專利名稱：：肺炎克雷伯菌對β-內酰胺酶耐藥基因檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種基因檢測方法，尤其是涉及一種肺炎克雷伯菌對0-內酰胺酶耐藥基因檢測方法。
背景技術：
：抗菌藥物發展的歷史，是一部人類與細菌做斗爭的歷史。人類不斷研制開發新藥，細菌則通過改變自已的結構來與抗菌藥物相對抗。抗菌藥物的濫用致使耐藥菌比例越來越大，耐藥程度越來越高，新藥研制的速度已遠遠不及細菌耐藥性產生的速度。抗菌藥物濫用是世界范圍內存在的問題，我國尤為嚴重。據統計，我國住院病人中使用抗菌藥物的比例占住院病人的60%-70%，在美國僅為20%。抗菌藥物的濫用直接導致了耐藥菌逐年增多，院內感染發生率不斷上升。如果不加強規范、合理用藥，一旦出現耐藥菌感染性疾病爆發流行，將會出現無藥可治的尷熗局面。因此，研究細菌耐藥機制及其規律就顯得十分緊迫和必要。肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界、健康人的皮膚、腸道和呼吸道。正常情況下，肺炎克雷伯菌并不感染人體的任何組織。老年病人免疫力低下，長期大量使用抗菌藥物或創傷性醫療操作(如氣管切開、尿道插管和腎透析等)等情況下易引起內源性感染。肺炎克雷伯菌所致感染中以呼吸道感染、泌尿道感染、菌血癥等最為常見。肺炎克雷伯菌在臨床標本的分離率為8.0%，其耐藥率為6.1%-85.7%。近年來，從臨床分離到的肺炎克雷伯菌可耐受多類抗菌藥物包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、氟喹諾衝類、氯霉素、磺胺類藥物等，出現了多重耐藥菌株。為此，針對肺炎克雷伯菌分子耐藥機制與感染關系進行深入研究，對了解本地區肺炎克雷伯菌的耐藥基因流行狀況、指導臨床合理使用抗菌藥物、研發新藥的導向等具有重要意義。
發明內容為解決上述技術問題，本發明提供了一種肺炎克雷伯菌對0-內酰胺酶耐藥基因檢測方法，旨在應用現代分子生物學技術和現代信息技術進行細菌耐藥機制和耐藥的相關基因研究，揭示肺炎克雷伯菌對0內酰胺類抗菌藥物產生耐藥原因，達到快速診斷細菌的耐藥性的目的，明確本地區肺炎克雷伯菌耐藥基因流行狀況，為指導臨床研究合理使用抗菌藥物提供依據。本發明為實現上述目的采取的技術方案如下，一種肺炎克雷伯菌對0-內酰胺酶耐藥基因檢測方法，包括以下步驟-1、選擇住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株經細菌鑒定儀鑒定菌種后采樣備用。2、采用微^#釋^*測定抗菌藥物的敏感性，進行抗生素敏感性判斷。3、采用PCR法檢測耐藥基因，檢查P-內酰胺酶耐藥基因并選取DM陽性株測序分析。①、模板制備挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶說明書第3/9頁液200u1),56't水浴2小時，改95flC水浴10分鐘，加入Chelex-100幼iil，離心G5000rpm)30秒。上清液即為基因檢測的模板液，-208C冰箱保存備用。②、基因的檢測采用聚合酶鏈反應(PCR)法，各種靶基因PCK擴增體系均為每反應體系P,、P2引物各0，5iiM，dNTPs200各mM，KC1lOmM，(MU2S048mM，MgCl22mM，Tris—HC1(pH9.0)l薩，NP0.5%，BSA0.02%(wt/vo1)，TaqD則pol1U。總反應體積20li1(其中模板液5ul)。PCR擴增產物〉500bp熱循環參數均為93。C預變性2niin，然后93。C60s—55。C60s—72°C60s，循環35周期，最后一個72""C延長至5min。PCR擴增產物<500bp熱循環參數均為93。C預變性2邁in，然后93'C30s—55。C30s—72"60s，循環35周期，最后一個72'C延長至5min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性。優選地，選擇以下P-內酰胺酶耐藥基因TM、SHV、LM、OKP、CTX普1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、0XA-1群、0XA-2群、0XA-10群、PER、GES、VEB、DHA、ACT-1進行耐藥性分析，相應的引物序列為Pl:AGGMGAGTATGATTCMCAP2:CTCGTCGTTTGGTATGGCPl:TGCGCMGCTGCTGACCAGCP2:TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAPl:ATGCGTT(A/T)T(A/G)TTCGCCTGTGP2:GGCGCTCAGATGCTGCGCPl:A(A/G)GCGCTTCCCGGCGACGTGP2:TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAPl:ATGGTTAAMMTCACTGCGCP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTTPl:ATGATGACTCAGAGCATTCGP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTT<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本發明的有益效果如下本發明選用目前較常見的醫院感染^~~肺炎克雷伯菌為研究對象，運用聚合酶鏈反應(PCR)和DNA測序技術和基因序列比對等現代分子生物學和信息技術，系統全面的對肺炎克雷伯菌的耐藥機制進行了研究，發現導致肺炎克雷伯菌耐P內酰胺類藥物的耐藥基因，對指導臨床合理使用抗菌藥物具有重要價值，可減少醫院院內感染率，降低死亡率，節約社會醫療資源。成果具有良好的社會和經濟效益，推廣應用前景廣泛。以下結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步說明。圖1為本發明WaTEM基因PCR電泳圖；[M:分子量標記，由上而下分別為1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp，P:陽性對照,N:陰性對照，S:標本陽性]圖2為本發明W^CTX-M-l群基因PCR電泳圖；[M:分子量標記，由上而下分別為1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp，P:陽性對照，N:陰性對照，S.'標本陽性]圖3為本發明力7aDHA基因PCR電泳圖；[M:分子量標記，由上而下分別為1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp，P:陽性對照，N:陰性對照,S:標本陽性]圖4為本發明WaCTX-M-15型基因測序圖；圖5為本發明WaSHV型基因測序圖。具體實施方式1材料與方法1.1菌株來源及鑒定80株均為分離自2006年1月2007年10月間患者臨床標本，分別為痰液53份，尿液8份，膽汁4份，膿液5份，弓疏液4份，血液3份，咽拭子3份。全部菌株均使用ATB細菌鑒定{^鑒定菌種后采樣備用o1.2抗菌藥物敏感性試驗藥敏試驗按美國CLSI2006年版要求。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603銅綠假單胞菌ATCC27853、購自衛生部臨床檢驗中心。1.3藥敏試驗抗菌藥物敏感試驗微量肉湯稀釋法。1.4P內酰胺酶基因檢測1.4.1模板制備挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶液200iil)，56t水浴2小時，改95t水浴10分鐘，加入Cheiex-lOO40ul，離心(15000rpm)30秒。上清液即為基因檢測的模板液，-20°C冰箱保存備用。1.4.2基因的檢測采用聚合酶鏈反應(PCR)法，其中引物序列見表1。各種靶基因PCR擴增體系均為每反應體系P，、P2引物各0.5iiM，dNTPs200各mM，KC110mM，(鵬)25048爐，MgCL2mM，Tris—HC1(pH9.0)10mM，NFVO.5%，BSA0.02%(wt/vol)，TaqDMpol1U。總反應體積20u1(其中模板液5ii1)。PCR擴增產物〉500bp熱循環參數均為93。C預變性2min，然后93'C60s—55'C60s—72。C60s，循環35周期，最后一個721C延長至5min。PCR擴增產物〈500bp熱循環參數均為93""C預變性2min，然后93'C30s—55lC30s—72"C60s，循環35周期，最后一個72*€延長至5min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性。表l:PCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2結果2.1抗菌藥物的敏感性80株分離自老年病人產e-內酰胺酶的KPN菌抗菌藥物的敏感性見表2。表2抗菌藥物的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2P內酰胺酶基因檢測結果80株分離自老年病人產P-內酰胺酶的KPN菌檢出力7aTEM、WaSHV、WaCTX-M-1群、WaCTX-M-9群、WaOXA-1群、WaDHA等6種P-內酰胺酶基因，陽性率分別為95%(76/80)、3096(24/80)、51.3%(41/80)、5%(4/80)、5%(4/80)、13.8%(ll/80)。80株菌中有76株至少檢出1種P-內酰胺酶基因，58株同時檢出2種以上3-內酰胺酶基因，最多同時檢出4種0-內酰胺酶基因，只有4株沒有檢出e-內酰胺酶基因。WaTEM基因PCR電泳圖見圖1，WaCTX-M-1群基因PCR電泳圖見圖2，W必HA基因PCR電泳圖見圖3，2號株ZJaCTX-M-l群PCR陽性產物經DM測序和上網(www.ncbi.nlnLnih.gov/BUSTn)比對為WaCTX-M-15型(與己登錄的型序列完全一致)，圖4為CTX-M-15型測序圖；2號株W必HVPCR陽性產物經DM測序和上網比對與WaSHV-28型、力7aSHV-43型同一群，圖5為WaSHV測序圖，2號株WaSHV序列與已在美國NCBI登錄的WaSHV序列分子進化圖。結論80株KPN菌P內酰胺類抗菌藥物耐藥與產e-內酰胺酶密切相關。80株肺炎克雷伯菌中，有76株至少檢測1種P內酰胺酶基因，58株同時檢測2種以上P內酰胺酶基因，最多同時檢測4種&內酰胺酶基因。檢測到TEM基因的陽性率為959&,SHV基因為3(W6，CTX"M-1群基因為51.3%和OXA-l群基因為5%等，TEM基因是肺炎克雷伯菌最常見的P-內酰胺酶基因，介導對氨芐西林、青霉素、頭孢他定和頭孢噻吩等的耐藥性，此耐藥性通過細菌質粒進行傳遞。CTX-MP-內酰胺酶能高度水解頭孢吡肟、頭霉素等抗菌藥物，檢測到CTX-M型基因代表對頭孢吡訴、頭霉素類藥物耐藥。肺炎克雷伯菌SHV基因可介導氨芐西林耐藥，本研究結果耐藥表型與0內酰胺酶基因檢測狀況相符。OXA型e內酰胺酶可水解苯唑西林，檢測到此類酶基因顯示細菌對苯唑西林、氨芐西林耐藥。權利要求1、一種肺炎克雷伯菌對β-內酰胺酶耐藥基因檢測方法，包括以下步驟(1)、選擇住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株經細菌鑒定儀鑒定菌種后采樣備用，(2)、采用微量稀釋法測定抗菌藥物的敏感性，進行抗生素敏感性判斷，(3)、采用PCR法檢測β-內酰胺酶耐藥基因，并選取DNA陽性株進行測序分析，所述β-內酰胺酶耐藥基因及相應引物序列為基因名稱引物序列blaTEMP1AGGAAGAGTATGATTCAACAP2CTCGTCGTTTGGTATGGCblaSHVP1TGCGCAAGCTGCTGACCAGCP2TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAblaLENP1ATGCGTT(A/T)T(A/G)TTCGCCTGTGP2GGCGCTCAGATGCTGCGCblaOKPP1A(A/G)GCGCTTCCCGGCGACGTGP2TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAblaCTX-M-1群P1ATGGTTAAAAAATCACTGCGCP2TCCCGACGGCTTTCCGCCTTblaCTX-M-2群P1ATGATGACTCAGAGCATTCGP2TCCCGACGGCTTTCCGCCTTblaCTX-M-9群P1CGGCCTGTATTTCGCTGTTGP2TCCCGACGGCTTTCCGCCTTblaOXA-1群P1CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAGP2CTTGGCTTTTATGCTTGATGblaOXA-2群P1CAGGCGC(T/C)GTTCG(T/C)GATGAGTTP2GCC(T/C)TCTATCCAGTAATCGCCblaOXA-10群P1GTCTTTC(A/G)AGTACGGCATTAP2GATTTTCTTAGCGGCAACTTAblaPERP1AGTCAGCGGCTTAGATAP2CGTATGAAAAGGACAATCblaGESP1ATGCGCTTCATTCACGCACP2CTATTTGTCCGTGCTCAGGblaVEBP1GCGGTAATTTAACCAGAP2GCCTATGAGCCAGTGTTblaDHAP1AACTTTCACAGGTGTGCTGGGTP2CCGTACGCATACTGGCTTTGCblaACT-1P1TCGGTAAAGCCGATGTTGCGGP2CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT2、如權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌對P-內酰胺酶耐藥基因檢測方法，其特征在于所述的基因的檢測中，各靶基因PCR擴增體系均為每反應體系P，、P2引物各0.5uM,dNTPs200各mM，KC110mM，(MU2S048mM，MgCl22mM，Tris-HCIpH9.010mM，NP4O0.5%，BSA0.02%wt/vol，TaqDMpol1U，總反應體積20ul，PCR擴增產物〉500bp熱循環參數均為93'C預變性2min，然后WC60s—55°C60s—72°C60s，循環35周期，最后一個721C延長至5min，PCR擴增產物〈500bp熱循環參數均為93'C預變性2min，然后93°C30s—55X:30s—72"C60s,循環35周期，最后一個72。C延長至5min,產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性。全文摘要本發明公開了一種肺炎克雷伯菌對β-內酰胺酶耐藥基因檢測方法，屬于基因檢測方法
技術領域：
，包括以下步驟1.選擇住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株經細菌鑒定儀鑒定菌種后采樣備用；2.采用微量稀釋法測定抗菌藥物的敏感性，進行抗生素敏感性判斷；3.采用PCR法檢測耐藥基因，檢查β-內酰胺酶耐藥基因并選取DNA陽性株測序分析。本發明通過系統全面的對肺炎克雷伯菌的耐藥機制進行了研究，發現導致肺炎克雷伯菌耐β內酰胺類藥物的耐藥基因，對指導臨床合理使用抗菌藥物具有重要價值，可減少醫院院內感染率，降低死亡率，節約社會醫療資源，具有良好的社會和經濟效益。文檔編號C12Q1/68GK101519688SQ20081012112公開日2009年9月2日申請日期2008年9月28日優先權日2008年9月28日發明者孫小軍,李水法,王華均,金法祥,鐘建平,黃明清申請人:鐘建平