刺激活性的ROC曲線下面積為0.930，，明顯大于創傷后24小時的APACHEII評分ROC曲線下面積(0.796);計算約登指數(敏感度+特異度一l)最大時各指標的臨界值，可確定創傷血清對NF-kB的刺激活性預測MODS的臨界值為2652.5%(敏感性100%，特異性72%)，預測創傷后死亡的臨界值為2675%(敏感性100%，特異性71%)。本發明通過標準的巨噬細胞系RAW264.7細胞作為炎性細胞的代表，采用熒光素酶報告基因實驗檢測創傷患者外周血清在體外對RAW264.7細胞中NF-icB活性的影響，建立了一種簡便易行的測定創傷機體炎癥反應狀態的方法。發現嚴重多發傷患者傷后24小時的外周血清，對巨噬細胞NF-icB的激活作用提高了26倍之多，且創傷后M0DS組、死亡組值分別顯著高于無MODS組及存活組。該變化與血清中IL-1、TNFa、IL-10、sTNFR、IL-lRa水平均無明顯相關性。研究結果表明，創傷血清對巨噬細胞NF-kB的激活作用與創傷患者的ISS評分無明顯的相關性，而與APACHEII評分呈明顯的正相關，表明創傷血清對巨噬細胞NF-kB的激活作用的強度變化更多地體現出機體對創傷的反應性差異。進一步分析發現，無論是在預測創傷后MODS的發生，還是預測死亡結局，NF-kB活性的受試者工作曲線(ROC)下面積均顯著大于APACHEII評分的ROC曲線下面積，表明早期測定嚴重多發傷患者外周血清對巨噬細胞核因子-kB的激活作用對MODS及死亡結局的判定比APACHEII評分更加優越。盡管創傷血清中IL-1、TNFa、IL-IO、sTNFR、IL-lRa水平以及IL-1Ra/IL-1、sTNFR/TNFa比值發生不同程度的變化，但由于組間各指標數值區間存在較多的重疊，其ROC曲線下面積均低于0.750，故限制了其在預后判定中的價值。本發明對于早期預測嚴重創傷后MODS的發生及死亡結局，并進而指導臨床給予及時的早期干預治療，挽救患者的生命具有重要意義。圖1為預測創傷后MODS發生的ROC曲線分析圖2為預測創傷后死亡的ROC曲線分析具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1、創傷血清對NF-kB的刺激活性測定既往無心肺疾患、糖尿病、自身免疫性疾病史，ISS評分〉=16的多發傷患者47例。傷后7天21天并發多器官障礙綜合征(MODS)者18例；未發生MODS者29例；死亡13例；存活34例；正常對照組24例為接受體檢的健康人。所有創傷患者均按損傷的解剖部位計算ISS值，計算24小時APACHEII分值，于傷后24小時左右收集外周血清，-8(TC凍存待測。巨噬細胞株RAW264.7細胞(購自中國科學院上海細胞所)在37'C、5%C02的條件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培養基(G扁-BRL)中貼壁生長。用Lipofectamine2000(購自Invitrogen公司)介導NF-kB-LUC質粒(本所徐祥博士惠贈)轉染RAW264.7細胞，每次轉染設3組平行對照，設立對照組和實驗組。細胞融合達到70%90%時進行轉染。轉染24h后，分別在實驗組各孔中加入相應的創傷病人血清(10%)，在對照組各孔中加入相應的正常人血清(10%)。血清刺激6h后裂解細胞，離心收集細胞裂解液上清。應用Dual-LuciferaseAssaySystem檢測試劑(購自Promega公司)，化學發光檢測儀檢測熒光素酶活性。為減小批間測定的差異，以正常血清組的熒光素酶活性為100%。計算各組熒光素酶的相對活性。結果表明，與正常血清組相比，創傷血清組對NF-KB的刺激活性明顯增強;且在M0DS組、死亡組該變化分別較非M0DS組、存活組更為明顯(見表l)。實施例2、創傷血清對NF-kB的刺激活性與各指標的相關性分析細胞因子ELISA檢測試劑盒(購自R&D公司)測定各組血清細胞因子及內源性拮抗劑水平。結果表明，創傷血清中IL-lp、IL-lRa、IL-IRa/IL-lp、TNFa、sTNFRI、IL-IO水平均明顯升高；MODS組血清中IL-lp、IL-lRa、IL-10水平較非MODS組增加更為明顯；死亡組血清中IL-lRa、IL-IRa/IL-1(3、sTNFRI、sTNFRI/TNFa水平較存活組降低更為明顯，但TNFa水平較存活組升高更為明顯(見表l)。創傷血清對NF-icB的刺激活性與傷后24小時的APACHEII評分呈明顯的正相關關系，但與ISS積分及血清中各細胞因子水平無明顯的相關性(見表2)。實施例3、預測創傷后MODS發生及死亡結局的ROC曲線分析運用SPSS12.0軟件繪制ROC曲線。結果表明，圖1表示在預測創傷后M0DS的發生方面，創傷血清對NF-kB的刺激活性的ROC曲線下面積為0.904，，明顯大于創傷后24小時的APACHEII評分ROC曲線下面積(0.835)，其它各指標的ROC曲線下面積均小于0.750，明顯低于上述二者的ROC曲線下面積；圖2表示在預測創傷后死亡結局方面，創傷血清對NF-kB的刺激活性的ROC曲線下面積為0.930,，明顯大于創傷后24小時的APACHEII評分ROC曲線下面積(0.796);計算約登指數(敏感度+特異度一1)最大時各指標的臨界值，可確定創傷血清對NF-KB的刺激活性預測MODS的臨界值為2652.5%(敏感性100%,特異性72%)，預測創傷后死亡的臨界值為2675%(敏感性100%，特異性71%)。實施例4，試劑盒，含有pNF-zcB-LUC質粒，Lipofectamine2000轉染試劑，細胞培養裂解試劑，熒光素酶分析試劑。實施例5用試劑盒中的試劑進行檢測，檢測方法包括以下步驟1、細胞培養將炎性細胞接種于96孔細胞培養板，調整細胞數為0.7X107孔，分為炎性細胞組、炎性細胞+pNF-kB-LUC(O.48"g)組、炎性細胞+pNF-kB-LUC(0.48yg)+正常血清(10%)組、炎性細胞+pNF-kB-LUC(0.48ug)+創傷血清(10%)組。2、質粒轉染將0.48ugpNF-kB-LUC質粒加入50u1無血清無抗生素的1640培養基中，混勻；將1.1Lipofectamine2000轉染試劑加入50n1無血清無抗生素的1640培養基中，在室溫下混勻，放置5min;將二者在室溫下混勻，放置20min;加入到上述相應細胞培養孔中，培養24h。3、加入血清離心培養板，將各孔中的液體吸出，用D-Hanks液洗細胞1次，于上述相應細胞培養孔加入正常/創傷血清20P1，并補加RPMI-1640完全培養基至200ul/孔，使血清終濃度為10%，培養細胞6h。4、裂解細胞離心培養板，將各孔中的液體吸出，用PBS洗細胞1次，于上述各孔加入細胞培養裂解試劑100u1,作用10min;吸出液體至0.5mlEp管中，冰浴、旋渦振蕩lmin，室溫12000r.p.m離心2min;小心吸取上清，直接檢測或放入一70"C冰箱保存。5、熒光素酶活性檢測放好檢測板，每孔加入100ul上清，再加入100ul熒光素酶分析試劑，于免疫發光檢測儀上立刻讀數，打印或記錄數據。權利要求1.一種試劑盒，含有pNF-κB-LUC質粒，Lipofectamine2000轉染試劑，細胞培養裂解試劑，熒光素酶分析試劑。2.權利要求1的試劑盒在檢測創傷血清對炎性細胞NF-icB的激活度數值中的應用。3.根據權利要求2的應用，其中所述的炎性細胞，是指單核/巨噬細胞、多型核白細胞、淋巴細胞、內皮細胞等細胞株或上述各類細胞的原代細胞。4.根據權利要求2的應用，其中所述的炎性細胞是離體培養的炎性細胞。5.根據權利要求2的應用，其中的激活度數值能夠判定早期嚴重創傷患者炎癥反應狀態。6.根據權利要求5的應用，其特征在于，所述分析，是將正常血清組與創傷血清組對NF-kB的激活度數值進行比較。7.根據權利要求5的應用，其特征在于，所述比較，是將正常血清組與創傷血清組對NF-kB的激活度數值進行比較，與正常血清組相比，創傷血清組對NF-kB的激活度數值明顯增大，與正常血清組相比，MODS組、死亡組中所述增大分別較非MODS組、存活組更為明顯。8.權利要求5的應用，是用在創傷患者器官功能炎性損害及死亡結局的判定中。9.權利要求8的應用，其中所述創傷患者器官功能炎性損害是指創傷患者腦、心、肺、肝、腎、胃腸功能的繼發性炎性損害。10.—種創傷血清對炎性細胞NF-icB的激活度數值的檢測方法，其特征在于，用權利要求l的試劑盒中的試劑進行檢測，檢測方法包括以下步驟1)、細胞培養將炎性細胞接種于96孔細胞培養板，調整細胞數為0.7X105/孔，分為炎性細胞組、炎性細胞+0.48ygpNF-kB-LUC組、炎性細胞+0.48ugpNF-kB-LUC+10%正常血清組、炎性細胞+0.48ugpNF-kB-LUC+10。/。創傷血清組；2)、質粒轉染將0.48PgpNF-kB-LUC質粒加入50u1無血清無抗生素的1640培養基中，混勻;將1.2u1Lipofectamine2000轉染試劑加入50u1無血清無抗生素的1640培養基中，在室溫下混勻，放置5min;將二者在室溫下混勻，放置20min;加入到上述相應細胞培養孔中，培養24h;3)、加入血清離心培養板，將各孔中的液體吸出，用D-Hanks液洗細胞l次，于上述相應細胞培養孔加入正常/創傷血清20y1，并補加RPMI-1640完全培養基至200ul/孔，使血清終濃度為10%，培養細胞6h;4)、裂解細胞離心培養板，將各孔中的液體吸出，用PBS洗細胞1次，于上述各孔加入細胞培養裂解試劑100"1，作用10min;吸出液體至0.5mlEp管中，冰浴、旋渦振蕩lmin，室溫12000r.p.m離心2min;小心吸取上清，直接檢測或放入一70"C冰箱保存；5)、熒光素酶活性檢測放好檢測板，每孔加入100ul上清，再加入100"1熒光素酶分析試劑，于免疫發光檢測儀上立刻讀數，打印或記錄數據。全文摘要本發明涉及一種創傷血清對炎性細胞NF-κB的激活作用檢測及其用途，用于早期判定嚴重創傷患者炎癥反應狀態。文檔編號C12Q1/02GK101261229SQ200810088999公開日2008年9月10日申請日期2008年4月11日優先權日2008年4月11日發明者梁華平,涂永久,健黃申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院