一種鉀離子轉運相關蛋白系統及其編碼基因簇與應用的制作方法

專利名稱：：一種鉀離子轉運相關蛋白系統及其編碼基因簇與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種鉀離子轉運相關蛋白系統及其編碼基因簇與應用。
背景技術：
：鉀離子轉運蛋白是細胞中負責將K+向細胞內轉運的一種跨膜運輸蛋白。它普遍存在于生物界，目前已經在革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、藍細菌、酵母、植物和古細菌等生物體內都發現了K+轉運蛋白(BallalWa/.,2007;Markus&Pascal,2007;Matsuda&Uozumi,2006;Michel"cr/"2006;Nakamura"a/"1994;NakamuraW"/.，1998b)。在細菌中已經發現了四種K+轉運蛋白，主要是腸細菌、藍細菌等(BarbacidWa/.,1991;BossemeyerWa/.,1989;DoschWa/.,1991;NakamuraWa/.,1998b;Rhoads1978)。K+是細胞內含量最高的陽離子，對于維持細胞內各種酶的活性、抵抗外界的高滲環境和維持細胞內pH值的平衡都起到了重要作用。此外，K+還可以作為胞內的第二信使，傳遞信號。細菌中K+轉運蛋白Trk系統受ATP激活，在質子勢的驅動下，將K+轉向細胞內部，同時伴隨著H+的向內轉運。這一功能受胞內外滲透壓的調控。K+轉運蛋白在醫藥、發酵、環保和耐鹽堿植物培育等方面具有重要的應用潛力。例如，克隆K+轉運蛋白基因，將其轉入植物中，可以獲得耐鹽堿性提高的轉基因植物，這對于鹽漬化土壤的利用具有重要意義(Espinosa-RuizeM/.，1999;Suea/.,2002);又如通過K+轉運蛋白基因轉化微生物，使轉基因微生物能夠在高滲的環境中完成正常的降解污染物的功能，對于污水治理、加強環境保護具有廣闊的前景。
發明內容本發明的目的是提供一種鉀離子轉運相關蛋白系統及其編碼基因簇。本發明所提供的鉀離子轉運相關蛋白系統，來源于淀粉水解嗜堿單胞菌C4汰a"mo"wamy/o/j;"cfl)N10CGMCC0463，是由如下(a)禾卩(b)中的兩種蛋白質組成的(a)其氨基酸序列為序列表中的序列3，或將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與鉀離子轉運相關的由序列3的蛋白質衍生的蛋白質；(b)其氨基酸序列為序列表中的序列4，或將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與鉀離子轉運相關的由序列4的蛋白質衍生的蛋白質。其中，序列表中序列3由458個氨基酸殘基組成。序列表中序列4由483個氨基酸殘基組成。為了便于所述兩種蛋白的純化，可在由序列表中序列3或4所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l標簽的序列<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>帶有表1所示標簽的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。如帶有表l所示標簽的上述(a)蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列5的自5'末端第3009-4382位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示標簽的編碼序列得到。編碼上述蛋白系統的基因簇也屬于本發明的保護范圍。所述基因簇具體可為如下l)-3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中的序列5;2)在嚴格條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交且編碼上述鉀離子轉運相關蛋白系統的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼上述鉀離子轉運相關蛋白系統的DNA分子。所述步驟3)中的基因簇，與l)的基因簇最好有95%以上的同源性。序列表中的序列5由4634個核苷酸組成，自5'末端第1558-3006位編碼序列表中序列3所示的蛋白質；自5'末端第3009-4382位編碼序列表中序列4所示的蛋白質。上述嚴格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。擴增上述基因簇全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。含有上述基因簇的重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組載體具體可為在pUC18中插入上述基因簇得到的重組載體，如pUCAaAH。本發明的另一個目的是提供一種培育鉀離子轉運能力提高的轉基因生物的方法。本發明所提供的培育鉀離子轉運能力提高的轉基因生物的方法，是將，基因簇導入宿主細胞中，得到鉀離子轉運能力提高的轉基因生物。所述基因簇是通過所述重組載體導入生物中。本發明從淀粉水解嗜堿單胞菌04汰a/Zmo"asam_y/o/Wca)N10CGMCC0463中克隆到K+轉運蛋白基因簇7)^4//，通過構建含有該基因簇的重組載體，將其轉入大腸桿菌感受態細胞中。實驗證明，轉入1^+轉運蛋白基因簇7>^4//的大腸桿菌可以在K+濃度為0.1mM、pH8.0的堿性環境中生長良好，而轉入空載體的大腸桿菌在此培養基中不能生長。圖1為重組載體pUCAaAH的示意圖圖2為轉入重組克隆載體pUCAaAH的LB2003在不同pH條件下、在含有3mMK+的培養基中的生長曲線圖3為轉入重組克隆載體pUCAaAH的LB2003在不同pH條件下、在含有0.1mMK+的培養基中的生長曲線圖4為轉入重組克隆載體pUCAaAH的LB650在pH7.4條件下的生長情況具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1、與鉀離子轉運相關蛋白及其編碼基因的獲得1、淀粉水解嗜堿單胞菌(」汰a/^o"w"m_y/o/_y"cfl)N10總DNA的提取取淀粉水解嗜堿單胞菌"&a//mo"a5flm>;/o/;;"ca)N10(專性嗜堿革蘭氏陰性菌，分離自中國內蒙古鹽堿湖，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC0463)的新鮮濕菌體20g，懸浮于10mL50mm/LpH8.0的Tris緩沖液中，加入少量溶菌酶和8ml0.25mm/LpH8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)，混勻后于37'C放置20min;然后向反應液中加入2mL10%(質量百分含量)的十二烷基硫酸鈉(SDS)，55"C放置5分鐘；用等體積的酚、氯仿組成的抽提液抽提兩次，取最后一次抽提的上清液，用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。將回收的DNA先后用70X(體積百分含量)的乙醇和無水乙醇洗滌后，所得DNA溶于0.5mLTE緩沖液中(10mm/LTris，lmm/LEDTApH8.0)，加入10mg/mLRNA酶(RNase)3uL，37。C保溫lh，再用等體積的酚、氯仿組成的抽提液抽提一次，取上清用2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。將回收的DNA先后用70%(體積百分含量)的乙醇和無水乙醇洗滌后，真空干燥得到DNA。將得到的DNA溶于去離子水中，冷藏備用。利用紫外分光光度計對上述獲得的DNA進行檢測，計算A260/A280|BA260/A230的值，結果表明，A260/A280=1.98，A260/A230=2.18，說明獲得的DNA純度較高。2、7>^//基因和^^基因3'端序列的獲得取上述步驟1獲得的DNA溶液10uL(含50ugDNA)，用限制性內切酶^mHI部分酶切，純化回收3-8kb的酶切產物。取5ug上述酶切產物與lug經5amHI酶切并脫磷酸化的質粒pUC18(GIBC0-BRL公司)在20uL的連接體系中16。C反應16h，連接產物轉化大腸桿菌LB650(TK1001z^^/::CamfzIfrK::KarO(Nakamura,T.，Yamamuro，N.,Stumpe，S.,eZa/.CloningofthetrkAHgeneclusterandcharacterizationoftheTrkK(+)-uptakesystemofVibrioalginolyticus.M'cra6/o/ogy(2ea(i/"g'(1998a).144(Pt8)，2281-2289.)的感受態細胞。將得到的重組菌在含有3MmKC1的固體培養基平板上進行篩選。挑取單克隆菌落，提取質粒，采用Sanger雙脫氧法進行測序。測序結果表明，插入的片段中含有一個長1449bp的7HZ/基因的開放閱讀框架(ORF)和7>￡4基因3'端的部分序列。7H/Z基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列4所示。3、反向PCR構建&"基因的5'端序列取10嗎上述步驟1獲得的DNA，用限制性內切酶州>///懷完全酶切30min以后，DNA純化試劑盒純化回收，測定OD26o值。取300ng上述回收的DNA，在300^1的體系中用T4DNA連接酶環化，4t:過夜。以上述連接產物為模板，用正向引物5'-TCGATTTGCTGCAAGGAGGTGAAGTCGA-3'和反向引物5'-AAGCACCACGTTTGATAAGCACGATGG-3'擴增核心區域的側翼序列。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現，得到了一個8000bp左右的基因組序列，經測定發現該序列包括llOObp的基因的5'端序列。4、重組克隆載體pUCAaH、pUCAaA和pUCAaAH的構建分別根據上述步驟2擴增得到的^^y基因序列和^vb4基因的3'端序列，根據上述步驟3擴增得到的fr/U基因的5'端序列設計引物，引物序列及限制性酶切位點如下基因的正向引物trkH-H101:5'-ACCGAATTCTGCCGAAAGTGCTGGCTGA-3'(畫線部分為五coRI酶切位點)基因的反向弓I物trkH-H102:5'-AAATCTAGAAGGTGAAGTCGATATCGC-3'(畫線部分為X6aI酶切位點)Mb4基因的正向引物trkA-A101:5'-CCATCTAGAGACCGCAGCCTGCTT-3'(畫線部分為I酶切位點)Wb4基因的反向引物trkA-A102:5'-CAAAAGCTTCAGCTCTGGCCTCTGCTC-3'(畫線部分為///m/III酶切位點)Wb4//基因簇的正向引物trkH-H101:5'-ACCGAATTCTGCCGAAAGTGCTGGCTGA-3'(畫線部分為￡coRI酶切位點)Wb4/Z基因簇的反向引物trkA-A102:5,-CAAAAGCTTCAGCTCTGGCCTCTGCTC-3'(畫線部分為州Wffl酶切位點)。以上述步驟1獲得的N10的總DNA為模板，利用PCR方法擴增全長f^i/基因、Wb4基因和WU//基因簇序列。將W//基因的PCR擴增產物用五coRI和Jttwl雙酶切后與經同樣酶切的質粒pUC18相連接，將得到的重組載體命名為pUCAaH;將frvb4基因的PCR擴增產物用Wfll和///"dn雙酶切后與經同樣酶切的質粒pUC18相連接，將得到的重組載體命名為pUCAaA;將^L4/Z基因簇的PCR擴增產物用￡coRI和歷'"dll雙酶切后與經同樣酶切的質粒pUC18相連接，將得到的重組載體命名為pUCAaAH。將重組載體pUCAaH、pUCAaA和pUCAaAH酶切后分別連接到pMD18-T載體上進行測序，測序結果表明，Wi/基因已經插入到重組載體pUCAaH中，W/Z基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列4所示；frfc4基因已經插入到重組載體pUCAaA中，化L4基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列3所示；化L4/Z基因簇已經插入到重組載體pUCAaAH中，^^4//基因簇的核苷酸序列如序列表中序列5所示。重組載體pUCAaAH的示意圖如圖1所示，從圖中可以看出，基因和W//基因的轉錄方向相反。同時，以J￡:.co//K12的基因組DNA為模板，用下述引物PCR擴增￡.co"K12中的Mt/7基因和基因￡.co/z'K12的fr^f基因的正向引物5'-ACCGAATTCatgcattttcgcgcc-3'(畫線部分為￡coRI酶切位點)五.co/fK12的化&if基因的反向引物5'-CAAAAGCTTTCAATGTCGCAACAAC-3'(畫線部分為/^"dll酶切位點)￡.co//K12的基因的正向引物5'-ATCGgaattcGGATCTTTGTGCCGC-3'(畫線部分為￡coRI酶切位點)￡.co/z'K12的基因的反向引物5'-TAGCaagcttTTTAGTTGGTGCAGGTG-3'(畫線部分為i^7w/in酶切位點)將上述PCR擴增產物分別用/f&dn和I酶切后與經同樣酶切的pUC18載體連接，得到重組質粒pUCEH和pUCEA。實施例2、鉀離子轉運相關蛋白系統TrkAH的堿適應性測定將上述實施例1構建的重組克隆載體pUCAaAH轉入大腸桿菌LB2003(TK1001zf^4)(Nakamura,T"Yamamuro,N.,Stumpe,S.,Wa/.CloningofthetrkAHgeneclusterandcharacterizationoftheTrkK(+)-uptakesystemofVibrioalginolyticus.M/craWo/ogy(1998a).144(Pt8),2281-2289.)中，得到重組大腸桿菌KB2003AH。用二乙醇胺(DEA)緩沖液洗滌上述生長至指數生長后期的重組大腸桿菌KB2003AH3次，分別在pH7.5(HEPES)、pH8.0(Tricine)、pH8.5(TAPS)和pH9.0(Ampso)的條件下測定細胞內k+的濃度，并計算動力學常數。結果表明，在pH7.5時，Vmax=129nmolmin隱1mg"，Km=0.37mM;在pH8.0時，Vmax=125nmolmin-1mg-1，Km=0.17mM;在pH8.5日寸，Vmax=76nmolmin國1mg-1，Km=0.13mM;在pH9.0時，由于測定方法的局限性，得不到有效的結果。從以上結果可以看出，隨著pH值的升高，TrkAH對K+的親和力不斷增加，根據在pH7.5、8.0禾n8.5時的結果，說明在pH8.0時，TrkAH對K+具有相對較高的親和力和轉運能力，說明TrkAH具有一定的堿適應性。實施例3、鉀離子轉運相關蛋白系統TrkAH的功能實驗將上述實施例1步驟4構建的重組克隆載體pUCAaA和pUCAaAH分別轉入到大腸桿菌LB2003中，得到重組菌KB2003A和KB2003AH。將得到的重組菌KB2003A和KB2003AH分別在LBK30培養基(多聚蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,K2HP042.74g/L,KH2P040.82g/L,Na2HP0412.2g/L,NaH2P042.65g/L)中37。C下培養12小時，挑取單克隆分別在pH7.5、8.0、8.5和9.0的條件下，在K3培養基(KC10.224g/L，(NH4)2S041.06g/L，Na2HP041.647g/L，NaH2P040.359g/L，MgSO40.1g/L，NaC15.85g/L，葡萄糖4.36g/L)中37。C下培養40小時，觀察重組菌的生長情況；同時以轉入空載體pUC18的大腸桿菌LB650和LB2003作為對照。重組菌KB2003A和KB2003AH在含有3mMK+培養基中的生長情況如圖2所示。圖2A中，KB2003-18表示轉入空質粒pUC18的LB2003，KB2003EA表示轉入質粒pUCEA的重組菌的生長情況，KB2003A表示轉入重組克隆載體pUCAaA的重組菌的生長情況，KB2003AH表示轉入重組克隆載體pUCAaAH的重組菌的生長情況。圖2B、2C和2D中各條曲線代表的含義與圖2A相同。結果表明，轉入r^^Z/基因的重組菌可以在高pH的條件下生長，說明TrkAH起到轉運鉀離子的作用。重組菌KB2003AH在含有0.1mMK+培養基中的生長情況如圖3所示。圖3中，LB2003AH表示轉入重組克隆載體pUCAaAH的重組菌的生長情況，LB2003EA表示轉入重組克隆載體pUCEA的重組菌的生長情況，LB2003-18表示轉入空質粒pUC18的重組菌的生長情況。從圖3中可以看出，轉入重組克隆載體pUCAaAH的大腸桿菌LB2003在pH8.0的條件下，可以在含有O.lmMK+的KO.l液體培養基(培養基中KC1濃度為O.lmM，其余成分和K3培養基相同)中生長，而轉入重組克隆載體pUCEA的大腸桿菌LB2003和轉入空載體的陰性對照菌均不能生長，說明在偏堿性環境中、在極低濃度的K+條件下，TrkAH依然具有轉運K+的能力。轉入重組克隆載體pUCAaAH的大腸桿菌LB650在pH7.4的條件下，在含有100mMK+的LBK100培養基(酵母提取物5g/L，多聚蛋白胨10g/L，KC17g/L，HEPES3g/L,pH7.4)中，在含有3.5%(質量百分含量)的NaCl存在的條件下仍然能保持較高的生長速率;而對照轉入重組克隆載體pUCEH的大腸桿菌LB650則生長速率變慢。具體生長情況如圖4所示。其中，KB650AH表示，轉入重組克隆載體pUCAaAH的重組菌的生長情況，KB650EH表示轉入重組克隆載體pUCAEH的重組菌的生長情況，LB650/pUC18表示轉入空載體的重組菌的生長情況。結果表明，將含有基因簇的重組載體導入宿主細胞，可以增加宿主細胞對鹽的耐受性。序列表<160〉5<210>1〈211〉1374<212>DNA<213>嗜減菌(J/^of/Zmowosam_y/o/,'ca)〈400〉1atgaaaatcatcattcttggcgcaggacaggtcggcggtaccctggcggaaaatctggtc60ggggaaatgaatgaaatcactgtggtcgacacccatatggagaaactgcggttattgcag120gatcgattcgacttgcaggtgatccatggttacggtgcgcacccggatattttaaaaaaa180gccggcgctgaagatgccgacatgctggttgctgttaccagcagcgatgaagtcaacatc240gttgcgtgtcaggtggcctacagtattttccataccccgcttaaaattgcccgcatccgc300agcaatcagtacctgaaataccgcgatcagctgtttcgccgagaagacatgccggtcgat360cactttattgcgccggaaaccctggttaccgactacatccgccggctgattgattaccct420ggagccttacaggtggtggagtttgcgcagggcaaagtcagcctggtcggtttgcgcgcc■tattatggcggtatgttggttgggcatgcgctgtcgaccttaaaagtgcatatgcccaat540attgatgcccgggttgctgccatttatcgccggggaacctcgatcaaaccattgggaacc600acggtgatcgaagccgacgatgaagtgttttttgtcgctgccaccaagcatatccgggta660gtgatgagcgagctgcaaaagctggaaagcagttaccgccgtattatgattgctggcggc720ggcaatgtcggctatgggctggcaagagcactggaaaacaactacagcgtgaagttgatt780gaacgcagcaaeigagcgggctgagtttctgtccggcgtgctggataataccctggtctat840gtcggggatatctcggatccggagctgctggaagaagaaaatatcgagcaaatcgatgtc900tttattgccgttaccaacgacgatgaagccaatattatgtcggccatgctggctaaacgg960atgggtgcacagaaaaccatcgtgcttatcaaacgtggtgcttatgtcgatttgctgcaa1020ggaggtgaagtcgatatcgcagtttcgccccagcaggctactatctcggcgctgcttacc1080catatccgccgtggcgatattgtcaatgtgcactcgttgcgccgcggcgcagctgaagcc1140atcgaagccatagcccatggcgatgaaaccacctccaaggtagttggccgcgctattggc1200gacattaaactgccaccgggtgctactataggggctattgtaaggggcgatgaagtgatc1260attgcccacgaccatattcccatccaaaccgacgatcacatcatcctgtttttggtggat1320aaaaaacacatcagcgaagtggagaagctgttccaggtcagtgcgatttttatt1374〈210〉2<211>1449〈212〉DNA〈213〉嗜減菌(y4汰a/Zwo"a51a，/o(y"ca)〈400〉2atgcaatatcgctccattatccgtattctggggttactggtcgctgtgttcagcgtcagcGOatgctgccgccagccctggtgtcgctctggtatcaggatggtgccggtgtcccttttctg120ttgtcttttctgatttgtatcgcagctggcttgctgatttggtaccccaaccgcagttat180cagcgcgatctgaaagttcgtgacggctttttgattgtggtgatgttttggctggtgctg240ggggctgtcggtaccttgccgctctacttatcctctgaaacgggcatgaatttggcggat300gccacttttgaggctttctcaggccttaccaccaccggggccaccgttctgaccggcatt360gaaaccctgccgaaagccattttgttttaccgccagcaattgcaatggctgggcggcatg420gggatcatcgttttggcggtagctatcttgccgatgctgggcgtcgggggcatgcagctg■tataaagcggaaaccccgggcccggtcaaagacaacaaagtcacaccgcgcattgccgat540accgccaaacacttgtggttgatttatgtggtgcttaccctggcctgtgccctggcctat600cgtttggcaggtatgaactggtttgatgccgtcggccactccttttccacagttgccatt660ggcggcttttctacctacgatgccagtattggccattttgacagcagcgccataaatatg720atctgcgtggtgttcctgttgctgagcgccatcaattacccactgcactttgccgccatg780cgtggcaaaaatattctgacctactggcgtgaccctgaactgcgggcttttttgtttatt840cagggctccctggtgctgctgatttttatcggtttactgcgtagccaggtgtacgacact900acctgggaggcgtttgatcacggcttgtttcaagcggtgtctatttcaacgactgcgggt960ttcgctacgggcggctttgcctactggcctttgtatctgccgattttgctgattttttcc1020agtttcattggcggctgcgctggctctaccggtggcggtatgaaagttgtgcgggtgUg1080ttgctgtttttgcagggcaagcgtgagctgaaccggttggtgcatccgcgggccatctac1140agcattaagttgggccggcggaccgtgccggatcgggtggtcgaagcagtctggggcttt1200ttcgccgcctatgccttggtgtttgtgattattatgctgctattaattatgaccgggctg1260gataatatgaccgctttctcagcgaccgcagcctgctt犯ataaccttggccccgggctg1320ggtgacgtagcatcgcattttggtgatatccctgatacaagtaaatatttgctggtgatt1380gcgatggtgt.ttggc.cggctggagattttcaccttgctggtgctctttacgccggcgttt1440tggaaaaat1449〈210〉3<211>458<212>PRT<213>嗜減菌(^/Aa/Zwo/myamy/o/j^/ca)<400>3MetLyslielielieLeuGlyAlaGlyGinValGlyGlyThrLeuAla151015GluAsnLeuValGlyGluMetAsnGlulieThrValValAspThrHis202530MetGluLysLeuArgLeuLeuGinAspArgPheAspLeuGinVallie354045HisGlyTyrGlyAlaHisProAsplieLeuLysLysAlaGlyAlaGlu505560AspAlaAspMetLeuValAlaValThrSerSerAspGluValAsnlie65707580ValAlaCysGinValAlaTyrSerliePheHisThrProLeuLyslie859095AlaArglieArgSerAsnGinTyrLeuLysTyrArgAspGinLeuPhe100105110ArgArgGluAspMetProValAspHisPhelieAlaProGluThrLeu115120125ValThrAspTyrlieArgArgLeulieAspTyrProGlyAlaLeuGin130135140ValValGluPheAlaGinGlyLysValSerLeuValGlyLeuArgAla145150155160TyrTyrGlyGlyMetLeuVal165HisMetProAsnlieAspAla180ThrSerlieLysProLeuGly195PheValAlaAlaGlyHisAlaLeuSerThrLeuLysVal170175ArgValAlaAlalieTyrArgArgGlyVal185ThrVallieGluValPhe210LeuGinLysLeuGlu225GlyAsnValGlyThr215SerThr200LysHislieArgSer230GlyLeuAlaTyrArgArgValLysValLeuLeuTyr245GluArgSerLyslie260AsnThrLeuValAsp275GluGluGluAsnArgArgGlu265ValVal220MetArg190AlaAspAspGlu205ValMetSerGlulie235LeuGluAsnAsnAla250ArgAlaGluPhelieAlaGlyGly240TyrSer255SerGlyGlyLeuLeu290ThrAsnAspAspGluAla305310MetGlyAlaGinLysThrTyr280GluGinlielie295AsnlieValLeuAspAsplieSer285PheVal300MetLeuAlaLeu270AspProGlulieAlaValLys325GlyGlyGluVallieMetSerAla315LysArgGlyAlaAspLeuLeuGin340SerAlaLeuLeuAlaThrlie355HisSerLeuArgAsp345Hislie330lieAlaValSerAsnVal370AlaHisGlyAspGlu385Thr360GlyAlaAlaGluPro350AspLysArg320TyrVal335GinGinlieValThr390Arg375ThrSerLysVallieArgArgGly365lieGluAlalieVal395Ala380GlyArgAlalieGly400AsplieLysLeuProProGlyAlaThrlieGlyAlalieValArgGly405410415AspGluVallielieAlaHisAspHislieProlieGinThrAspAsp420425430HislielieLeuPheLeuValAspLysLysHislieSerGluValGlu435440445LysLeuPheGinValSerAlaliePhelie450455<210>4〈211〉483<212>PRT〈213〉啫堿菌(Alkalimonasamylolytica)<400>4MetGinTyrArgSerlielieArglieLeuGlyLeuLeuValAlaVal151015PheSerValSerMetLeuProProAlaLeuValSerLeuTrpTyrGin202530AspGlyAlaGlyValProPheLeuLeuSerPheLeulieCyslieAla354045AlaGlyLeuLeulieTrpTyrProAsnArgSerTyrGinArgAspLeu505560LysValArgAspGlyPheLeulieValValMetPheTrpLeuValLeu65707580GlyAlaValGlyThrLeuProLeuTyrLeuSerSerGluThrGlyMet859095AsnLeuAlaAspAlaThrPheGluAlaPheSerGlyLeuThrThrThr100105110GlyAlaThrValLeuThrGlylieGluThrLeuProLysAlalieLeu115ArgGinGinLeuPheTyr130LeuAlaValAlalie145TyrLysAlaGluThr165ThrArglieAlaAsp180CysAlaLeuAla120GinTrpLeu135ProMetLeuGlyProValLysLeu150ProAlaLysHisGlyGlyLys170TrpGlyVal155AspMet140GlyThrLeuAla195ValGlyHisSerLeu185ArgLeuAlaGlyAspAla210ThrTyrAspAlaSer225lieCysValVal丁yr200SerThrValAlaPhe215GlyHisPheAsplie230LeuLeuLeuSerPhe245ArgGlyLysAsnSer235lieAsnPheAlaAlaMet260AlaPheLeuPheGluLeuArg275GlyLeuLeuArgPhelie290PheAsp305PheAlalie280Ginlie265GinValHisThrGlyGlyLeuPhe310PheSer295GinAlaValSerAla250LeuThrTyrGlySerLeu丁yrGlyPheAlaTyrTrp325SerPhelieGlySerLeuliePheSer340GlyMetLysValValArgValLeuLeuLeuPheLeuGinGlyLysArgGly345LeuPro330CysAsplie315LeuAla125GlylielieValGlyAsnLysLeulieTyrMet205GlyMetValVal190AsnGlylie220SerAlalieTyrTrpProGinLeu160ThrPro175ValLeuTrpPhePheSerAsnMet240LeuHis255AspPro270LeuLeulieVal285ThrTrpGluAlaThr300SerThrThrTyrGlyAlaGly320LeuProlieLeu335GlyGlyThr350Gly355GluLeuAsnArgLeuVal370GlyArgArgThrValPro385390PheAlaAlaTyrAlaLeu405MetThrGlyLeuAspAsn420LeuAsnAsnLeuGlyPro435AsplieProAspThrSer450GlyArgLeuGluliePhe465470TrpLysAsn〈210>5<211〉4634〈212〉醒<213〉人工序列〈400〉5tgcggccaagtcggtgccgatttcagccgagcgtcgcatgctgcatgtgctgccacagga60attttcggtggatatgcaagaaggtattaaaagcccggtcggcatgtccggggtgaggat120ggaagcccgggcgcacattattacctgcgccaatgacatggccaaaaacattgaaaaatg180tgccgagcgctgtggtttgaaagtcgatcctgcaagctacgccagccatattcaggtttt240gcaacagcgaacccgccagttactggagcgggaaaatctggacgggttggtgattcactc300cggccagaccaagcgcaaattccttgatgacatggattatccctttaaagccaacccgca360ctttaaggcctggctgccggtggtggataacccgcactgctggctgcagatagatggtgt420taataaaccgaaactgattttttaccggccaaaagatttctggcacaaggtgccggatgt480accgggcgatttttgggccgagcattttgatattcaactattggaaaaagccaaccaggt540agagcagttgctgccctatgacaaagagcggctggcctatcttggtgaatacctggaagt600tgcccaggcgctcggttttagcgacattaatccggagccggtgctgaacftcctgcatta660Gly360ProArgAlalieHis375AspArgValValValPheVallie410MetThrAlaPhe425GlyAsp365TyrSer380AlaVallieLysLeuGlu395lieMetLeuLeu440TyrTrpGlyPhe400LeuLeulie415SerAlaThrAlaAlaCys430ValAlaSerHisPheGlyLys455Thrl>euLeuValAlaSer445LeuLeuVallieAlaMetValPhe460PheThrLeu475ProAlaPhe480tcaccgggcttacaaaaccgagtacgagctgcagtgtctgcgccgggccaatcgcatggc720ggtggctggccataaagctgccaaagcggcattttatggcggtggcagtgagtttgatat780tcagctggcctacctggctgcagttggtcaaaccgaaaacgaggtgccttatggcaacat840cgtggcgctgaaccagcactgcgctatcttgcattacacggcgctggagcggcagaaacc900ggcacagcatcgcagttttctgatcgatgccggggctgagtttcatggctatgctgccga960cattacccgcagctacagttttgatagcggccacgagtttgctgagctgatcaagcgggt1020ggatgccattacgctgcagatggtcgatggtctgaagcctggcatcaagtacagcgaatt1080gcatttgcaaacgcaccaactgattgccgaagtgctggctgattttgactttgtccgcct1140gggcgccgaagccatggtggagcaacagatcacccaggcctttttcccgcatggccttgg1200gcatcaccttggcttgcaggtgcacgatgtcggtggctttatgctggatgagcgtggtac1260ccatttaccgccgcctgagcagcatccgtttctgcgctgcacccgcttcattgaaccgtc1320catggtttataccattgaacctggtctgtactttatcgactccttactggatgaactgcc1380tgatgcgcagaaaaaactgctaaactgggataaaattcaggcatttaagccttttggtgg1440catccggatcgaagacaacgtcatcgtgcaccgggagcgcaatgaaaatatgaccagaga1500gctgcagctggattaaccagccggcagccgtctggcacagggccagttcggggaactatg1560caatatcgctccattatccgtattctggggttactggtcgctgtgttcagcgtcagcatg1620ctgccgccagccctggtgtcgctctggtatcaggatggtgccggtgtcccttttctgttg1680tcttttctgatttgtatcgcagctggcttgctgatttggtaccccaaccgcagttatcag1740cgcgatctgaaagttcgtgacggctttttgattgtggtgatgttttggctggtgctgggg1800gctgtcggtaccttgccgctctacttatcctctgaaacgggcatgaatttggcggatgcc1860acttttgaggctttctcaggccttaccaccaccggggccaccgttctgaccggcattgaa1920accctgccgaaagccattttgttttaccgccagcaattgcaatggctgggcggcatgggg1980atcatcgttttggcggtagctatcttgccgatgctgggcgtcgggggcatgcagctgtat2040aaagcggaaaccccgggcccggtcaaagacaacaaagtcacaccgcgcattgccgatacc2100gccaaacacttgtggttgatttatgtggtgcttaccctggcctgtgccctggcctatcgt2160ttggcaggtatgaactggtttgatgccgtcggccactccttttccacagttgccattggc2220ggcttttctacctacgatgccagtattggccattttgacagcagcgccataaatatgatc2280tgcgtggtgttcctgttgctgagcgccatcaattacccactgcactttgccgccatgcgt2340ggcaaaaatattctgacctactggcgtgaccctgaactgcgggcttttttgtttattcag2400ggctccctggtgctgctgatttttatcggtttactgcgtagccaggtgtacgacactacc2460tgggaggcgtttgatcacggcttgtttcaagcggtgtctatttcaacgactgcgggtttc2520gctacgggcggctttgcctactggcctttgtatctgccgattttgctgattttttccagt2580ttcattggcggctgcgctggctctaccggtggcggtatgaaagttgtgcgggtgttgttg2640ctgtttttgcagggcaagcgtgagctgaaccggttggtgcatccgcgggccatctacagc2700attaagttgggccggcggaccgtgccggatcgggtggtcgaagcagtctggggctttttc2760gccgcctatgccttggtgtttgtgattattatgctgctattaattatgaccgggctggat2820aatatgaccgctttctcagcgaccgcagcctgcttaaataaccttggccccgggctgggt2880gacgtagcatcgcattttggtgatatccctgatacaagtaaatatttgctggtgattgcg2940atggtgtttggccggctggagattttcaccttgctggtgctctttacgccggcgttttgg3000aaaaattaaataaaaatcgcactgacctggaacagcttctccacttcgctgatgtgtttt3060ttatccaccaaaaacaggatgatgtgatcgtcggtttggatgggaatatggtcgtgggca3120atgatcacttcatcgccccttacaatagcccctatagtagcacccggtggcagtttaatg3180tcgccaatagcgcggccaactaccttggaggtggtttcatcgccatgggctatggcttcg3240atggcttcagctgcgccgcggcgcaacgagtgcacattgacaatatcgccacggcggata3300tgggtaagcagcgccgagatagtagcctgctggggcgaaactgcgatatcgacttcacct3360ccttgcagcaaatcgacataagcaccacgtttgataagcacgatggttttctgtgcaccc3420atccgtttagccagcatggccgacataatattggcttcatcgtcgttggtaacggcaata3480aagacatcgatttgctcgatattttcttcttccagcagctccggatccgagatatccccg3540acatagaccagggtattatccagcacgccggacagaaactcagcccgctctttgctgcgt3600tcaatcaacttcacgctgtagttgttttccagtgctcttgccagcccatagccgacattg3660ccgccgccagcaatcataatacggcggtaactgctttccagcttttgcagctcgctcatc3720actacccggata/tgcttggtggcagcgacaaaeiaacEicttcatcgtcggcttcgatcacc3780gtggttcccaatggtttgatcgaggttccccggcgataaatggcagcaacccgggcatca3840atattgggcatatgcacttttaaggtcgacagcgcatgcccaaccaacataccgccataa3900taggcgcgcaaaccgaccaggctgactttgccctgcgcaaactccaccacctgtaaggct3960ccagggtaatcaatcagccggcggatgtagtcggtaaccagggtttccggcgcaataaag4020tgatcgaccggcatgtcttctcggcgaaacagctgatcgcggtatttcaggtactgattg4080ctgcggatgcgggcaattttaagcggggtatggaaaatactgtaggccacctgacacgca4140acgatgttgacttcatcgctgctggtaacagcaaccagcatgtcggcatcttcagcgccg4200gctttttttaaaatatccgggtgcgcaccgtaaccatggatcacctgcaagtcgaatcga4260tcctgcaataaccgcagtttctccatatgggtgtcgaccacagtgatttcattcatttcc4320ccgaccagattttccgccagggtaccgccgacctgtcctgcgccaagaatgatgattttc4380atgaagtttgttctgcctcaagccgtttaatcactttagcatagaaaaagccatccatct4440gctgctggcctggcaggatttgccagctgttggcatgctgctggctggactgcagttcgg4500catccggggtttgttgtaaaaaacgctgcaattgttgttgeittttcggcgctgaacacgc4560tgcaggttgcata犯gcaagatgccgcctggtttgagcagaggccagagctgctggagca4620tacgcgcctggatg463權利要求1、一種鉀離子轉運相關蛋白系統，是由如下(a)和(b)兩種蛋白質組成的(a)其氨基酸序列為序列表中的序列3，或將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與鉀離子轉運相關的由序列3的蛋白質衍生的蛋白質；(b)其氨基酸序列為序列表中的序列4，或將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與鉀離子轉運相關的由序列4的蛋白質衍生的蛋白質。2、編碼權利要求l所述蛋白系統的基因簇。3、根據權利要求2所述的基因簇，其特征在于所述基因簇為如下l)一3)中任一所述的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列5;2)在嚴格條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交且編碼鉀離子轉運相關蛋白系統的DNA分子；3)與1)的基因具有90%以上的同源性，且編碼鉀離子轉運相關蛋白系統的DNA分子。4、含有權利要求2或3所述基因簇的重組載體。5、根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pUC18中插入權利要求2或3所述基因簇得到的重組載體。6、含有權利要求2或3所述基因簇的轉基因細胞系。7、含有權利要求2或3所述基因簇的重組菌。8、擴增權利要求2或3所述基因簇的全長或其任一片段的引物對。9、一種培育鉀離子轉運能力提高的轉基因生物的方法，是將權利要求2或3所述的基因簇轉入生物中，得到鉀離子轉運能力提高的轉基因生物。10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述的基因簇是通過權利要求4所述的重組載體導入生物中。全文摘要本發明公開了一種鉀離子轉運相關蛋白系統及其編碼基因簇與應用。該系統是由如下(a)和(b)兩種蛋白質組成的(a)其氨基酸序列為序列表中的序列3，或將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與鉀離子轉運相關的由序列3的蛋白質衍生的蛋白質；(b)其氨基酸序列為序列表中的序列4，或將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與鉀離子轉運相關的由序列4的蛋白質衍生的蛋白質。實驗證明，轉入上述基因簇TrkAH的大腸桿菌可以在K⁺濃度為0.1mM、pH8.0的堿性環境中生長良好，而轉入空載體的大腸桿菌在此培養條件下不能生長。文檔編號C12N15/11GK101343316SQ20081011939公開日2009年1月14日申請日期2008年9月5日優先權日2008年9月5日發明者薛燕芬,郭永豪,馬延和申請人:中國科學院微生物研究所