一個與丹參酮類化合物生成相關的二萜合酶基因及其編碼產物與應用的制作方法

專利名稱：：一個與丹參酮類化合物生成相關的二萜合酶基因及其編碼產物與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及利用cDNA芯片技術克隆植物二萜合酶基因及其編碼產物與應用，尤其涉及丹參主要活性成分丹參酮類化合物生物合成的二萜合酶基因及其編碼產物與應用，屬于藥用植物基因工程領域。
背景技術：
：藥用植物有效成分(次生代謝產物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因的產物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用^r景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(魏小勇，方花，李杰芬.植物中藥功能基因研究.中草藥，2005，36(8):1251-1254)，這些基因的克隆將為詮釋藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制，為藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。藥用植物丹參&7/vm皿加wr/n'zaBge.為一味常用中藥，素有"一味丹參，功同四物"的美稱，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，是眾多復方、保健品的主要成分。脂溶性的二砲醌類化合物是丹參中主要有效成分，以丹參酮IIA(tanshinoneIIA)為代表，統稱為丹參酮類化合物，是一類松香烷型(abietane)的二萜化合物(IkeshiroY,MaseI,TomitaY.AbietanetypediterpenoidsfromSalviamiltiorrhiza.PA_ytoc/em/sz>7.1989,28:3139—3141)。二砲合斷diterpenesynthase),又稱二萜環化酶(diterpenecyclase)被認為是合成萜類次生代謝終產物的關鍵酶(TrappSC,CroteauR.GenomicOrganizationofPlantTerpeneSynthasesandMolecularEvolutionaryImplications.GewWa,2001,158:811-832)。由二萜化合物的共同前體櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)到結構多樣的二萜母核化合物的形成一般經過兩歩反應，即質子化和焦磷酸酯鍵的斷裂。在不同物種中，該過程可由單一的雙功能酶和兩個不同的酶分別催化形成。如赤霉素的前體貝殼杉烯在大部分植物中均由內根-柯巴基焦磷酸合酶(e"-copalylpyrophosphatesynthase,08)和貝殼杉烯合酶(<"/-]110"6116synthase,KS)兩個酶分步催化完成，而在赤霉菌及松樹中則是單一的CPS/KS雙功能酶將GGPP催化合成貝殼杉烯。形成丹參酮類化合物前體松香烷型母核的二萜環化酶已在冷杉、云杉等裸子植物中得到克隆和功能鑒定(VogelBS,WildungMR,VogelG,CroteauR.AbietadienesynthasefromGrandFir(j&'&sgra"fifa).cDNAisolation,characterization,andbacterialexpressionofabifunctionalditerpenecyclaseinvolvedinresinacidbiosynthesis.JB'.o/C7ww,1996;271:323262-2326S),但由于萜類環化酶的催化功能和基因結構在裸子植物和被子植物間存在顯著差異(MartinDM,FaldlJ,BohlmannJ.FunctionalCharacterizationofNineNorwaySpruceTPSGenesandEvolutionofGymnospermTerpeneSynthasesoftheTPS-dSubfamily.尸/a,"尸/y/Sz'o/ogy，2004,135:1908-1927),不能僅通過序列相似性比較而確定其生化功能，常規的利用兼并引物克隆目的基因的策略也難以應用于該類基因的克隆。通過前期研究，我們已從丹參中得到能將GGPP催化產生柯巴基焦磷酸(copalylpyrophosphate,CPP)的柯巴基焦磷酸合酶基因"wC尸S)，即完成GGPP的質子化過程，而本發明涉及的是催化柯巴基焦磷酸的焦磷酸酯鍵的斷裂而形成丹參酮類母核結構的關鍵酶基因，該基因是首次從丹參中得到的丹參酮類成分合成的關鍵酶基因，在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的丹參二萜合酶基因及其氨基酸序列。植物基因克隆的方法有很多種，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年來，國外研究者采用經典的功能克隆法克隆到一些藥用植物的關鍵酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先無目的蚩白或其相應基因定位的的情況下分離相關基因是相當困難的。因此，對于遺傳背景不清，相關基因產物不明的情況下，表型克隆成為基因克隆的主要方法。基因芯片技術是20世紀80年代發展起來的一項高新技術，它可以對生物整個基因組的所有基因表達同時進行實時監測，作為一個全新的、強有力的技術平臺，已廣泛地應用于功能基因組的研究中，也成為挖掘新基因的強有力手段。cDNA芯片已在擬南芥、水稻、番茄、棉花等多個植物中得到了應用，但在藥用植物功能基因研究中還沒有相關報道。
發明內容本發明提供了一種丹參cDNA芯片的制作、雜交、差異基因分析以及功能基因克隆的方法。本發明提供了一種與丹參二萜醌類化合物合成有關的基因丹參類貝殼杉烯合酶(&/WaTO'/rtwr/u'zakaunenesynthaselike,Sm&SZ)，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo.L的DNA序列；2)與序列表中SEQIDNo.l限定的DNA序列具有一個或幾個堿基突變，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。一種由上述基因SWj&SZ編碼的蛋白質，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代且具有序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明SEQIDNo.l的DNA序列由2110個堿基組成，編碼序列表中由595個氨基酸殘基組成的蛋白質序列SEQIDNo.2。本發明克隆基因^SV"i^丄經茉莉酸甲酯誘導后，其表達量明顯增加，伴隨著丹參二路醌類化合物如丹參酮IIA的快速積累。含有本發明基因的表達載體、細胞系及宿主菌和使用該基岡在調節和生產植物二萜類化合物及丹參育種中的應用也在本發明的保護范圍之內。將SEQIDNo.l基因的cDNA克隆到原核表達載體pET32a的限制性內切酶EcoRV禾BNotI位點間，構建帶有HIS表達標簽的SmKSL重組表達載體pET32KSL;轉入丑w//BL21(DE3)表達宿主菌采用ffTG誘導表達。表達產物經初步純化后，加入到以SmCPS催化產物為底物的體外酶促反應體系屮，正己烷萃取反應產物，GC-MS分析。表達產物電泳顯示在約86KDa處得到目的蛋白條帶。GC-MS分析結果表明SmCPS的催化產物在重組SmKSL蛋白酶的催化下，生成了分子量為272(m/z)的新物質，通過分析新產物的分子離子峰與主要裂解方式，認為該產物為松香二烯同分異構體。研究結果表明，本發明與丹參酮類化合物合成有關的基閑具有二蔽合酶基因的DDXXD特征結構域，酶促反應分析發現該基因催化丹參酮類化合物母核的合成步驟，對于調節和生產植物二萜類化合物及培育高品質的丹參具有重要的理論及實際意義。圖1丹參SmKSL蛋白與其他植物二萜合酶家族蛋白的分子進化樹7種二萜合酶蛋白的物種來源為丹參(5"a/vz'aMz7"'or/n'zfl)、黃瓜(Cwct"mssa"v站)、煙草(Mcort朋a,a6acM附)、擬南芥"rafefo/wz'"Aa/細fl)、水禾舀(<9，a加/v");北美冷衫"W&sgro"cfo)。圖2實時熒光定量PCR結果1:0d，2:ld，3:2d，4:3d，5:5d圖3丹參受茉莉酸甲酯誘導后^n尺5Z表達量與丹參酮IIA含量相對變化曲線圖4重組質粒pET32KSL的酶切和PCR鑒定M:DNA分子量標準(DLI5000);1:PCR產物；2-pET32a(+)載休EcoRV和I雙酹切；3:pET32KSL質粒￡wRV和WWI雙酶切。圖5大腸桿菌表達pET32KSL的SDS-PAGE分析M:蛋白分子量標準；1:含pET32KSL的大腸桿菌BL21(DE3)可溶性表達蚩白；2:含pET32a(+)的大腸桿菌BL21(DE3)可溶性表達蛋白。箭頭表不目的重組蛋白。圖6LC-ESI-MS/MS檢測蛋白序列覆蓋率紅色表示檢測到的氨基酸序列，檢索數據庫為SmKSL理論預測序列，檢測覆蓋率為66.89%。圖7SmCPS+SmKSL雙酶促反應產物GC-MS分析A:SmCPS催化產物總離子圖及275(m/z)單離子圖；B:SmCPS和SmKSL雙酶促反應產物總離子圖及272(m/z)單離子圖；C:SmCPS催化產物峰1對應質譜圖；D:e"f-CPP標樣質譜圖；E:SmCPS和SmKSL雙酶促反應產物峰1對應質譜圖；F:貝殼杉烯標準質譜圖；G:松香二烯質譜圖具體實施例方式實施例1、丹參cDNA芯片的制作1、丹參總RNA的分離和檢測取陜西商洛丹參(&/WaM7to/rA/zaBge)根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉移至65。C預熱的lOmL提取緩沖液中(CTAB(W/V)2%，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.!/1,EDTA25mmol.i;1，NaCl2.0mol'L—1，PVP402%，亞精胺0.5g/L，巰基乙醇2%),充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的10MLiCl，混勻后放置4'C沉淀過夜;7500g離心20分鐘，沉淀用500(iLSSTE(SDS0.5%,NaCl1mol.L"，Tris-HCl(pH8.0)10mmol'i;1，EDTAlmmol'L"，在65。C溶解5分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，-7(TC放置2h;4°C13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于100pLDEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置于-80。C冰箱備用。2、cDNA文庫的構建采用mRNA純化試劑盒(QuichprepTMMicromRNAPurificationKit,Pharmacia公司)分離mRNA后，通過在cDNA分子兩端加上EcoRl/Notl接頭，在T4多核苷酸激酶的作用下石粦酸4七，與表達載4本XZAPExpressPredigestedVector(ZAPExpressPredigestedVectorKit,stratagene公司)連氺妾，然后.采用stratagene公司的ZAPExpressPridigestedGigapackCloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)將包裝蛋白在體外包裝連接產物，感染E.coliXLl-BlueMRF'構建成cDNA文庫。3、cDNA芯片的制備3.1PCR擴增挑取分離良好的噬菌斑溶于lOC^LSM緩沖液(Amresco公司)中混勻后作為PCR模板。PCR擴增引物為XZAPExpress多克隆位點兩側的部分序列Ml3-加引物5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'，BK反向引物5'-GGAAACAGCTATGACCTTG-3'。96孔板PCR反應體系，準備如下混合物dNTP(25mmol.L-l)，600pL;Mg2+600|iL，lOx緩沖液lOOO^L;Taq(TakaraExTaq，5UiiL")，40^L'-M13-20引物(12.5拜ol.L-1)，200(iL;BK反向引物(12.5pmol'L-l)200nL;高純水補足至10mL。混合均勻后，用排槍分裝至96孔PCR板。然后各加入6pLDNA模板，混合均勻。在ABI900型基因擴增儀上進行PCR反應，反應條件為94'C預變性3分鐘，然后進行35個循環，為94°C30s，54°C30s，72°C2分鐘，循環結束后72。C后延伸5分鐘。取3(aL反應產物在含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,在SYNGENE型凝膠成像系統下觀察、拍照。3.2PCR產物純化使用96孔Multiscreenfilterplates(Millipore公司)純化板進行PCR產物的純化。將1.4.1項下瓊脂糖凝膠檢測為單一條帶的PCR產物(100pL)轉入純化板中；將純化板放于MilUpore的真空裝置上，于15mmHg真空抽濾IO分鐘，直至抽干；加入100pL水，15mmHg真空抽濾10分鐘，直至抽干；從真空抽濾裝置上取下PCR純化板，加入40〖丄(pH8.0左右)的水，將純化板放至搖床上輕搖20~30分鐘重懸DNA;將純化產物吸出，置于酶標板上測定濃度和純度；取l^L純化產物在1.5。/。的瓊脂糖凝膠上電泳檢測；將純化產物真空干燥。3.3cDNA芯片點制根據上述測定的濃度差異加入適量50%DMSO作為點樣液，調節濃度至約250ng^L-1后，將樣品轉移至384孔板中準備芯片點制。點樣儀為GeneMachme公司OmmGnd100。點樣參數為針2x12，X:8000，Y:6000;點間距300microns;點陣13x14;點陣間距500microns;矩陣模式442。實施例2:丹參中二萜合酶基因的克隆-1、實驗材料的準備丹參毛狀根為發根農桿菌15834直接感染的方式進行Ri-質粒轉化誘導的毛狀根。取6-7V固體培養基(不含激素)暗藏保存的丹參毛狀根，在無菌條件下將2g濕根接種于裝有200ml無激素的6-7V液體培養基的500mL三角瓶中進行繼代培養，培養至18d后作為試驗材料。培養條件為25。C，110120rmin-l，黑暗條件下培養。2、誘導子的制備和處理酵母提取物(yeastextract,YE)生物誘導子的制備取25g酵母提取物溶于125mL蒸餾水中，加入lOOmL無水乙醇，置于4。C冰箱靜置4d，傾去上清液，膠狀沉淀溶于125mL蒸餾水中，加入無水乙醇(乙醇含量達80%)二次沉淀，離心，沉淀溶于lOOmL蒸餾水中'120'C滅菌20min，冷卻后置于4'C冰箱備用。銀離子(Ag+)的制備取AgNO35.096g溶于100mL蒸餾水中，制備得3mmol'L-l的Ag+。誘導子處理向培養18d的丹參毛狀根培養基中分別加入誘導子組合YE+Ag+(YE2ml、Ag+66.7ul)進行誘導處理，每個處理3個重復，分別于YE+Ag+處理后不同時期收獲'用吸水紙吸干，各樣本稱取約2g鮮重于液氮速凍后-70。C保存(提取總RNA)或WC干燥至恒重，7精密稱量毛狀根的千重用于測定毛狀根中丹參酮IIA的含量。3、誘導子處理后丹參酮IIA的含量變化釆用高效液相色譜法測定誘導子處理后丹參酮IIA的含量。取干燥至恒重的丹參毛狀根適量，研碎過40目篩，混勻。取藥材細粉約0.2g，精密稱量，置20mL容量瓶中，加甲醇溶液4mL，精密稱重，超盧處理40mm，取出放冷，加甲醇溶液補足至原重，搖勻，靜置，過0.45pm微孔濾膜即得。色譜條件為Waters2695高效液相色譜儀，RP-WatersC18柱(150mmx3.9mm，5,)，檢測波長270謹;柱溫30°C，流速1.0m.min-1，流動相為0.5%醋酸甲醇(A)禾口0.5。/。醋酸水(B)線性梯度洗脫025min,30%60%A;2530min，60%65%A;3050min，65%70%A;5060min，70%80%A;6061min，80%30%A。經過誘導子處理后，丹參酮IIA含量迅速上升，處理后第48h，丹參酮IIAYE+Ag+處理組是對照組的3.1倍，處理后第6d處理組是對照組的7.4倍，處理后第9d，處理組是對照組的6.9倍。結果表明丹參毛狀根經誘導子處理之后，丹參酮類成分在短時間內迅速積累，丹參酮IIA最大增幅達7.4倍。4、芯片雜交分析根據上述誘導子處理后丹參酮IIA的變化情況，選用YE+Ag+處理后48h的毛狀根及對照組作為芯片雜交樣品，以對照組(C)為參照，與YE+Ag+(YA)的材料進行雜交，重復兩次，每組均采用正反標記以消除染料的誤差。采用間接標記法進行探針標記，包括雙鏈cDNA合成、T7介導的RNA體外轉錄合成cRNA、隨機引物反轉錄、cDNA用KLENOW酶標記等步驟。(1)雙鏈cDNA合成取5昭總RNA，以T7—Oligo(dT)15，-3'，V可以是G、C和A,上海博亞生物技術有限公司)為引物，用cDNASynthesisKit(TaKaRa公司)合成雙鏈cDNA;雙鏈合成以后用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化。(2)體外轉錄合成cRNA:用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProduclionSystem(Promega公司)將雙鏈cDNA進行體外轉錄合成cRNA;然后用RNeasy試劑盒(Qiagen公司)純化。(3)隨機引物反轉錄取2(igcRNA'用SuperscriptII反轉錄酶，200U卞L—1(lnvitrogen公司)，9RandomPrimer進行反轉錄，反轉錄產物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化。(4)cDNA用KLENOW酶標記取1嗎cRNA反轉錄產物，用隨機引物進行KLENOW標記，標記產物用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen公司)純化'純化后抽千。標記過程中dATP,dGTP，dTTP使用濃度為120nM，dCTP使用濃度為6C^M，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用濃度為40^M。將不同樣品分別用cy3、cy5(Amersham公司)進行標記，然后溶于30pL雜交液中(3xSSC,0.2%SDS,5xDenhart's,25%甲酰胺)，于42。C雜交過夜。雜交結束后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩千后進行掃描。將不同樣品分別用cy3、cy5(Amersham公司)進行標記，然后溶于30pL雜交液中(3xSSC,0.2%SDS,5xDenhart's,25%甲酰胺)，于42。C雜交過夜。雜交結束后，先在42。C左右含0.2%SDS，2xSSC的液體中洗5分鐘，而后在0.2xSSC中室溫洗5分鐘，玻片甩干后進行掃描。芯片用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進行掃描。采用GenePixPro4.0圖像分析軟件(AxonInstruments公司)對芯片圖像進行分析，把圖像信號轉化為數字信號；然后對芯片上的數據用Lowess方法進行歸一化；最后用Ttest方法結合兩倍差異的標準來確定差異表達基因。5、差異基因的獲得和分析將每組芯片兩次重復的共同差異基因進行5'單向測序，獲得的EST序列采用Windows系統下的StadenPachage(gap4)(http:Vstaden.sourceforge.net)軟件進行序列前處理以及拼接聚類。去掉載體、接頭以及低質量序列和較短的序列。使用BLASTX(6December2005:BLAST2.2.13released;http:〃www.ncbi.nih,gov/BLAST/)將處理后的EST序列在蛋白質水平上與NCBI非冗余蛋白質數據庫(non-redundantproteindatabase)進行同源性比較，結果克隆號為chip30hlO的基因在YA/C雜交結果中均表現為上調基因，BlASTX注釋為萜類環化酶terpenoidcyclase基因，命名為月-參類貝殼杉烯合酶(5Wvz'aw7"'or/u'zfi！kaimenesynthase,5"m^SZ)基因。6、cDNA末端快速擴增(5'-RACE和3'-RACE)采用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司)試劑盒進行擴增SmAT5X的5'末端和3'末端的擴增，按照說明書進行操作。總RNA用Trizol(Invitrogene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊。以設計的GSP1(5'-CATCGCCGCTTGCATACAAATAACA-CCC-3')為5'RACE特異弓i物，進行cDNA5'末端的擴增。PCR條件為94°C5min，94'C30s、68。C30s、72°C2min(35個循環)，72°C7min。擴增得到長約翻bp的特異性cDNA片段。根據S附尤Si基因片段設計的3'RACE特異引物為GSP2(5'-GGATGATTACTTGTCTGCCTCCTGGG-3')，以GSP2為擴增引物'進行^^fficDNA3'末端的擴增。PCR條件為94°C5min，94。C30s、68。C30s、72。C1.5min(35個循環)，72°C7min。擴增出約600bp的DNA片段。瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara公司)回收目的片段，按pMD19T載體(Takara公司)試劑盒操作手冊將上述片段克隆至pMD19-T載體中，鑒定陽性克隆并測9序(北京三博遠志生物有限公司)。通過cDNA雜交所得EST序列和5'-RACE獲得的部分片段測序結果可得到序列表SEQIDNO:1所示的丹參萜類環化酶基因S"化SZ全長cDNA序列，其所推導的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。7、全長cDNA的克隆和測序根據5'RACE和3'RACE所得到的結果和芯片雜交獲得的Umgene序列，從兩端設計得到鉤取S"i&Si全長cDNA的引物，正向引物為5、-GGGGGCAGCAGCATATTTCAGTCA-3、，反向引物為5、-TACATGATCTGCCCTAAATAGTTG-3、；再以5'-RACE-ReadycDNA為模板，進行LA-PCR。瓊脂糖凝膠電泳表明約在2100bp處出現特異片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T載體中(Takara)，鑒定陽性克隆并進行雙向測序(北京三博遠志生物有限公司)，用于原核表達載體的構建。實施例3、SmKSL基因序列的生物信息學分析本發明涉及的丹參二萜合酶基因Sm尤SZ全長cDNA的長度為2110bp，詳細序列見序列表中的序列1，其中完整開放讀碼框位于192-1979bp。將丹參全長cDNA序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾UNon-redundantGenBankCDStranslation+PDB+SwisSprot+S叩erdate+PIR數據庫中進行核苷酸同源性檢索，結果核苷酸水平沒有發現同源性序列，可見利用常規的兼并引物克隆該基因難度很大。該基因在氨基酸水平上比對分析顯示，丹參s附^a:基因編碼的蛋白質氨基酸序列與其它物種的同源性較低，與煙草萜類環化酶(AAS98912)(terpenoidcyclase)氨基酸序列同源性最高，僅為36%;與擬南芥內根一貝殼杉烯合酶(AAC39443)的氨基酸序列同源性為35%。該基因具有萜類環化酶保守的"DDXXD"結構基序。利用密碼子分析軟件(http:Wwww.ncbi.nlm.nih.gov)對Sm&SL基因的密碼子使用頻率進行分析，并依據該基因的密碼子使用表改變部分堿基e利用生物信息學軟件(http:〃www.cbs.dtu.dk/scrvices/VirtualRibosome/)和BLAST程序對突變后的基因序列進行分析，結果發現，其氨基酸序列保持不變，其仍具有DDXDD結構域。實施例4、茉莉酸甲酯處理后SmKSL基因表達與丹參酮IIA含量的分析利用茉莉酸甲酯(lOOmM)處理丹參毛狀根，收集不同時間點的材料用于丹參Sm^S丄基因表達量和丹參酮IIA的含量。mRNA表達量采用熒光實時定量PCR進行檢測。總RNA用Trizol(Invi加gene公司)試劑盒提取，步驟詳見試劑盒操作手冊。取l嗎RNA模板按RT試劑盒(Takara公司)說明書反轉錄得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABIPrism7000SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems，USA)和SYBGREENPCRMasterMix(AppliedBiosystems,UK)試劑盒'以丹參actin基因(GenBank登錄號DQ243702)(引物序列actin-222:5'畫GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3，，actin-488:5，-AGGAACCACCGATCCAGACA-3')作為對照，確證不同時間都符合要求而且cDNA的量都相差不多。6'm^S'丄基因引物分別為5'CTTCCCAAGACAATGCAAAGAT3鄰5'ATTTCCCTCTCACATTATTAGC3'。PCR反應條件為預變性94。C5min后，開始94'C30sec、55。C30sec、72。Clmin共40個循環，最后72'C延伸7min，最后4°C維持。PCR反應結束后，ABIPrism7000SDS1.1分析工作站自動保存實驗結果。結果表明經過MJ處理后，，m^SZ基因表達水平于24h內迅速升高，之后逐漸降低到對照組水平(圖2)。經actin內參基因均一化之后，與對照組比較，處理后24h，MJ處理組是同時期對照組的14.5倍(圖3)，說明丹參毛狀根經茉莉酸甲酯處理后，5'm/CS'丄基因表達水平內迅速升卨，從而有利于其編碼的蛋白酶催化柯巴基焦磷酸的環化，推動代謝流向目的產物丹參酮類化合物流動。丹參酮IIA含量測定方法同實施例2中4所述。結果顯示經過MJ處理5d后，丹參酮類成分含量迅速上升。處理后第5d，丹參酮IIA成分是對照組的1.3倍，處理后第10d，丹參酮IIA成分含量是對照組的6.3倍；處理后第15d，丹參酮IIA成分含量是對照組的6.9倍(圖3)。結果表明丹參毛狀根經茉莉酸甲酯處理后，丹參Sm人:ttmRNA能被顯著的誘導表達，相繼產牛丹參酮IIA成分的迅速積累。可知所得到的6Vn凡tt基因為丹參酮類成分生物合成途徑上的關鍵酶基因之一。實施例5、SmKSL基因原核表達及功能分析1、大腸桿菌表達載體的構建利用PCR的方法，將經RACE方法克隆到的丹參類貝殼杉烯基因的開放閱讀框(ORF)，插入到大腸桿菌表達載體pET32a(+)的EcoRV和油fI酶切位點之間，獲得了攜帶有HIS表達標簽的SmKSL重組質粒pET32KSL,進行PCR和酶切鑒定(圖4)。2、co/z'[pET32KSL]的誘導表達將構建的pET32KSL質粒轉化表達宿主菌五.co/!'BL21&x￡(DE3)，IPTG誘導表達，所得菌體超聲破碎，上清液經SDS-PAGE蛋白電泳分析，在約86KDa處出現目的蛋白條帶，與預測的重組SmKSL的蛋白分子量符合；而陰性對照五.co/z'[pET32a]誘導表達后在86KDa處未見條帶出現(圖5)。3、重組pET32KSL氨基酸序列LC-ESI-MS/MS分析鑒定SDS-PAGE分離的重組SmKSL蛋白，經胰蛋白酶消化分解得到大量的多肽，LC-ESI-MS/MS檢測分析，使用Bioworks軟件對數據進行換算，得到MS/MS數據采用Sequest檢索引擎和使用Xcalibur軟件與pET32KSL理論預測蛋白序列進行比對，得到共507個氨基酸的多肽序列與pET32KSL預測蛋白序列一致'蛋白檢測覆蓋率達到66.89。/。(圖6)。結果表明將SmKSL編碼區連接到表達載體pET32a(+)，在IPTG的誘導下，在大腸桿菌Aco/ZBL21&x風DE3)中得到了正確的翻譯，在86KDa處所表達的目的蛋白即為SmKSL理論預測蛋白。4、丹參二萜合酶SmKSL的活性分析以GGPP為底物，先建立SmCPS酶促反應體系，待反應完成后，加入初歩純化的重組SmKSL酶，進一步催化SmCPS酶促反應產物；第二步催化產物經正己烷萃取后，GC-MS分析產物成分。結果發現以GGPP為底物，空載體表達空白對照組和SmKSL單獨催化組在275(m/z)和272(m/z)處均未出現新的產物。而SmCPS單獨催化組，如圖7A，總離子圖上在275(m/z)處有新物質產生，且單離子掃描發現275(m/z)只對應一個峰，質譜圖如圖7C，與e",-CPP標樣質譜圖(圖7D)—致，產物鑒定為e,CPP。SmCPS+SmKSL雙酶促反應實驗組，產物經正己烷萃取后，GC-MS檢測到總離子圖上在272(m/z)處得到新的物質，且單離子掃描發現272(m/z)也只對應一個峰(圖7B);產物的質譜圖如圖7E，在現有的MS檢測數據庫中檢索，與對應-貝殼杉烯(kaur-16-ene)標準質譜圖相似，但相似度僅為74%。由于相似度較低，且SmKSL催化產物的質譜電子轟擊碎片峰中含比較穩定的偶離子峰(even-elec加nwn)，如m/z=134和m/z=148，所以排除貝殼杉烯的可能性。考慮到乃參酮類屬松香垸型的二萜類化合物，與裸子植物冷杉屬云杉中松香烷酸母體結構相似，文獻檢索發現新產物(m/z272)質譜圖與松香二烯(abietadiene)質譜圖相4以(Hyung匿JaeLee,MatthewM.Ravn，RobertM.Coates.Synthesisandcharacterizationofabietadiene,levopimaradiene，palustradiene,andneoabietadiene:hydrocarbonprecursorsoftheabietanediterpeneresinacids.Jfe加/jedraw.2001,57:6155-6167.)，且均含有可能由于發生了環內雙鍵的RDA裂解，而得到m/z^48的偶數碎片峰。通過分析新產物的分子離子峰與主要裂解方式，認為該產物為松香二烯同分異構體。5、丹參二萜合酶SmKSL衍生物的活性分析分別將SEQIDNo.l序列709bp處的C突變為T、797bp處T突變為C、1357bp處T突變為C，1589bp處G突變為T得到衍生序列SEQIDNo.3;797bp處T突變為C、1357bp處T突變為C，1589bp處G突變為T得到的衍生序列SEQIDNo.5。其編碼氨基酸序列分別為SEQIDNo.4、SEQIDNo.6，經GC-MS檢測進行酶活性分析，發現所得反應產物的GC-MS結果均與SmKSL產物相同(圖7B、7E)，說明均具備與SEQIDNo.2相同的生物學功能。序列表〈110〉中國中醫科學院中藥研究所<120〉一個與丹參酮類化合物生成有關的二萜合酶基因及其編碼產物與應用〈160〉6<170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉2110〈212〉DNA〈213>丹參(&7w's必7"orr力izaBge.)〈220〉<221>CDS〈222〉(192)..(1979)〈400〉1ttctaatacggggc犯gcgtggtatcaacgcagagtacgcgggggcagca60gcatatttcagtcaaccttttgttgtcatctcttacaagaatccctcctc120actccattcatac已tatcc3cagagcctggcatcgccgccgccgccgccc180cagagctaaagatgtcgctxgccttcaacccggcagccaccgctttctccggcaacgggg240ctcgg3gcagtttccggtga￡LgC3tgtt3Ctttccga,tga300tcaccaataagtcatctttcgccgtgaaatgcaaccttacttgatgggg已360gaagttcaagggg3gtaactttccggcagctgcggctgttcagc420ctgcggcggatatgccctctaatctctgtataatcgacaccctccaaaggttgggagtcg480accgatacttccgatxtgaaatcgacactattctagaggacacatacaggttatggcaac540gg咖g卿gagcgatattttcggatactgctattcatgcaatggcatttagacttt.tgc600gagtc犯gggtx3tca<g3gg已已ctggctccgt已tgctgatc肌gagcacg660ttgacctgcaaacgattgasgtggcg織gttatcgagcttt3C3g3gC3gcacaggaga720g3織ggggs鄉cg卿gc3gtcttaag3aactacatgcttggaccaccacctttctta780agcagaagttgctcactaactccattcctgacaagaagttgcacaaactggtggaatact840ctatcacgggatattagatag犯tggg已gttagac犯aacctcgacctat900atg已tat朋gct已ttatcgaactt.caaaagctgc犯ataggttctctaatctatgtagtg96013犯gattttctagcatttgcgaggcaagattttaacatttgcc已agcccaacaccagaaag1020aacttcagcaactgcaaaggtgg憶gcagattgtaagttggacaccttg1080g,tg化gtgcgtgttgctaattttctaacttcagcaattattggtgatcctgaattgt1140ccgatgttcgcatagtctttUgtgcttgtgacacgteittgatgattttt1200tcgatcatcgtgggtctagagsagagtcctacaagatcctaaageiatgga1260￡l￡lg3g￡L3gCCagccgca.gaatatggttccgaggaagttgaaattcttttt￡LC￡lgCiagta.t1320acaacacagtgceig卿gggctcatgtcgaacaaggacgt已gtgttaaag1380taagctgtgggttcaaatactatcaattttcaagagag犯ttggatacat1440ggagcgatgacacggcactaaccttggatgattacttgtctgcctcctgggtgtcaattg1500gctgcagaatctgcatcctcaattcatcggtataaaactatccgatgaaa1560tgcttctgagtga卿gtgcattgatctgtgt鄉catgtctccatggttgaccggctgc1620tcaacgatgtgcaaactttttactggaaacagtgtgaccc1680ttctgctagcgatgacagctcctttactgaagaag幼gcc1740ca^ag犯已tggctgaatgt朋ctgatgcagattgtctacaaaacagg朋1800ccatcttcccaagacaatgcaaagatatgtttctgaaggtatgcaggattgggtgttatt1860tgtatgcaagcggcgatgaattcacatctcgatgga卿tatgaaatcct1920tggtttatgaattcatcctcttgtagctaataatgtgagaggga犯tgaa1980atgaattctgtgagcaeictatttagggcag3tcatgt已ctattgt犯eiagtatactgact2040gaatgccaca.eitauagatgataaattgattt21002110<210〉2<211〉595<212〉PRT〈213〉丹參(&3hi3甜"orr/izsBge.)<400>2MetSerLeuAlaPheAsnProAlaAlaThrAlaPheSerGlyAsnGly151015AlaArgSerArgArgGluAsnPheProValLysHisValThrValArg202530GlyPheProMetlieThrAsnLysSerSerPheAlaValLysCysAsn14LeuThrThrThrAspLeu50GluAspSerAsnPhe65MetProSerAsn40MetGlyLyslieAla55AlaAlaAlaAla45LysPheLysGlyGlu60GinProAlaLeu85AspArgTyrPheArgSerGlulie100GinArgLysGluProAlaAlaAlaAlaVal7075CyslielieAspThrLeuGinArgl,euThr90ThrlieLeuGluArgLeuTrp115MetAlaPheArgAsp105AlaliePheSerArg120LeuArgValLysHisAlaMetAlaPheArgLeu130135SerGluGlul,euAlaProTyrAlaAspGin145ThrlieGluValAla,Asp80G]yVal95AspThrTyr110AspThrAlalie125TyrGluValSerPro150ThrVallieGluGly140Hi'sVa]AspAla165ArgThrGlyGluAspGluSerSer180ThrThrPheLeuLysGinLysLeu195200HisLysLeuVa.lGluTyrGlu155TyrArgAlaAlaLeu170LeuLysLysLeuHis185LeuThrAsnSerLeuGin160GinGlu175AlaTrpThr190ProAspLysLysLeu210LeuAspArgMetGly225TyrTyrArgThrGlu215ValArgGinAsnLeuAsp230235LysAlaAlaAsnArgPhelie205TyrLeuLysAsnTyrHisGlylieScrLysAlaAlaAsnArg245250GluAspPheLeuAlaPheAlaArgGinAspPheAsnlieGinHisGin275Leu260LysGluLeuGinGin280Gin265LeuGinArgTrpAsn220LeuTyrAsp丄丄eSer240SerAsnLeuCysSer255GinAlaTyr285Cys270AlaAspCysTyr295lieGlyAspProLysLeuAspThrLeuLysTyrGlyArgAspValValArgValAlaAsn290PheLeuThrSerAlalie305310lieValPheAlaGinHisVal300LeuSerAspGin325GlySerArgGluGlu315ThrArglieAspPheAspHisArg340lieLysGluTrpLysGluLys355lieLeuPheThrlieValLeuVal330SerTyrLyslieValGlu370GluArgAlaHisVal385LysLeuTrpVaJGlu345ProAlaAlaGluTyr360ValTyrAsnThrAla375GluGinGlyArgSer390lieLeuSerlieGin405TrpSerAspAspThrAlaLeuThr420TrpValSerlieGlyCysArgVal380ValLysAspPhe395LysArgGluLeuValArg320AspPhe335LeuGluLeu350GlySerGluGlu365AsnGluLeuAlaSer435lieGlylieLysLeuSer450AspLeuCysArgHisVal465470GinThrPheGluLysGluPhe410LeuAspAspTyrLeu425CyslieLeuMetlie440AspGluMetLeuLeu455SerMetValAspLeulie400AspThr415SerAlaSer430SerMetGinPhe445GluGluCyslieSer460LeuLeuAsnL>ys485AlaAsnLysAspArg475ArgLysGluAsnThrGlyAsnSerLeuLeuLeuAla500lieAlaLysGluAlalieAsn490AspSerSerPheThr505AlaGluCysAsnAspVal■ValThr495GluGluGlu510ArgGinLeuArglieAlaLysGluMetAlaGluCysAsnArg515520525MetGinlieValTyrLysThrGlyThrliePheProArgGinCysLys530AspMetPhe545GlyAspGluPheLeuValTyrGlu580ArgGlyLys595535540LysValCysArglieGlyCysTyrLeuTyrAlaSer550555560ThrSerProGinGinMetMetGluAspMetLysSer565570575ProLeuThrlieHisProLeuValAlaAsnAsnVa丄585590<210>3<211>2110<212>腿〈213>丹參(&^"si/Wtiw了/w'幼Bge.)<220〉<221>CDS<222>(192)..(1979)<400>3ttctaatacgggtatcaacgcagagtaege,gggggca.gra60gtxaaccttttgttgtcatcatccctcctcattttcagat120gcaacata^ac卿gcctggcatcgccgccgccgccgccc180gatgtcgetcgccttcaacccgctttctccggcaacgggg240cteggsgcagtttccggtgaagcatgttacagtccgaggatttccgatga300tcaccaataagtcatctttcgccgtgaaatgcaaccttactacaacagatttgatgggga.360agatagcagag犯gttcaaggggga卿cagtaactttccggcagctgcggctgttcagc420ctgcggcg薛tatgccctctwtctctgt3taategscaccctccaaagg480accgatacttccgatctgaaatcgacactettctagaggacacitacaggttatggcaac540gg咖g卿gagegatatttLc:ggatactgetattcatgeaatggcatttagscttttgc600g3gtC卿ggtcat,cagaggaactggctccgtatgetgatcaagagcacg660ttgacctgeatiticga,t,tg朋gtggcgacagttatcgagctttacagagtagC3C鄉卿720gaacagggga卿cg卿gcaactacatgcttggaccaccacctttctta780173gC3gaagttgctcaccaactccattcctgaca已ga已gttgcacaaactg840已cttgaagaactatxacgggg^tg,gttagaca皿acctcgacctat■atgatataagctattatxgaacttcaaaagctgca^ataggttctctaatct已tgtagtg960aagattttctagcatttgcgaggcaagattttaacatttgccaagccca8C￡LCC￡Lgaaag1020犯cttcagcaactgcaaaggtggtatgC3g已ttgtaagttggacaccttg1080g卿tgtagtgcgtgttgctaattttctaacttcagcaattattggtgatcctgaattgt1140ccgatgttcgcatagtctttgcccaacatattgtgcttgtgacacgtattgatgattttt1200tcgatcatcgtgggtct卿gaagagtccttgaattaataa^ga^tgga1260aagagaagccagCCgC3g犯tatggttccgaggaagttgaaattctttttacagcagtat1320acaacacagtaa已tgagttggcag卿gggctcatgccgaacaaggacgtagtgttaaag1380attttct已att犯gctgtggtatcaattttttggatacat1440gg3gCg3tg3cacggcactaaccttggatgattacttgtctgcctcctgggtgtcaattg1500gctgcagaatctgcatcctcatgtcgatgc已attc3tcggtataaaactatccgeitgaaa1560tgcttctgagtga卿gtgcattgatctttgt鄉catgtctccatggttgaccggctgc1620tcaacgatgtgcaaacttttgcaaagaaast已ctgg朋eicagtgtgaccc1680ttctgctagcgatgac已gctcctttactg已aga已gaagccattagaat已g1740caaaagaaa^:ggctgaatgtaac3ggagac犯ctgatgc已gattgtctacaaaacaggaa1800ccatcttcccttctgaaggtatgc已ggattgggtgttatt1860tgtatgc犯gcggcgatgaattcacatctcgatgga卿tatgaaatcct1920tggtttstgaattcatcctcttgtagctaataatgtg恥agggaaatga^1980atg肌ttctgtttagggcagatcatgtact已ttgtaaa^gtatactgact2040ataagatgat3已attgattt21002110<210>4〈211〉595〈212〉PRT<213>丹'參(&^Kia始7ti群/i幼Bge.)〈400〉4MetSerLeuAlaPheAsnProAlaAlaThrAlaPheSerGlyAsnGly151015AlaArgSerArgArgGluAsnPheProValLysHisValThrValArg20MetlieThrAsnGlyPhePro35LeuThrThrThrAspLeu50GluAspSerAsnPhe65MetProSerAsnPro25SerSerPheAlaLys40MetGlyLyslieAla55AlaAlaAlaAlaThr30LysCysAsnVal45LysPheLys(;].yGlu60GinProAlaAlaLeu85AspArgTyrPheArgSerGlulie100GinArgLysGluProAlaAlaAlaAlaVal7075CyslielieAspThrLeuGinArgLeuArgLeuTrp115HisAlaMetAlaPheArg130SerGluGluLeuAlaPro145150ThrlieGluValAlaThrThr90AspThrlieLeuGlu105AlaliePheSerGly95ThrAsp80ValTyrArg120LeuLeuArgValLys135TyrAlaAspGinAsp110ThrAlaLieAsp125GlyTyrGluValSer140HisValAspLeuAla165AspGluSerSerGlu155VallieGluLeuTyrArgValAlaArgThrGlyGlu180L>euLysGinLysThrThrPhe195LysLeuHisLysLeuVal210LeuAspArgMetGly225TyrTyrArgThrLeu170LeuLysLysLeuHis185LeuThrAsnSerGin175TrpGin160GluThrLeu200TyrTyrLeuLysAla190ProAspLysGlu215ArgGinAsnLeuVal230LysAlaAlaAsnlie205AsnTyrHisGlylie220AspLeuTyrAsplieSer235240PheSerAsnLeuCysSerSerLysAlaAlaAsnArgPheSerAsnLeuCys245250255GluAspPheLeuAlaPheAlaArgGinAspPheAsnlieCysGinAla19GinHisGin275LysLeuAspThrLeuLys290PheLeuThrSerAla305lieValPheAla260265LysGluLeuGinGinLeuGinArgTrpGin280GlyArgAspValTyr295lieGlyAspProlie310HislieVall>eu27。TyrAlaAspCys285ValArgValAlaAsn300LeuSerAspValGin325PheAspHisArgGlySerArgGlu340TrpLysGluLysGlu315ThrArglieAspVal330SerTyrLyslielieLysGlu355ValGlulieLeuPheThr370GluArgAlaHisAla385lysLeuTrpValGlu345AlaAlaGluTyrAsp335GluArg320PheLeuPro360AlaValTyrAsnThr375GinGlyArgSerLeu350SerGluGluGlu390lieLeuSerlieGly365ValAsnGluLeuAla380LysAspPheLeuVal395LysArgGluLeuGinlieLeuSerliePhe405410TrpSerAspAspThrAlaLeuThrLeuAspAspTyrLeuAsp420TrpValSerlieGlyCysArg435lieL.ysLeuSerLeu425CyslieLeuMetAsp415Alalie400ThrSerlieGly450AspLeuCysArgHisVal465470GinThrPheGluLysGlulie440GluMetLeuLeuAsp455SerMetValAspSer430SerMetGinPhe445GluGluCyslieSer460LeuLeuAsnAspLeuLeuLeuAla500Lys485AlaAsnLysAspArg475ArgLysGluAsnThrGlyAsnSerAsp505AsnThrGlyAsnSerVal490495SerSerPheThrGluGlu20Glu510Val480ThrGluAlalieArglie515MetGinlieVal530AspMetPheLeu545GlyAspGluPheLeuValTyrGlu580ArgGlyLys595AlaLysGluMetAlaGluCysAsnArgArgGinLeu520525TyrLysThrGlyThrliePheProArgGinCysLys535540LysValCysArglieGlyCysTyrLeuTyrAlaSer550555560ThrSerProGinGinMetMetGluAspMetLysSer565570575ProLeuThrlieHisProLeuValAlaAsnAsnVal585590<210>5〈211〉2110〈212〉DNA<213〉丹參(5"a7w'a胞7"orr力i幼Bge.)〈220〉〈221>CDS〈222〉(192)..(1979)<400>5gggc犯gcgtggtatc犯cgC3g3gt3CgCgggggC3gC360gcatatttcsgtcaaccttttgttgtcatctcttscaagaatccctcctcattttcagat120actccattcatacatatccac聊gcctggcatcgccgccgccgccgccc180C3g3gcta犯gatgtcgctcgccttcaacccggcagccatccgctttctccggc咖gggg240ctcggagcaggagagaaaattttccggtgaagcatgttac已gtccgaggeitttccgatga300gtcatc,tttcgccgtg犯stgcaaccttactBcaacagatt,tg3tggggEl360agatagcagsgaaigttcaaggggga卿cagtaactttccggcsgctgcggctgttcagc420ctgcggcggatatgccctxtaatctctgtataatcgacaccctccaa已ggttgggagtcg480已ccgatacttccgatctgaaatcgacactattctagaggacacatacaggttatggcaac540gg認g卿gagcgatattttcggatactgctattcatgcagacttttgc60021gagtcaaggg已tatgaagttttg￡lCCtgC￡l￡l￡LCg3ttgaagtggcgacagg犯C3gggg3卿cg卿gcagtcttaagaagcagaagttgctcaccaac.tccattcctgacttg犯g犯ctatcacgggctattatcga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