專利名稱：一種微流細胞培養陣列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微流控技術與細胞生物學領域，具體地，涉及一種適 于細胞或微生物微環境培養的微流控芯片裝置。
背景技術：
微流控芯片(Microfluidic chip)最初起源于分析化學領域，是一 種采用精細加工技術，在數平方厘米的基片，制作出微通道網絡結構 及其它功能單元，以實現集微量樣品制備、進樣、反應、分離及檢測 于一體的快速、高效、低耗的微型分析實驗裝置。微流控芯片技術用于細胞培養及其生化分析已引起較廣泛的關 注，如細胞搡作，綠色熒光蛋白的表達，基因轉染，細胞活性測試， 細胞分離，細胞內鈣離子的測量，激素分泌監測以及高通量的細胞含 量分析等。自從Harrison等人首次在微流控芯片上對細胞進行操縱及 傳輸試驗后，Yang等人用微流控芯片研究細胞群體的排列行為，并用 熒光檢測其攝取鈣離子的反應情況。釆用微流控芯片進行細胞培養能夠精確控制培養環境，便于生化 分析。前面的工作中報道了很多用化學的圖形以及物理的固定選擇性 將細胞連接在表面上的方法。這些方法雖然很有用，但是它們需要特 別的表面處理，同時需要復雜的微加工工藝或者操作，使得在微流體 系的細胞陣列不能廣泛地為生物學家所使用。而且這些方法，主要通 過流體在細胞周圍的流動來實現對細胞營養的供給，細胞會處于一定 的流速之下，這對部分非貼壁細胞的培養和觀測都會帶來不便。同時 它們也不能對細胞長時間的生長進行很好的觀測。總體來說，微流相關研究在國際上才剛剛起步， 一方面研究比較 初步，實驗不夠豐富；另一方面偏重實驗室階段的探索，離應用尚有 較大距離。發明內容本發明的目的在于針對上述不足提供一種微流細胞(微生物)培 養陣列，用于細胞的培養及分析。本發明的另一目的在于提供使用上述微流細胞(微生物)培養陣 列的細胞(微生物)培養方法。本發明微流細胞(微生物)培養陣列包括 一 個或多個微流細胞(微 生物)培養陣列單元，所述微流細胞(微生物)培養陣列單元包括主 溝道以及若干個與主溝道相連通的細胞培養單元，每個培養單元包含 一段擴散溝道與細胞培養室，細胞培養室通過擴散溝道與主溝道相連 通。當微流細胞(微生物)培養陣列由多個微流細胞(微生物)培養 陣列單元構成時，可用一總溝道分別與各個主溝道的一端相連通。上述細胞培養單元優選分布在主溝道的兩側。細胞培養室可以呈 多種形狀，優選為三角形，其一頂點通過擴散溝與主溝道連通。擴散 溝道截面積比細胞培養室截面積小，優選擴散溝道截面積小于細胞培養室截面積的20%，但允許細胞通過，細胞培養室的高度優選不超過 細胞線度的1.5倍。本領域技術人員應能理解，這里所述的截面積是 指擴散溝道的寬與高之積，細胞培養室的截面積亦是指其寬與高之積。 本領域技術人員也很容易理解，對于不同形狀的擴散溝道，這里的截 面積是指最小截面積，對于不同形狀的細胞培養室，這里的截面積是 指最大截面積。本發明微流細胞(微生物)培養陣列的材料優選釆用PDMS (聚 二甲基硅氧烷)以及玻片，其中玻片作為基片，PDMS作為蓋片。本發明進一步提供利用微流細胞(微生物)培養陣列的細胞(微 生物)培養實現方法(1) 將芯片置于真空環境去氣若干分鐘；(2) 將細胞懸液震蕩均勻后注射入主溝道，由于PDMS材料特殊的可吸收氣體以及透過氣體的特性，細胞溶液自動被吸收入細胞(微 生物)培養室，當細胞培養室被液體填充完成，細胞培養室內液體流 速降為零；(3)換液操作通過更替主溝道的液體實現去除主溝道的細胞溶液并實現對細胞培養室內細胞(微生物)的環境更替。本發明微流細胞(微生物)培養陣列利用擴散的方式實現培養室 營養液(試劑)的替換，在替換營養液(試劑)時營養液(試劑)在 主溝道中流過，營養物質物(試劑)通過擴散實現培養室的營養(化 學物質)的更替，而細胞(微生物)處于零流速的狀態。本發明能夠實現細胞培養室的單細胞分布，而布置時間只需一分 鐘左右。改變主溝道溶液，通過擴散可以十分方便的在一分鐘左右更 替培養室內的營養，而細胞仍能處于零流速的狀態。由于培養室厚度 的限制細胞為單層生長，使得顯微觀測十分的方便。本發明微流細胞培養陣列，將在細胞生物學，特別藥物篩選中發 揮巨大的作用。
圖1本發明微流控細胞(微生物)培養陣列示意圖之一； 圖2本發明微流控細胞(微生物)培養陣列示意圖之二； 圖3利用吸氣方法布置的酵母細胞微腔體陣列，其中a為酵母細 胞溶液被自動吸入細胞培養單元的顯微時序圖；b為細胞培養室被布 置上細胞的顯微圖像；c為進液的酵母細胞密度為3"(f細胞/ml時， 100個細胞培養單元被布置上的細胞數量分布；d為進液的酵母細胞密 度為10l田胞/ml時，IOO個細胞培養單元被布置上的細胞數量分布； 圖4酵母細胞在微腔體中單層生長，箭頭所指處為酵母細胞； 圖5并行的觀測酵母細胞在不同銅離子濃度下的表型。 圖中，l為主溝道，2為細胞培養室，3為擴散溝道，4為細胞培 養單元，5為總溝道。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的 限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或 條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟 知的常規手段。實施例1微流控細胞(微生物)培養陣列如圖l所示，主溝道l寬度為100微米，細胞培養室2為邊長125 微米的等邊三角，三角形頂點處通過一段20微米寬、20微米長的擴 散溝道3與主溝道1相連，主溝道l、培養室2、擴散溝道3的高度均 為6微米。細胞培養室2與擴散溝道3構成細胞培養單元4，若干個 重復排列的細胞培養單元4分列在主溝道1的兩側，構成了微流控細 胞(微生物)培養陣列的基本單元，由一個或多個上述微流控細胞(微 生物)培養陣列單元構成本發明微流控細胞(微生物)培養陣列。圖 2中所示的是有7個微流控細胞(微生物)培養陣列單元構成的微流 控細胞(微生物)培養陣列，在圖2中7個微流控細胞(微生物)培 養陣列單元同一端的主溝道與總溝道5相連，A為裝載細胞的入口， B 為替換溶液的入口，這樣可以在A端同時對七條主溝道的培養室布置 上同一種群的酵母細胞，從B端給七條道不同的培養環境以作平行對 照，對每一種培養環境有足夠數量的細胞以作統計。當然，從A端或 B裝載細胞或替換溶液并不受此限制。在本例中，微流控細胞(微生物)培養陣列的基片為玻片，蓋片 為PDMS。芯片的制作可釆用下述方法在干凈的硅片上按照設計的模板釆用軟光刻的方法(Y. N. Xia and G. M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,1998, 37， 5， 550-575丄uo， C. X" Fu, Q., Li， H., Xu, L. P. " a/"丄W 2005, 5,726—729.)制得高 度為6微米的模具，并用液態的PDMS(A: B=10: 1， A:聚二甲基硅氧烷單體，B:相應的交聯劑；購自GE公司，產品型號為RTV615 )倒 在模具上，PDMS的高度大約為5mm，在80度烘箱中30分鐘使得 PDMS固化。切下后在相應的入口和出口處鉆孔后，將PDMS與清潔 好的玻片粘和，從而形成芯片。實施例2單細胞培養觀察本例中使用實施例1的微流控細胞(微生物)培養陣列(圖1) 對酵母細胞進行單細胞培養觀測。 具體方法(1) 將酵母細胞培養于YPG培養液中，使用前震蕩均勻并稀釋 到合適的濃度，濃度大約為10 細胞/ml。(2) 取芯片放于真空環境IO分鐘左右，將菌從入口注入，推速 為20微升/小時。如圖3，酵母細胞會被自動吸入細胞培養單元(圖 3a)，當細胞培養單元被溶液占滿(圖3b)，可用培養液將主溝道的細 胞溶液沖走.，對酵母細胞進行培養，如圖4。研究表明，通過上述方法搡作，酵母細胞溶液被自動吸入細胞培 養室中(圖3a)，可以實現單細胞的分離，并且布置細胞的操作可在一 分鐘內完成；當當細胞室充滿培養液時，主溝道的流過的液體不會對 細胞培養室產生直接影響，細胞培養室中的細胞基本處于零流速狀態 (圖3b)。當進液的酵母細胞密度為3"(f細胞/ml時，約35%的細胞 培養室被布置上單個細胞(圖3c)。當進液的酵母細胞密度為107細胞 /ml時，約45%的細胞室被布置上單個細胞。實施例3環境變化對細胞表型的影響觀察本例中使用實施例1的微流控細胞(微生物)培養陣列(圖2) 對酵母細胞在不同培養環境的生長進行觀測以及統計。 具體方法(1)將包含銅離子誘導綠色熒光蛋白的酵母細胞培養于YPG培 養液中，使用前震蕩均勻并稀釋到合適的濃度，濃度大約為107細胞/ml。(2)取芯片放于真空環境10分鐘左右，將菌從A入口注入，推 速為40微升/小時，使得七條細胞培養道中的培養室都被填充滿菌液。(3 )從b入口 1到7通道分別通入含有不同銅離子濃度的培養液， 銅離子濃度分別為0; 0.2; 0.4; 0.6; 1; 1.5; 2mM。細胞培養溫度 控制在30攝氏度。實驗中觀測每條通道中含有單細胞的30個培養室， 每15分鐘利用X-Y自動平移平臺掃描一次芯片記錄并一次顯微圖， 總實驗時間為20小時，在20小時結東時，掃描一次芯片的熒光數據。 分析各個通道的酵母細胞的分裂周期以及熒光數據與對應銅離子濃度 的關系并繪制圖5。結果表明a、銅離子的加入影響了細胞的分裂，當銅離子濃度逐 漸增加時，細胞分裂周期顯著延長；b、銅離子濃度對綠色熒光蛋白的 誘導量呈正相關，但當銅離子濃度超過lmM時，其對綠色熒光蛋白的 誘導表達沒有顯著變化。
權利要求
1. 一種微流細胞培養陣列，其包括一個或多個微流細胞培養陣列單元，所述微流細胞培養陣列單元包括主溝道以及若干個與主溝道相連通的細胞培養單元，每個培養單元包含一擴散溝道和細胞培養室，細胞培養室通過擴散溝道與主溝道相連通。
2、 如權利要求l所述的微流細胞培養陣列，其由多個微流細胞培養陣列單元構成，且陣列一側具有分別與各個主溝道的一端相連通的總溝道。
3、 如權利要求l或2所述的微流細胞培養陣列，其特征在于，細 胞培養單元分布在主溝道的兩側。
4、 如權利要求1或2所述的微流細胞培養陣列，其特征在于，擴 散溝道截面積比細胞培養室截面積小。
5、 如權利要求4所述的微流細胞培養陣列，其特征在于，擴散溝 道截面積小于細胞培養室截面積的20%。
6、 如權利要求1或2所述的微流細胞培養陣列，其特征在于，細 胞培養室的高度不超過細胞線度的1.5倍。
7、 如權利要求1或2所述的微流細胞培養陣列，其特征在于，細 胞培養室呈三角形，其一頂點通過擴散溝與主溝道相連通。
8、 如權利要求1或2所述的微流細胞培養陣列，其特征在于，其 由基片和粘在其上的蓋片構成，所述基片為玻片，所述蓋片由PDMS 制成。
9、 權利要求1 8任一項所述微流細胞培養陣列在細胞培養和/或 分析中的應用，特別是在藥物篩選中的應用。
10、 一種利用權利要求1 8任一項所述的微流細胞培養陣列培養 細胞的方法(1 )將權利要求1~8任一項所述的微流細胞培養陣列置于真空環 境去氣若干分鐘；(2) 將細胞懸液震蕩均勻后注射入主溝道，使細胞懸液充滿微流 細胞培養陣列；(3) 在培養過程中，更替主溝道的液體。
全文摘要
本發明提供了一種微流細胞(微生物)培養陣列，其包括一個或多個微流細胞培養陣列單元，所述微流細胞培養陣列單元包括主溝道以及若干個與主溝道相連通的細胞培養單元，每個培養單元包含一擴散溝道和細胞培養室，細胞培養室通過擴散溝道與主溝道相連通。本發明微流細胞(微生物)陣列不僅能夠實現單細胞分離培養，而且在更換培養液或其它試劑的時候細胞始終處于零流速狀態，這為細胞的培養和觀測特別是非貼壁細胞的培養和觀測帶來了極大的便利，非常適用于基于細胞表型的高通量藥物篩選的研究工作。
文檔編號C12N1/14GK101275114SQ20081010460
公開日2008年10月1日 申請日期2008年4月22日 優先權日2008年4月22日
發明者歐陽頎, 羅春雄 申請人:北京大學