專利名稱：牛結核病Dot-ELISA快速檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種牛結核病的診斷用生物制品，屬獸用生物制品領域。 技術背景牛消耗性傳染病。該病一年四季均可發生，呈世界流行性，在流行嚴 重的地區，感染率可達60%。世界上包括美國、加拿大、澳大利亞等十多 個國家已經實現了無結核牛的報道，但近年來，結核病(bovinetuberculosis) 主要是由牛分枝桿菌(M;;co6acfen'ww 6ov&)引起的 一種牛慢性由于野生動 物以及人類結核病的發生與流行，使這些結核病控制良好國家的牛群也處 在不斷檢疫和高度警惕之中。牛結核不僅導致了養牛業自身生產力的下降， 更重要的是對人類健康構成了嚴重的威脅。人對牛結核比較敏感，很多病 例與感染動物有接觸史。由于牛和人類的關系(牛奶、牛肉及制品等)較其 他動物更為密切，因此約10%左右的人結核病是由牛分枝桿菌引起；有研 究表明，在有結核病奶牛的地區，人的結核感染率可以高達75%。要從根本上控制牛結核病的發生與流行，首先必須加強對本病的診斷 學的研究，事實上，國內外學者也從未間斷過對牛結核病診斷方法的不斷 改進。目前對牛結核病的檢測，主要有3種方法結核菌素皮內試驗 (tuberculin test, TST )，牛血清ELISA檢測法和牛IFN-y ELISA檢測法。 TST是經典的牛結核病診斷方法，并在世界范圍內廣泛使用，但該方法暴 露出諸多不足，主要表現在①高比例的假陽性和假陰性；②不能區分免 疫動物與感染動物；③對檢測可疑樣品的重復檢驗需要30天以上； 必須 在活體上進行2次試驗，操作繁瑣，不利于進行大規模流行病學調查。鑒 于TST存在的缺陷，非常需要一種高度特異性和敏感性的血清學診斷方法 來彌補它的不足，牛血清ELISA檢測法因其快速、簡便和低成本而備受青 睞。最初人們用PPD作為建立ELISA方法的診斷抗原，但同樣存在較強的非特異性；隨著牛分枝桿菌分子生物學研究的深入，包括ESAT6、MPB64、 MPB70、 CFP10等大量的分泌蛋白成分在體外獲得表達并用作診斷抗原， 建立了間接ELISA診斷方法，這種方法較PPD-ELISA特異性有所提高， 但敏感性卻降低了 。目前商品化的牛結核菌素IFN-y ELISA檢測試劑盒只 有澳大利亞Bovigam公司生產的單抗夾心ELISA 4企測試劑盒。該試劑盒不 僅價格昂貴，而且并不適合我國國情。由于牛結核和禽結核(副結核)之 間存在高度同源，因此用牛PPD (PPDB)刺激外周血細胞時，在被檢動物 感染禽結核(副結核)的情況下，同樣能產生較高水平的IFN卞為了避免 這一 問題，Bovigam公司試劑盒巧妙地用禽PPD (PPDA)作為對照，在結 果判定時，用PPDB與PPDA刺激待測樣品在ELISA讀數中的差值
(ODPPDB-ODPPDA〉0.1 )作為判定依據。這種方法對沒有禽結核(副結核) 或者禽結核(副結核)感染比較輕微的國家比較適用，但由于我國禽結核
(副結核)感染也相當嚴重，甚至在某種程度上比牛結核更為嚴重，使用 該試劑盒往往會導致很高比例的假陰性結果。
雖然已有體外表達CFP10和EAST6的研究報道，但目前尚未有人將 該表達產物用作包#1抗原吸附到NC膜上，通過Dot-ELISA的方法^r測牛 結核病。
本發明的目的是針對上述幾種檢測方法的不足，提供一種快速、高特 異性和高敏感性的牛結核病檢測試劑盒。
發明內容
本發明所涉及技術包括提取牛結核分支桿菌DNA作為PCR反應的 模板擴增出esxB和esxA基因片段，用基因拼接技術最終擴增出目的基因 (esxB-esxB基因)，將其克隆進質粒中，再轉入大腸埃希氏菌，將獲得的 含有陽性表達質粒的重組菌按常規方法誘導表達，將表達蛋白經純化、定 量處理后包被硝酸纖維素膜(NC膜)，用Dot-ELISA方法進行;險測。 1 牛結核分枝桿菌EAST6和CFP10共表達質粒的構建
按常規方法提取牛結核分支桿菌(CVCC68001 )菌株DNA作為PCR 反應的模板擴增出esxB和esxA基因片段，用基因拼接技術最終擴增出目
4的基因(esxB-esxB基因)、將其克隆進入pET-32a質粒中，再轉入大腸 埃希氏菌BL21(DE3)中，雙酶切、PCR鑒定及測序結果均證明所得為陽性 質粒，重組菌命名為大腸埃希氏菌(^sc力eWc力/a co//) pET-CFP 10-ESAT6林 菌(2008年5月7日本菌林已送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心保藏，編號為CGMCCNo.2843 )。2 CFP10-EAST6蛋白的純化和定量將表達誘導表達的菌體12000r/min離心10min，將沉淀以IO倍濃縮比 例重懸于PBS中，超聲波裂解菌體，取上清，經過NI-NTA柱(北京韋氏 博慧色譜科技有限公司)用咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白純化表達蛋 白，并根據Bradford法確定重組蛋白濃度。3 Dot-ELIS A反應程序的確定將NC膜浸泡于純化好的經一定比例稀釋的重組蛋白中10min成為檢 測抗原，將待4企血清稀釋10倍后以lpl上樣量點于膜上，37。C作用0.5h， TBST洗滌3次，加二抗孵育0.5h, TBST洗滌3次，顯色液顯色。 發明的具體實施方式
本發明所涉及蛋白為牛結核分支桿菌感染早期分泌蛋白，是介導細胞 免疫的主要優勢抗原。本發明所涉及技術包括提取牛結核分支桿菌 (CVCC68001 )菌抹DNA作為PCR反應的模板擴增出esxB和esxA基因 片段，用基因拼接技術最終擴增出目的基因(esxB-esxB基因)、將其克隆 進入pET-32a質粒中，并轉入大腸埃希氏菌BL21(DE3),獲得含有陽性表 達質粒pET-32a(+)-cfiDlO-esat6的重組菌大腸埃希氏菌pET-CFP10-ESAT6 (CGMCC No.2843)，再將重組菌CGMCC No.2843按常規方法誘導表達 (《分子克隆實驗指南》，第二版，J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，1996， P822-847)，獲得的表達蛋白經過純化、定量處理，用于包被NC膜，用 Dot-ELISA方法進4亍檢測。 1目的基因的擴增本發明采用基因4并4矣才支術(Gene splicing by over lap extension )，即重疊 PCR的方法通過兩次PCR實現目的基因的拼接。共設計4條引物，PI為esxB基因(編碼CFP10蛋白)上游引物；P2前半段(劃線部分)為連接序 列(Linker,編碼15個疏水氨基酸)，后半段為esxB基因下游引物；P3 前半段(劃線部分)是與引物P2劃線部分互補的堿基序列(Linker),后 半段為esxA基因(編碼ESAT-6蛋白)上游引物；P4為esxA基因下游引物。 首先用引物P1、 P2擴增出esxB基因，用引物P3、 P4擴增出esxA基 因，然后取2種基因產物等體積混合后作為模板，用引物P1和P4擴增出esxB畫esxA拼接基因。 具體操作方法如下1.1引物設計根據GenBank中的柳coZ^"en'w柳6oWs AF2122/97 (登錄號NC 002945)設計引物Pl: 5，-GCGAATTCATGGCAGAGATGAAG-3, P2:AGCAGCAG-3'P4: 5'-CCCTCGAGTTACTATGCGAACATCCCAGTG-3'Pl、 P4劃線部分分別為EcoRl 、 HindIII酶切位點,P2、 P3劃線部分為互 補的45個堿基的linker。 1.2目的片段的擴增PCR擴增條件為:94。C/10min,94。C/30s、 55。C/30s、 72°C/2min(30個循 環)，72°C/10min。首先以P1、 P2和P3、 P4分別為引物，以提取牛結核分 支桿菌(CVCC68001 )菌株DNA作為PCR反應的模板，擴增出esxB和 esxA基因片段，回收PCR產物，再以等量的兩回收產物為模板，以P1、 P4為引物，擴增出esxB-esxA融合基因。PCR產物純化試劑盒回收目的 片段。2重組表達質粒pET-32a(+)-cfi)10-esat6的構建用EcoRl 、幼>^///分別雙酶切回收的esxB-esxA PCR產物及pET-32a(+)，將兩酶切產物回收后按100:1 (摩爾比)連接，轉化到大腸埃 希氏菌BL21(DE3),提取質粒，經雙酶切初步篩選陽性克隆，并經序列測 定驗證克隆。
3重組蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析
將含陽性質粒的重組菌——大腸埃希氏菌pET-CFP10-ESAT6抹菌 (2008年5月7日本菌抹已送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心保藏，編號為CGMCC No.2843 )，在LB液體培養基中37。C振蕩 培養過夜，按1:100接種LB培養基，37。C振蕩培養3h，加入IPTG至終濃 度為lmmol/L，30。C繼續培養6h。收集未誘導及6h誘導的菌液lmL,離心取 沉淀，用200^1的pH 7.4的PBS重懸，加入50pL的5xloading Buffer,混勻 后煮沸5min，各取lOfil上清液與標準分子量蛋白Maker進行SDS-PAGE電 泳，后用考馬斯亮藍染色。
4 重組蛋白的純化
將誘導后菌體4。C 5000r/min離心15min,棄上清，將沉淀以10倍濃 縮比例重懸于pH 7.4 PBS中，超聲波(功率200W，工作10s，間歇10s)裂 解菌體20min，再次4°C 5000r/min離心20min，收集上清，經0.45pm濾膜 過濾后，過NI-NTA柱(北京韋氏博慧色譜科技有限公司，具體操作方法 按該產品說明書進行)，通過咪唑濃度梯度洗脫法純化重組蛋白，并根據 Bradford法確定重組蛋白濃度。
5 Dot-ELISA診斷方法的建立
將純化的表達蛋白(包被抗原)進行一定比例稀釋。將剪好的NC膜 浸于蛋白稀釋液中，室溫作用10min，取出置于37。C干燥5min,用pH 7.4 的TBST洗三遍，每遍5min (以下均同)。用5%脫脂乳封閉30min，再以 TBST三遍，放入溫箱干燥5min (檢測抗原)。將待檢血清按1:10稀釋后， 取lpl點樣于膜上，37。C溫育30min, TBST洗3遍。將膜置于1:1000稀釋 的二抗(羊抗牛IgG-HRP)中37。C溫育30min， TBST洗3遍，加入顯色 液顯色。
顯色中止后，呈肉眼可見的斑點，即判為陽性；反之為陰性。6試劑盒的制備和使用
6.1 陽性血清及陰性血清的制備
6丄1 陽性血清的制備采集牛型PPD皮內試驗(TST)及牛結核菌素 IFN-yELISA檢測均為陽性的牛清，將該血清作1:5梯度稀釋后，用本發明 中的Dot-ELISA檢測試驗效價，以最低稀釋度的20倍濃度作為陽性血清 樣品，并加入1/10000疊氮化鈉作為防腐劑。
6丄2 陰性血清的制備采集牛型PPD皮內試驗(TST)及牛結核菌素 IFN-yELISA檢測均為陰性的牛清直接作為陰性血清樣品，加入1/10000疊 氮化鈉作為防腐劑。
6.1.3 HRP-anti-bovine-IgG抗體購自Santa Cruz公司。 6.2溶'液配制
6.2.1 10x洗滌液Ttis堿(Sigma) 60,6g, NaCl 87,8g, Tween-20 10mL 加去離子水定容到1L。
6.2.2底物溶液A: Na2HP04'12H20 3.68g，檸檬酸 0.933g,去離子水 200mL,混勻后4。C保存備用。
6.2.3 底物溶液B:鄰苯二胺0.08g溶于10mL底物溶液A中，按0.5mL/ 支分裝，-2(TC避光保存。
6.2.4 顯色液取0.5mL底物溶液B，避光快速解凍，加9.5mL底物溶液 A,用時加30°/01120216^搖勻，立即使用。
6.3試劑盒組成及包裝
本發明所涉及的Dot-ELISA檢測試劑盒由包被抗原、硝酸纖維素膜 (NC膜)、陽性對照血清、陰性對照血清、10x洗滌液、HRP-anti-bovine-IgG 抗體(SantaCruz公司)、底物溶液A、底物溶液B,顯色液組成。
本試劑盒用于牛結核病Dot-ELISA試驗，進行牛結核病的檢疫及診斷。 6.4使用前的準備
6.4.1使用本試劑盒前，請小心打開包被抗原，用lmL去離子水使其充分 溶解，切忌用力吹打。
6.4.2用去離子水將10x洗滌液稀釋成工作濃度(lx洗滌液)。6.5 檢測步驟
6.5.1 取適量溶解好的包被抗原，作1:200稀釋后放入合適容器中，將NC 膜浸泡其中10min后取出，置37。C (或室溫)晾干。
6.5.2 將陰、陽性血清和待檢血清用lx洗滌液作1:10稀釋后，取lpl點樣 于NC膜上。室溫放置5min。
6.5.3 用15mL lx洗滌液洗滌3遍，每遍5min。
6.5.4將NC膜浸于1:1000稀釋的羊抗牛IgG-HRP抗體中，室溫孵育 30min,中途搖晃幾次。
6.5.5 用15mL lx洗滌液洗滌3遍，每遍5min。
6.5.6 取9.5 mL底物溶液A、 0.5 mL底物溶液B混合，加入H202 混勻后，立即將NC膜放入其中，室溫避光顯色1 2min。
6.5.7顯色完畢后，用去離子H20沖洗，中止顯色。 6.6檢測結果判斷
顯色中止后，呈肉眼可見的斑點，即判為陽性；反之為陰性。 6.7 注意事項
6.7.1試驗過程中不能用手直接接觸NC膜，建議戴手套操作，用鑷子取膜；
6.7.2建議將膜置于干凈的濾紙上干燥；
6.7.3顯色時，可以參照陰陽性對照，確定中止時間。
附圖1 重組菌的誘導表達產物及純化產物的SDS-PAGE結果。
1. 中等蛋白分子Marker;
2. 含pET-32a質粒的大腸埃希氏菌BL21 ( DE3 )菌體裂解物上清， 未經IPTG誘導；
3. 含pET-32a質粒的大腸埃希氏菌BL21 ( DE3 )菌體裂解物上清， 經IPTG誘導；
4. 含pET-CFP10-ESAT6重組質粒的大腸埃希氏菌BL21 ( DE3 )菌體 裂解物上清，未經IPTG誘導；
5. 空白PBS對照；6. 含pET-CFP10-ESAT6重組質粒的大腸埃希氏菌BL21 (DE3)菌體 裂解物上清，經IPTG誘導；
7. 經Ni-NTA柱純化后的重組表達產物。 附圖2 Dot-ELISA對部分樣品的4企測結果。
圖2a 1為牛結核陽性血清對照；2 ~ 24為TST結核陽性的牛血清樣 品檢測結果，25為結核陰性血清對照；
圖2b 1為牛結核陽性血清對照；2 ~ 16為TST結核陽性的牛血清樣 品檢測結果，17為結核陰性血清對照。 本發明的優點
1 本發明中所用的診斷抗原為牛結核感染早期介導細胞免疫的主要 優勢抗原，結核感染后該抗原在體內能持續存在；但禽結核、副結核、及 卡介苗等極易干擾牛結核診斷的細菌不表達該蛋白質。因此，該試劑盒不 僅能及時診斷出牛結核的感染，因而在鑒別診斷上也有較大的意義。
2 應用基因4并4妄(Gene splicing by over lap extension)的方法進4亍兩 基因的連接，并且在兩基因的中間引入一段疏水氨基酸linker,能夠在連接 的同時最大可能的保證兩抗原間的空間結構，以保持蛋白的天然活性。
3 牛結核病Dot-ELISA診斷方法，較之常規的牛結核病診斷方法具 有操作簡便、快捷，所需試劑及實驗條件簡單的優點，并具有良好的特異 性與敏感性，為牛結核的診斷提供了良好的方法。
本發明的積極效果使用本發明所涉及的試劑盒診斷牛結核病快速、 敏感、特異，可在2h內完成一次檢測。<110>中國獸醫藥品監察所 〈120〉牛結核病Dot — ELISA快速檢測試劑盒
〈140〉 2008101064024
〈141〉 2008—05 — 13
<160> 4
<210> 1
<211> 23
〈212〉 DNA
<213>人工序列
〈220〉
<223>根據GenBank中的Wyco力acfer/湖力o「/s AF2122/97 (登錄號NC 002945)設計引物Pl 〈400〉 1
gcgaattcat ggcagagatg aag 23
〈210〉 2
<211> 59
<212> DNA
<213>人工序列
〈220〉
〈223〉根據GenBank中的i^cote"eri咖6oWs AF2122/97 (登錄號NC 002945)設計引物P2 〈400〉 2
gcttccacct cctccgcttc caccacctcc gcttccaccg ccaccgaagc ccatttgcg 59
<210> 3
<211〉 60
〈212> DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉根據GenBank中的y^cotecter/〃/ AF2122/97 (登錄號NC 002945)設計引物P3
〈400〉 3
ggtggcggtg gaagcggeigg tggtggaagc ggaggaggtg gaagcatgac卿gcagcag 60
〈210> 4
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>根據GenBank中的i(Kco力acteh哪6ow's AF2122/97 (登錄號NC 002945)設計引物P4 〈400〉 4
ccctcgagtt actatgcgaa catcccagtg 30
權利要求
1.一種牛結核病Dot-ELISA快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒由重組菌CGMCC No.2843制備的包被抗原、硝酸纖維素膜、陽性對照血清、陰性對照血清、HRP-anti-bovine-IgG抗體、10×洗滌液、底物溶液A、底物溶液B，顯色液組成。
2. 如權利要求1所述的一種牛結核病Dot-ELISA快速檢測試劑盒，其特征在 于重組菌是由提取CVCC68001抹牛結核分支桿菌DNA作為PCR反應的模板擴 增出esxB和esxA基因片段，用基因拼接技術最終擴增出目的基因esxB-esxB 基因、將其克隆進入pET-32a質粒中，再轉入大腸埃希氏菌，獲得含有陽性表達 質粒編號為CGMCCNo.2843的大腸埃希氏菌pET-CFPIO-ESAT6重組菌。
3. 如權利要求1所述的一種牛結核病Dot-ELISA快速檢測試劑盒，其特征在于 其包被抗原是將CGMCC No.2843重組菌在LB培養基中培養后經誘導表達的產 物經純化、定量而成。
4. 如權利要求1所述的一種牛結核病Dot-ELISA快速檢測試劑盒，其特征在于 通過將包被抗原吸附到硝酸纖維素膜上作為檢測抗原用于檢測。
全文摘要
本發明提供了一種牛結核病快速、敏感的診斷方法。該方法通過基因重組技術，利用大腸埃希氏菌體外共表達牛結核分枝桿菌早期分泌蛋白EAST6和CFP10，表達產物經純化和定量后吸附到硝酸纖維素膜上作為檢測抗原，從而建立具有良好敏感性和特異性的牛結核病Dot-ELISA診斷試劑盒。
文檔編號C12N5/16GK101294958SQ20081010640
公開日2008年10月29日 申請日期2008年5月13日 優先權日2008年5月13日
發明者丁家波, 張存帥, 張爾利, 毛開榮, 巍 牟, 程君生, 蔣玉文 申請人:中國獸醫藥品監察所