專利名稱：一種香菇香九菌種的分子特異性標記引物及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種香菇香九菌種的分子特異性標記引物，以及利用該引
物對香菇香九菌種進行鑒別和^r測的方法。
(二)
背景技術：
香菇因其美味和具有重要的食、藥用價值而倍受國內外消費者的喜 愛，是我國商業化生產規模最大和世界上產量僅次于雙孢蘑菇的食用菌。 我國是世界人工栽培香菇的發源地和香菇產量最大的國家，有著豐富的香 菇種質資源。菌種是香菇生產的前提，直接影響著香菇的產量和品質。由 于我國食用菌菌種鑒定與檢測技術研究的落后和菌種行政管理機構與法 規的不健全，存在菌種"多、雜、亂、散"的狀況，"異種同名、同種異名" 現象普遍存在，因此，建立科學、可靠、快速、簡便的菌種鑒定體系極為 重要。
分子生物學技術的快速發展,特別是分子標記和基因標記技術的建立 與成熟，為發展筒便、快速、準確的菌林鑒定技術提供了有效手段。SCAR (特征性片段擴增區域)標記是1993年由Paran和Michelmore在RAPD 基礎上提出的，它基于對特異RAPD片段的測序，根據兩端序列設計一 對18 24堿基的引物，在較高的退火溫度下進行特異擴增實現的，其專 一性引物的采用排除了隨機引物結合位點之間的竟爭，因而它是一種十分 穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點。
(三)
發明內容
本發明目的是提供一種香菇香九菌種的分子特異性標記引物，以及一
種利用該引物對香菇香九菌種進行快速鑒定的方法。
本發明采用的技術方案是
一種香菇香九菌種的分子特異性標記引物，所述引物序列為
上游引物5'隱AGGCAGGCCCATCATTTC國3'
下游引物5'-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG國3'。
該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試-瞼，采用RAPD標記為 引物獲得香菇香九菌種的特異性DNA片段，將該片段克隆測序，以得到 DNA序列為基礎，所設計的特異性引物，以該引物對香菇香九菌種進行 PCR擴增，可獲得582bp大小的特異性片^:。
本發明還涉及一種對香菇香九菌種進行鑒定和檢測的方法，所述方法 為提取待測香菇菌種基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記引 物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結 果出現582bp的DNA條帶，則待測菌種為香菇香九菌種；所述分子特異 性標記引物序列為
上游引物5 '-AGGCAGGCCCATCATTTC畫3'
下游引物5 '-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3'。
所述方法關鍵在于擴增引物的選擇，DNA提取、PCR反應體系及反 應條件確定，以及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
優選的，本發明所述PCR反應體系組成如下
PCR Buffer 終濃度為1 x
dNTPs lmmol/L
MgCl2 2.5mmol/L
Taq DNA酶 2.5U
上、下游引物 各1.25juM 模板DNA 60ng 余量為ddH20; PCR反應條件如下
94。C預變性6min后；92。C變性40s, 38。C退火40s， 72。C延伸2min， 共30個循環；最后于72。C補平7min,終止溫度為4°C。
PCR Buffer終濃度為1 x ,是指PCR Buffer中各組分在反應體系中的 濃度與1 x PCR Buffer相同，通常選用體積為反應體系體積1/10的10 x PCRBuffer。 lOxPCR Buffer成分為100 mM Tris-HCl (pH8.5 )、 500 mM KCl、 25 mMMgCl2和1.0%Triton-X-100，溶劑為ddH20。
具體的，本發明所述方法如下
(1) 取待測香菇菌種，接種至PDA斜面，25。C培養14d，轉接至PD 液體培養基中，25。C下振蕩培養14d,收集菌絲，以SDS-CTAB 法提取待測香菇菌種基因組DNA;
(2) 以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標 記引物作為擴增引物，進行PCR擴增
PCR反應體系每20 |i L組成如下
10 x PCRBuffer 2|aL
lOmmol/LdNTPs 2|uL
25mmol/L MgCl2 2 ji L
5U/ ji L Taq DNA酶 0.5 ju L
25liM上、下游引物 各1 jaL 20ng/ ju L模板DNA 3 " LddH20補足至20 juL; PCR反應條件如下
94。C預變性6min后；92。C變性40s, 38。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30個循環；最后于72。C補平7min,終止溫度為4°C;
(3)取步驟(2)擴增產物5juL,與1 juL0.25。/。溴酚蘭緩沖液混勻， 點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1 xTAB緩沖液中、5V/cm電 壓下電泳，電泳結束后EB染色，EB染色通常在含0.5嗎/ml EB 的水溶液中染色30分鐘。于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電 泳結果出現582bp的DNA條帶，則待測菌種為香菇香九菌種。
本發明有益效果主要體現在本發明檢測方法與常規形態學檢測、拮 抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優點；本發明方法 檢測所需時間只要1~3天，而常規的拮抗試驗所需要的時間至少兩周時 間，出菇試驗則需要至少3個月的時間。
(四)
圖l為對香菇菌種進行PCR擴增的結果；M: Marker,即DNA分子量 標準；CK:陰性對照；1:申香2號；2:申香4號3:申香6號；4:申 香9號；5:申香7號；6:申香8號；7:申香10號；8:申香12; 9: 蘇香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:慶科20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:閩豐1號；20:滬農1號；21: 浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九；箭頭所指為編號為23的香菇香 九菌林擴增出的分子量為582bp的特殊DNA條帶。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍
并不僅限于此 實施例1:
(1 )菌絲培養和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇菌種轉接 到PDA斜面(PDA斜面培養基取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水 1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液加水補足至1000毫升， 加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，121。C滅菌30分鐘，冷卻得斜 面)上，25。C下培養。14d后接到100mlPD液體培養基(PD液體培養基 取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴 薯塊，將濾液加水補足至1000毫升，加葡萄糖20克，121。C滅菌30分鐘， 冷卻即得PD液體培養基)中，25。C下100r/min振蕩培養14d,收集菌絲， 放入-2(TC水箱保藏備用。基因組DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使 用DNA純化試劑盒(杭州博日科技有限公司)對提取的DNA進行純化。 純化的基因組DNA先用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳定性#:測，再用 DNA/RNA紫外分光光度計定量檢觀'J。DNA提取物于-20。C冰箱貝i藏備用。
(2) 設計特異PCR擴增引物，引物對的序列為上游引物5'-AGGCAGGCCCATCATTTC-3' 和 下 游 引 物 5'匿
TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3',由上海生物工程技術有限公司合成。
(3) SCAR分子標記的PCR擴增10xPCRBuffer2[xl， 1Ommol/L dNTPs2pl， 25mmol/LMgCl22pl, 5U/nl Taq DNA酶0.5nl， 25mM特異引 物對各l[il, 20ng4il模板DNA3ia1, ddH20補足至20(al。擴增反應在TC-XP 型擴增儀上進行。94。C預變性6min后；92。C變性40s， 38。C退火40s， 72°C 延伸2min，共30個循環；最后于72。C補平7min,終止溫度為4。C。
(4) 電泳檢測取步驟(3) PCR擴增產物5ul，與lul 0.25%溴酚
蘭緩沖液混勻，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于lxTAB緩沖液中，5V/cm 電壓下電泳，電泳結束后，在含0.5pg/ml EB的水溶液中染色30分鐘， 然后在培清JS-380A自動凝膠圖像分析儀上照相。
按照上述方法，分別對多種香菇菌種(編號1 23代表香菇菌種依次 為1:申香2號；2:申香4號3:申香6號；4:申香9號；5:申香7 號；6:申香8號；7:申香10號；8:申香12; 9:蘇香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:慶科20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:閩豐1號；20:滬農1號；21:浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九)進行^r測，以無菌水為陰性對照，電泳結果見圖1。其中編號 23為香菇香九菌種，擴增出了分子量為582bp的特殊DNA條帶，其余編 號為其他常用的香菇生產菌種也擴增出了相應的DNA條帶，但分子量約 為750bp。 序列表—ST25
SEQUENCE LISTING <110>浙江省林業科學研究院
<120> —種香菇香九菌種的分子特異性標記引物及檢測方法
<130〉
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3.4
<210〉 1
〈211> 18
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列 〈400〉 1
aggcaggccc atcatttc 18
<210〉 2
<211〉 20
<212> 睡
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列
<400> 2
ttgcaggcag cagtagaatg 20
權利要求
1.香菇香九菌種的分子特異性標記引物，所述引物序列為上游引物5′-AGGCAGGCCCATCATTTC-3′下游引物5′-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3′。
2. —種用如權利要1所述的分子特異性標記引物對香菇香九菌種進行鑒 定和檢測的方法，所述方法為提取待測香菇菌種基因組DNA作為模 板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴 增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現582bp的DNA條帶，則待測菌 種為香菇香九菌種；所述分子特異性標記引物序列為上游引物5'-AGGCAGGCCCATCATTTC-3' 下游引物5'-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3'。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反應體系組成如下 PCR Buffer 終濃度為1 xdNTPs lmmol/L MgCl2 2.5mmol/L Taq DNA酶 2.5U 上、下游引物 各1.25jaM 模板DNA 60ng 余量為ddH20; PCR反應條件如下94。C預變性6min后；92。C變性40s, 38。C退火40s， 72。C延伸2min, 共30個循環；最后于72。C補平7min，終止溫度為4°C。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )取待測香菇菌種，接種至PDA斜面，25。C培養14d,轉接至PD 液體培養基中，25。C下振蕩培養14d，收集菌絲，以SDS-CTAB 法提取待測香菇菌種基因組DNA;(2 )以步驟(1 )提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增 10 xpCR Buffer 2juL 10mmol/LdNTPs 2juL 25mmol/L MgCl2 2 ju L5U/ ju L Taq DNA酶 0.5 ju L 25jaM上、下游引物 各1juL 20ng/ ju L模板DNA 3 ju LddH20補足至20 ja L; PCR反應條件如下94。C預變性6min后；92。C變性40s, 38。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30個循環；最后于72。C補平7min,終止溫度為4°C;(3 )取步驟(2 )擴增產物5 ja L,與1 ji L 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻， 點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1 xTAB緩沖液中、5V/cm電壓 下電泳，電泳結束后用EB染色，于自動凝膠圖像分析儀上照相， 若電泳結果出現582bp的DNA條帶，則待測菌種為香菇香九菌 種。
5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于所述EB染色為在含0.5(ag/ml EB 的水溶液中染色30分鐘。
全文摘要
本發明提供了一種香菇香九菌種的分子特異性標記引物，以及利用該引物對香菇香九菌種進行鑒別和檢測的方法。所述引物序列為上游引物5′-AGGCAGGCCCATCATTTC-3′，下游引物5′-TTGCAGGCA GCAGTAGAATG-3′。本發明有益效果主要體現在本發明檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優點；本發明方法檢測所需時間只要1～3天，而常規的拮抗試驗所需要的時間至少兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間。
文檔編號C12Q1/68GK101358239SQ200810120568
公開日2009年2月4日 申請日期2008年8月25日 優先權日2008年8月25日
發明者付立忠, 吳學謙, 吳慶其, 李海波, 程俊文, 亮 賀, 魏海龍 申請人:浙江省林業科學研究院