專利名稱：用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種介電行為的分析儀器，更特別地說，是指一種對生物粒子的分離進行的介電泳實驗用檢測系統，該檢測系統可以實現在低電壓(0.05~23.8V)交流 電場中的兩種不同生物粒子分離，以及對單一生物粒子的定量研究，并實現實時記錄。
技術背景人類邁入二十一世紀，電磁與生物和信息技術的交叉融合已成為當今國際上科學 研究的一個發展趨勢。而基于懸浮液中非均勻交變電場對生物^t粒作用的電磁操作生 物芯片技術的發展是其中的一個熱點問題。生物芯片技術是近年來興起的一項綜合性 的高新技術，它以微機電系統技術和生物技術為依托，將生命科學研究中的許多不連 續過程(如樣品制備、生化反應、檢測等步驟)集成并移植到一塊普通郵票大小的芯 片上去，使這些分散的過程連續化、微型化，以實現對大量生物信息進行快速、并行 處理的要求。其中，介電泳芯片技術已經開始廣泛應用于生物、化學、醫學、環境甚 至納米技術。介電泳(Electrophoresis)是中性粒子分離與分析的新技術。細胞介電電泳分 離技術具有許多優點第一、不需要添加抗體，因此，細胞不會在分離過程中因抗體 反應而發生生物性質改變。第二、所用交變電場對細胞的作用是"非破壞性"的。初 步研究證明，細胞經過這類電場作用后，其生長及分裂性質不會改變。第三、這類技 術的使用靈活、電場強度、頻率、相位都容易調控，便于自動化。第四、可以重復使 用。第五、該技術還可與其它方法結合使用，以達到最佳的細胞分離檢測效果。因此 介電電泳分離技術完全可以用來替代傳統的分離技術。研究根據介電泳原理制造的微型芯片，它的作用是使細胞在高頻非均勻電場作用 下產生極化，并由此極化作用產生誘導偶極矩，此誘導偶極矩在非均勻電場中，會與 電場互相作用而形成介電泳，使得細胞朝向電場強度較強或較弱的區域移動。細胞移動的方向與細胞本身、周圍流體及所施加的電場強度有關，當細胞受到偏極化的程度 大于周圍流體時，細胞會往電場強度較大的地方移動，形成正介電泳。反之，當細胞 受到偏極化的程度小于周圍流體時，則細胞遠離電極或往電場強度較小的區域移動， 形成負的介電泳。 一般介電泳芯片是利用正介電泳與負介電泳的特性，將細胞移動至 特定的區域。同時也可以通過測量細胞的運動速度和方向，研究細胞在介電場中的介電響應和頻率依賴等性質，可以得到細胞膜的性質及介電特性；以及對細胞進行無損 傷的選擇性操縱、定位。 發明內容本發明人通過對不同生物粒子進行介電響應的測試，在研究不同細胞介電響應規 律的基礎上，根據不同細胞的性質差異，通過調節電壓及頻率研究不同細胞發生正負 介電泳的頻率范圍，從而實現同一裝置，同一條件下不同細胞的分離。本發明的目的是提出一種用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，該 檢測系統由計算機、顯微鏡、介電泳陣列微電極芯片、信號發生儀、圖像釆集器組成， 介電泳陣列電極芯片放置在顯微鏡的載物臺上；圖像釆集器(數碼攝像頭)安裝在顯 微鏡的目鏡上；信號發生儀的電壓輸出端與介電泳陣列電極芯片上的電極陣列連接； 計算機與圖像采集器的信息輸出端(通過USB接口)連接；在本發明中，所述計算 機內存儲有MVC3000圖像處理軟件和DN-2圖像處理軟件，該MVC3000圖像處 理軟件用于對接收的電場一生物粒子關聯信息的動態視頻進行圖像提取，DN-2圖像 處理軟件對提取圖像進行粒子測量從而獲取介電泳陣列電極芯片中的生物粒子在介 電場中的生物粒子介電響應規律。本發明的介電泳陣列微電極芯片是由基片1、多個微電極和邊框5構成；多個微 電極分成兩行多列間隔分布在基片1上，設在上行的多個微電極組成上電極陣列2， 設在下行的多個微電極組成下電極陣列3;每個微電極上設有導電端和測試端，測試 端為梯形結構；所述上電極陣列2、下電極陣列3采用真空蒸發工藝將金屬材料沉積 在基片1上形成，且上電極陣列2的測試端與下電極陣列3的測試端相對；邊框5 是采用聚丙烯酸甲酯作為材料，用無影膠與基片1、上電極陣列2的導電端、下電極 陣列3的導電端粘合，利用紫外燈固化形成；在基片1上設置邊框5從而形成測試 槽4。在本發明中，首先采用真空蒸發工藝將金屬材料沉積在基片1上形成A微電極21、 B電極陣列22、 C微電極23、 D電極陣列24、 M微電極25、 N微電極26， C微電極23、 D電極陣列24、 N微電極26間隔/Z-2 4mm平行布置在基片l上 形成上電極陣列2; A微電極21、 B電極陣列22、 M微電極25間隔//=2 4附附 平行布置在基片1上形成下電極陣列3。上電極陣列2的測試端與下電極陣列3的 測試端相對間距及=40 80//附布置，即A微電極21的測試端與C微電極23的測 試端相對間距^=40~80//附布置。A微電極21、 B電極陣列22、 C微電極23、 D電極陣列24、 M微電極25和N微電極26的厚度為IOOA (即5-100A)。 A 微電極21上設有導電端202和測試端201，測試端201由多個梯形結構的電極頭 形成，且相鄰電極頭之間的中心距￡>=60 120//附，即A電極頭203與B電極頭 204之間的中心距"=60 120//w , B電極頭204與C電極頭205之間的中心距 D=60 120//m。邊框5的寬度F-2 4wm,厚度(7=1 3/^ 。布置在基片上的微電極，其每個微電極的電極頭可以按照梯度變化進行設計，即A微電極21 (C 微電極23)中的相鄰兩個電極頭的中心距離可以為B微電極22 (D微電 極24)中的相鄰兩個電極頭的中心距離可以為80//m ， M微電極25 (N微電極26) 中的相鄰兩個電極頭的中心距離可以為120//m。不同電極頭的寬度設計有利于生物 粒子在加載電壓的條件下的移動。本發明細胞介電響應和分離條件的檢測系統的優點在于(1)采用的相鄰微電 極之間不連接，即為隔斷式分布，此種微電極的布局可控制不同隔斷的外加電壓，從 而避免了使用同一電壓造成的微電極被擊穿。(2)分析生物粒子的大小采用了顯微 鏡與圖像釆集器同時工作模式，使獲得的生物粒子遷移過程中的圖像、動態過程數據 可以進行量化處理。克服了現有只能獲得圖像不能進行數據再次分析的缺陷。(3) 微電極的測試端為梯形結構，有利于生物粒子在介電泳過程中介電響應規律的研究， 以及對不同生物粒子在同一條件下、同一芯片上進行分離。(4)微電極為復合金屬 層(鎳一銀一鎳一金)，鎳元素可以有效地增加電極與基片的牢固性，表面的金金屬 層具有很好的生物相容性。
圖1是本發明細胞介電響應和分離條件的檢測系統的結構框圖。圖2是本發明介電泳陣列電極芯片的俯視圖。圖2A是圖2的A-A視圖。圖2B是單個微電極的三維結構圖。圖中 l.基片 2.上電極陣列3.下電極陣列 4.測試槽5.邊框 21.A微電極 22.B微電極 23.C微電極 24.D微電極25.M微電極 26.N微電極 201.測試端 202.導電端 203.A電極頭 204.B電極頭 205.C電極頭具體實施方式
下面將結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細說明。參見圖1所示，本發明是一種用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系 統，該檢測系統由計算機、顯微鏡、介電泳陣列微電極芯片、信號發生儀、圖像釆集 器組成，介電泳陣列電極芯片放置在顯微鏡的載物臺上；圖像采集器(數碼攝像頭) 安裝在顯微鏡的目鏡上;信號發生儀的電壓輸出端與介電泳陣列電極芯片上的電極陣 列連接；計算機與圖像采集器的信息輸出端(通過USB接口)連接；在本發明中， 所述計算機內存儲有MVC3000圖像處理軟件和DN-2圖像處理軟件,該MVC3000 圖像處理軟件用于對接收的電場一生辨粒子關聯信息的動態視頻進行圖像提取， DN-2圖像處理軟件對提取圖像進行粒子測量從而獲取介電泳陣列電極芯片中的生 物粒子在介電場中的生物粒子介電響應規律。在本發明中，計箅機、顯微鏡、信號發生儀所需電源為220V、 50Hz交流電。在本發明中，顯微鏡(寧波7^C新光學股份有限公司生產的CN—15型顯微鏡) 用于觀察介電泳陣列電極芯片中電場對生物粒子的作用、以及生物粒子對所產生介電 場的響應和遷移過程，簡稱"電場一生物粒子關聯信息"。在本發明中，圖像釆集器(寧波永新光學股份有限公司生產的HDCE —30型數 碼攝像頭)用于將顯微鏡觀察到的"電場一生物粒子關聯信息"實時記錄下，并將記 錄下的視頻信息輸出給計算機。在本發明中，信號發生儀(江蘇洪澤瑞特電子設備有限公司生產的SG1648型 信號發生儀)用于產生一個可調節的恒定正弦波交流電壓^、并將所述恒定正弦波交流電壓^加載在介電泳陣列電極芯片中的一個或多個電極陣列上。信號發生儀的 輸出頻率為0.02Hz 2MHz,阻抗5012。在本發明中，計算機的最低配置為PIII600, 512M內存，IOG硬盤，在 Windows 2000/XP環境下操作。計算機(A)首先對接收的"電場一生物粒子關聯 信息"的動態視頻進行保存處理(使得介電泳陣列電極芯片中的生物粒子在介電場中 的運動情況得到實時記錄)；(B)然后利用存儲的"MVC3000圖像處理軟件"對接 收的"電場一生物粒子關聯信息"進行圖像提取獲得某一介電時間、下的特征圖像照 片；(C)依據"DN-2圖像處理軟件"對特征圖像照片按照比例尺換算關系(照片上 標出的尺寸，以及顯^^鏡的物鏡放大的倍數進行換算)測量得到生物粒子的遷移距離從而間接得到生物粒子的移動平均速度F (7 = ^"-^); (D)利用生物粒子的 移動平均速度F 、加載正弦波交流電壓^大小來評價生物粒子在介電泳陣列電極芯 片中測試槽4的介電響應速度&。所述介電響應速度&是作為選擇合適的分離條件 的依據。本發明的檢測系統的特點是結合正弦波交流電壓^、介質電導率、生物粒子的 移動平均速度7在不同測試條件下的變化，獲得生物粒子介電響應的相關規律。在本發明中，介電泳陣列微電極芯片提供了一個隨生物粒子遷移期間改變的電 場，利用該電場的非均質性及兩種或兩種以上生物粒子介電常數的差異，通過使生物 粒子產生負介電泳、或正介電泳，達到將兩種或兩種以上生物粒子分離的目的。本發明利用介電泳陣列微電極芯片可產生使生物粒子發生正的或負的介電泳的 非均勻電場，并利用介電性質不同的生物粒子對非均勻電場響應存在差異這一特性， 將粒子穩定在電極陣列的不同區域，由此實現兩種或兩種以上生物粒子的分離，及對 生物粒子介電響應和遷移條件的研究。參見圖2、圖2A、圖2B所示，介電泳陣列微電極芯片是由基片1、多個微電 極和邊框5構成；多個微電極分成兩行多列間隔分布在基片l上，設在上行的多個 微電極組成上電極陣列2，設在下行的多個微電極組成下電極陣列3;每個微電極上 設有導電端和測試端，測試端為梯形結構；所述上電極陣列2、下電極陣列3采用真 空蒸發工藝將金屬材料沉積在基片1上形成，且上電極陣列2的測試端與下電極陣 列3的測試端相對；邊框5是釆用聚丙烯酸甲酯作為材料，用無影膠與基片1、上電 極陣列2的導電端、下電極陣列3的導電端粘合，利用紫外燈固化形成；在基片1 上設置邊框5從而形成測試槽4。在本發明中，首先采用真空蒸發工藝將金屬材料沉積在基片1上形成A微電極21、 B電極陣列22、 C微電極23、 D電極陣列24、 M微電極25、 N微電極26， C微電極23、 D電極陣列24、 N微電極26間隔i/ = 2 4附m平行布置在基片l上形成上電極陣列2; A微電極21、 B電極陣列22、 M 微電極25間隔/Z-2 4m/n平行布置在基片1上形成下電極陣列3。上電極陣列2 的測試端與下電極陣列3的測試端相對間距i =40~80^附布置，即A微電極21 的測試端與C微電極23的測試端相對間距及=40 80/// 布置。A微電極21、 B 電極陣列22、 C微電極23、 D電極陣列24、 M微電極25和N微電極26的厚度 為IOOA (即E-100A)。 A微電極21上設有導電端202和測試端201，測試端 201由多個梯形結構的電極頭形成，且相鄰電極頭之間的中心距D-60 120;/m, 即A電極頭203與B電極頭204之間的中心距D =60 120//m ， B電極頭204 與C電極頭205之間的中心距￡>=60~120//附。邊框5的寬度F =2~4m/n ,厚 度G =l 3/ m。布置在基片上的微電極，其每個微電極的電極頭可以按照梯度變化 進行設計，即A微電極21 (C微電極23)中的相鄰兩個電極頭的中心距離可以為 60/im ， B微電極22 (D微電極24)中的相鄰兩個電極頭的中心距離可以為80pw ， M微電極25 (N微電極26)中的相鄰兩個電極頭的中心距離可以為120//m。不同 電極頭的寬度設計有利于生物粒子在加載電壓的條件下的移動。 基片1為玻璃材質。在本發明中，真空蒸發工藝為電子束蒸發制微電極，其工藝步驟如下(A) 釆用濃度30%的乙醇對基片l進行清洗3次，自然晾干后待用；(B) 將經(A)步驟處理后的基片1經過勻膠、前烘、曝光、顯影的光刻處理 后得到第一預加工基片；(C) 將經(C)步驟獲得的第一預加工基片放入電子束蒸發室的載物臺上，先 后沉積鎳一銀一鎳一金元素得到第二預加工基片；沉積完成后鎳一銀一鎳一金元素形成復合金屬層，該復合金屬層即為微電極； 沉積工藝真空度5X10-"Va,沉積速率2A/s電子束功率600W預加工基片預熱溫度83"(D)將經(C)步驟處理得到的第二預加工基片上用聚丙烯酸甲酯涂出一個矩 形框后，用無影膠將所述的矩形框與基片1、微電極的導電端粘合，則在基片l上形 成邊框5，即介電泳陣列微電極芯片制作完成。 實施 例(一)配置用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統所需器件的選取 信號發生儀SG1648，江蘇洪澤瑞特電子設備有限公司 顯微鏡CN-15，光器(KONKYO)，寧波永新光學股份有限公司 數碼攝像頭HDCE-30,寧波永新光學股份有限公司 圖像分析軟件MVC3000 (觀察、拍照、攝像)，其特點觀察范圍大 DN-2(測量粒子大小) (二)檢測方式(1) 配制測試液測試液由超純水、葡萄糖、NaCl、酵母菌和雞血紅細胞組成，lOOml超純水 中加入5.5g的葡萄糖、8.5//g的NaCl、 lw/的酵母菌和lm/的雞血紅細胞。測試 液的電導率為500/^/cm。(2) 將測試液注入測試槽4中，靜置2分鐘后，加載正弦交流電(電壓0.05 23.8V,頻率2Hz 2MHz);用顯微鏡觀察，配合圖像采集器采集照片(MVC3000)， 通過計算機實時觀察測試槽4中的遷移狀況，并對遷移過程進行實時錄像，且存儲 相關數據。所述正弦交流電由SG1651函數信號發生器提供。在本實施例中，通過改變信 號發生器輸出電壓、頻率，在一定時間內可以統計出微電極吸附的細胞個數，從而找出影響細胞介電泳的規律。(3) 對計箅機獲得的相關數據采用DN — 2圖像處理軟件進行分析，從而分別 獲得酵母菌和雞血紅細胞的粒子大小，以及遷移時間、遷移距離、遷移方向。對于本實例中的數據采集、記錄、保存、分析都由計算機完成，這屬于現有計 算機的基本處理能力，故在本發明中不作詳細數據說明。本發明人通過對不同生物粒子進行介電響應的測試，在研究不同細胞介電響應 規律的基礎上，根據不同細胞的性質差異，通過調節電壓及頻率研究不同細胞發生正 負介電泳的頻率范圍，從而實現同一裝置，同一條件下不同細胞的分離。
權利要求
1. 一種用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，該檢測系統包括有計算機、顯微鏡、信號發生儀、圖像采集器，其特征在于還包括有介電泳陣列微電極芯片，介電泳陣列電極芯片放置在顯微鏡的載物臺上；圖像采集器安裝在顯微鏡的目鏡上；信號發生儀的電壓輸出端與介電泳陣列電極芯片上的電極陣列連接；計算機與圖像采集器的信息輸出端連接；所述計算機內存儲有MVC3000圖像處理軟件和DN-2圖像處理軟件，該MVC3000圖像處理軟件用于對接收的電場-生物粒子關聯信息的動態視頻進行圖像提取，DN-2圖像處理軟件對提取圖像進行粒子測量從而獲取介電泳陣列電極芯片中的生物粒子在介電場中的生物粒子介電響應規律；所述顯微鏡用于觀察介電泳陣列電極芯片中電場對生物粒子的作用、以及生物粒子對所產生介電場的響應和遷移過程，簡稱“電場-生物粒子關聯信息”；所述圖像采集器用于將顯微鏡觀察到的“電場-生物粒子關聯信息”實時記錄下，并將記錄下的視頻信息輸出給計算機；所述信號發生儀用于產生一個可調節的恒定正弦波交流電壓VN、并將所述恒定正弦波交流電壓VN加載在介電泳陣列電極芯片中的一個或多個電極陣列上；所述介電泳陣列微電極芯片是由基片(1)、多個微電極和邊框(5)構成；多個微電極分成兩行多列間隔分布在基片(1)上，設在上行的多個微電極組成上電極陣列(2)，設在下行的多個微電極組成下電極陣列(3)；每個微電極上設有導電端和測試端，測試端為梯形結構；所述上電極陣列(2)、下電極陣列(3)采用真空蒸發工藝將金屬材料沉積在基片(1)上形成，且上電極陣列(2)的測試端與下電極陣列(3)的測試端相對；邊框(5)是采用聚丙烯酸甲酯作為材料，用無影膠與基片(1)、上電極陣列(2)的導電端、下電極陣列(3)的導電端粘合，利用紫外燈固化形成；在基片1上設置邊框5從而形成測試槽4。
2、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特 征在于所述上電極陣列(2)、下電極陣列(3)中相鄰兩個微電極間隔//=2 4m附，上電極陣列(2)的測試端與下電極陣列(3)的測試端相對間距7 =40 80//m布置，微電極的厚度為IOOA;微電極上設有導電端和測試端，測試端由 多個梯形結構的電極頭形成，且相鄰電極頭之間的中心距D =60 120//m。
3、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特征在于所述邊框(5)的寬度,=2 4/ 附，厚度G-l 3/n附。
4、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特 征在于信號發生儀的輸出頻率為0.02Hz 2MHz，阻抗50Q。
5、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特 征在于計算機(A)首先對接收的"電場一生物粒子關聯信息"的動態視頻進 行保存處理；(B)然后利用存儲的"MVC3000圖像處理軟件"對接收的"電場 —生物粒子關聯信息"進行圖像提取獲得某一介電時間、下的特征圖像照片；(C) 依據"DN-2圖像處理軟件"對特征圖像照片按照比例尺換算關系測量得到生物 粒子的遷移距離d，從而間接得到生物粒子的移動平均速度7 = "http://-~; (D)利 用生物粒子的移動平均速度V 、加載正弦波交流電壓^大小來評價生物粒子在介 電泳陣列電極芯片中測試槽(4)的介電響應速度&。
6、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特 征在于布置在基片上的微電極，其每個微電極的電極頭可以按照梯度變化進行 設計。
7、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特 征在于基片(1)為玻璃材質。
8、 根據權利要求1所述的用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，其特 征在于所述介電泳陣列微電極芯片采用電子束蒸發制微電極，其工藝步驟如下:(A) 釆用濃度30%的乙醇對基片l進行清洗3次，自然晾干后待用；(B) 將經(A)步驟處理后的基片1經過勻膠、前烘、曝光、顯影的光刻處理 后得到第一預加工基片；(C) 將經(C)步驟獲得的第一預加工基片放入電子束蒸發室的載物臺上，先 后沉積鎳一銀一鎳一金元素得到第二預加工基片；沉積完成后鎳一銀一鎳一金元素形成復合金屬層，該復合金屬層即為微電極；沉積工藝真空度5XlO-4戸， 沉積速率2A/s 電子束功率600W 預加工基片預熱溫度83°C(D) 將經(C)步驟處理得到的第二預加工基片上用聚丙烯酸甲酯涂出一個矩 形框后，用無影膠將所述的矩形框與基片1、微電極的導電端粘合，則在基片1上形 成邊框5，即介電泳陣列微電極芯片制作完成。
全文摘要
本發明公開了一種用于確定多種細胞介電響應和分離條件的檢測系統，該檢測系統由計算機、顯微鏡、介電泳陣列微電極芯片、信號發生儀、圖像采集器組成，介電泳陣列電極芯片放置在顯微鏡的載物臺上；圖像采集器安裝在顯微鏡的目鏡上；信號發生儀的電壓輸出端與介電泳陣列電極芯片上的電極陣列連接；計算機與圖像采集器的信息輸出端連接。本發明人采用該檢測系統通過對不同生物粒子進行介電響應的測試，在研究不同細胞介電響應規律的基礎上，根據不同細胞的性質差異，通過調節電壓及頻率研究不同細胞發生正負介電泳的頻率范圍，從而實現同一裝置，同一條件下不同細胞的分離。
文檔編號C12Q1/02GK101281163SQ200810105218
公開日2008年10月8日 申請日期2008年4月28日 優先權日2008年4月28日
發明者張鶴騰, 斌 王, 陳慧英, 萍 韓 申請人:中央民族大學