一種重組雞α干擾素基因及其重組載體的制作方法

專利名稱：：一種重組雞α干擾素基因及其重組載體的制作方法
技術領域：
：本發明一種重組雞a干擾素的基因序列及其重組載體，屬于基因工程生物制品領域的產品。與天然的雞a干擾素相比，有更強的抗病毒活性，可針對性的用于雞的各種病毒性疾病的防制和早期治療。二
背景技術：
：雞a干擾素(Interferonalpha,IFN-a)是一類具有抗病毒、抗腫瘤、抗增殖作用等功能(OritaniK,MedinaKL,TomiyamaYa/.Limitin:aninterferonlikecytokinethatpreferentiallyinfluencesB21ymphocyteprecursors)的'糖蛋白。1994年，Sekellick等首先克隆得到雞胚成纖維細胞IFN-a基因，并進行了結構分析。1996年Sick，Scultz等對雞a干擾素基因進行了克隆與表達，并對表達產物進行了抗病毒活性的研究。研究表明雞a干擾素是無內含子的多拷貝基因，編碼162個氨基酸的成熟蛋白，有4個糖基化位點，推測其大小為19KD(PeiJ，SekellickMJ,MarcusPI"a/.ChickeninterferontypeIinhibitsinfectionsbronchitisvirusreplicationandassociatedrespiratoryillness[J])。現已證明重組雞a干擾素對新城疫病毒(NDV)(MarcusPI，HeideLVD，SekellickMJ.InterferonActiononAvianViruses.I.OralAdministrationofChickenInterferondamelioratesNewcastleDisease[J])、禽流感病毒(AIV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)等(李鳳華，林云圣，崔麗,等.家禽基因工程干擾素生物學作用及其在禽病防治中的應用[J])都有抵抗作用。近年來干擾素的研究取得了一些進展，已有商品化的豬、犬、雞等重組IFN產品面市，但目前干擾素的研究仍停留在基礎研究和臨床試驗階段，在獸醫臨床的應用上還主要局限于寵物疾病的治療。新型重組干擾素即為一種復合干擾素(Consensusinterferon,IFN-Con),是一種重組的、非天然的I型干擾素。80年代初，美國安進公司將已知的13種a干擾素序列進行比較,把出現頻率最高的氨基酸分配到各自相應的位置，并對個別位置做了修改，得到復合干擾素的氨基酸序列，并在大腸桿菌中成功表達(BlattLM,DavisJM,KleinSB，a/.Thebiologicactivityandmolecularcharacterizationofanovelsyntheticinterferon-alphaspecies,consensusinterferon[J])。體夕卜實驗表明,IFN-Con-1的抗病毒活性、抗增殖活性及誘導NK細胞的活性均高于IFNa-2a和IFNa-2b，可能與其與更多的細胞表面受，結合,且具有更強的親和力有關。1997年,FDA批準IFN-Con-1用于慢性丙型肝炎的治療，商品名為干i津。雞的病毒性疾病尤其是烈性傳染性病毒性疾病,如禽流感、新城疫、馬立克氏病等的地區性流行給養雞業帶來數億計的損失。因此，急需從多個角度對干擾素的結構進行改造，以賦于其新的功能以及大量生產高質量的干擾素制劑研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強劑用于增強雞體的抵抗力和提高現有疫苗的保護率。為了進一步研究干擾素作用和擴大干擾素在生物領域的發展應用，我們進行了雞新型復合干擾素的研究工作設計該干擾素時選擇野生型及抗病力較強的品種的a干擾素亞型為模板；將收集的干擾素氨基酸序列用DANMAN或者LasegeneDNAstar等軟件進行比對分析，以擇量錄取原則，選擇出現頻率最高的氨基酸，拼接出一個人造干擾素氨基酸序列模板。LasergeneDNAstar分析新干擾素氨基酸結構，與其他表達或不表達蛋白質結構進行比較結構越簡單越有利于表達；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性改造新型干擾素基因序列，在偏嗜性差別不大或密碼子出現頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼子，使酵母表達的基因GC含量控制在45y。左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新基因序列后根據其長度設計引物，用PrimerPremier5.0軟件共設計了十六條引物，根據擴增長度按常規擴增條件反應進行擴增。由誘生劑誘導產生的雞IFN-a,因來源少、成本高、純化工藝復雜等諸多限制而價格昂貴,極大限制了臨床和科研的應用。原核表達存在著表達蛋白的產量低,不易于純化以及菌株不穩定等問題，限制了向規模化生產的轉化。而且大腸桿菌表達的雞干擾素主要以包涵體的形式存在，包涵體在變性、復性上對人員技術及設備的要求都很高，且工序繁瑣，損失得較多，這些增加了重組雞干擾素工業產品的成本及生產難度。因此，本試驗釆用酵母表達系統(J丄.Cereghino，J.M.Cregg，HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris)，這有禾ll于干擾素的產業化生產。三
發明內容技術問題本發明的目的在于對雞a干擾素結構進行改造，以賦于其新的功能，研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強劑用于增強雞體的抵抗力和提高現有疫苗的保護率，同時克服現有技術中由誘生劑誘導產生雞IFN-a的來源少、成本高、純化工藝復雜等諸多限制，以及大腸桿菌表達的雞干擾素主要以包涵體的形式存在，包涵體在變性、復性上對人員技術及設備的要求都很高，且s:序繁瑣，損失得較多，這些增加了重組雞干擾素工業產品的成本及生產難度。因此，我們研究出一種復合重組雞a干擾素的基因序列的生產方法及其重組表達載體，達到高表達、高穩定、高分泌、高活性的生產，可廣泛用于包括新城疫、禽流感在內的雞的各種病毒性疾病的防制和早期治療，以及增強雞群的整體免疫力。技術方案一種重組雞a干擾素基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.1，其大小為582bp;上述重組雞a干擾素基因的應用，包括(一)含有雞a干擾素基因酵母表達載體的構建與鑒定將人工合成的權利要求1所述重組雞a干擾素基因SEQIDNO.1加fcoRI和J力al兩個酶切位點或者將以該基因設計引物用PCR擴增該雞a干擾素基因SEQIDNO.1的產物與pPICZa-A酵母載體，分別進行I和JAal雙酶切，回收酶切產物，T4DNALigase連接過夜，連接產物轉化感受態E.coliDH5細胞得到重組表達載體，重組表達載體再進行酶為EcoRl和Xbal的雙酶切鑒定，酶切切下大小為582bp的條帶則鑒定為陽性載體，并將陽性載體送上海英俊公司進行DNA序列測定，序列測定完全符合SEQIDNO.1，其陽性載體即為構建的含有雞a干擾素基因酵母表達載體，命名為pPICZa-A-rChIFN-a;(二)酵母菌感受態細胞的制備挑取畢赤酵母X-33菌平板上的一個單菌落轉接于2mLYPD試管中，28'C250rpm恒溫搖過夜活化12h后，取500pL活化后的畢赤酵母X-33菌液轉接于50mL的含有無菌5mLYPD培養基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28。C恒溫搖床250rpin搖蕩培養20h左右，待菌液0D6。。=1.3-1.5時,4°C2500rpm/min離心lmin收獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用lmL冰預冷水洗滌兩遍，再用lmL冰預冷的lmol山梨醇洗漆一次，4°C2500rpm/min離心lmin，最后用0.8mL冰預冷的lmol山梨醇懸浮菌體，分裝不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即為為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態細胞；(三)含有雞a干擾素基因酵母表達載體電轉化入酵母菌(1)取經Sacl酶線性化后的上述含有雞a干擾素基因的酵母表達載體10)iL，與80上述感受態酵母菌畢赤酵母X-33混勻，然后轉移到冰預冷的0.2cm的電轉化杯中，冰上放置5min;(2)將電轉化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進行電擊一次，電擊條件電壓1500V,電容25uF,電阻200Q，時間5ms;(3)電擊結束，立即加入lmL冰預冷的lmol山梨醇，混勻，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28"C恒溫培養箱，培養lh，然后取250pL轉化物涂含有100ng/mLZeocin抗性的YPDS培養基平皿上，置28'C恒溫培養2-4天，將在YPDS培養基上生長的含pPICZa-A-rChlFN-a的載體重組酵母菌落進行陽性鑒定；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌株的陽性鑒定(1)提取酵母基因組DNA:將上述YPDS培養基上生長的pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌落挑至含lOOng/mLZeocin的YPDS液體培養基中，28'C搖床培養36h-48h，然后從該菌液中提取酵母基因組DNA:取IraL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min離心lmin,棄上清，用lmL的滅菌水重懸菌體，重復兩次，然后加lOOpL的滅菌水，10(TC煮10分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，IO(TC煮IO分鐘，12000rpm/min離心取上清液，即為酵母基因組DNA;(2)用來陽性鑒定的AOXl引物上游-5'陽gactggttccaattgagaagc-3，下游-5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以A0X1引物為特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為10XPCKBuffer5.OpL;10mMdNTPs1.OpL;20pmol/nL5'A0X1引物0.5(iL:基因組DNA模板5.OjxL;20pmol/VL3'A0X1引物0.5|iL;Taq酶0.5)iL;滅菌水補體積至50pL擴增程序95。C5min，94。Clmin,54。C1.5min，72。C2.5min,30個循環，72。C7min，擴增結束，取5HL反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴增片段總長度為U68bp的條帶，則為含有pPICZci-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽性菌株；(五)高拷貝酵母菌株的篩選將YPDS培養基平皿中長出的上述含有pPICZa-rChlFN-a載體的重組酵母陽性菌落，以影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000)ig/raL的YPDS固體培養基中，篩選的Zeocin抗性菌株即為含有pPICZa-rChlFN-a基因的高拷貝菌株；(六)含有PPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母高拷貝菌株的誘導表達從含有上述高拷貝菌株的YPDS培養基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養基中，經28。C搖床培養至0D60O=2-6時，室溫1500rpm/min離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用lOOmL的BMMY培養液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28'C搖床進行誘導表達，每24h向培養基中補加終濃度為體積比1%的甲醇，以保持誘導的持續表達，在誘導72h時收集培養的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體表達的上清備用；(七)含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的高表達酵母菌株表達產物的獲得將上述收集的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體的表達上清裝入透析袋，用1XPBS進行透析除鹽離子，透析后用直徑0.22陶的濾膜進行過濾除菌及雜質，即得到了本發明重組雞a干擾素基因的表達蛋白；有益效果本發明雞a干擾素的基因序列及氨基酸序列，是查找了目前GenBank上公布的27種雞a干擾素基因序列，將收集的這27種干擾素的氨基酸序列用DANMAN或者LasergeneDNAstar等軟件進行比對分析，以擇量錄取原則，選擇出現頻率最高的氨基酸，拼接出一個人造干擾素氨基酸序列模板。用LasergeneDNAstar分析新干擾素氨基酸結構，與其他表達或不表達蛋白質結構進行比較，結構越簡單越有利于表達；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性進行設計新干擾素基因序列在偏嗜性差別不大或密碼子出現頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼子，使酵母表達的基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新基因序列后根據其長度設計引物，用PrimerPremier5.0軟件共設計十六條引物，根據擴增長度按常規擴增條件反應進行，設計而成。本發明所用巴氏德畢赤酵母表達系統即巴氏德畢赤酵母X-33菌是已被國內外廣泛用來表達外源蛋白質的一種公知菌株(齊連權，人"干擾素在巴士德畢赤酵母中的表達，2003年軍事醫學科學院院刊；Cereghino等，Heterogousproteinexpressioninthemethylotrophicyeast尸j'c/iapasWs)它能利用甲醇作為唯一碳源大量合成蛋白質，主要有以下幾個生物特性a:利用甲醇作為唯一碳源快速生長；B:畢赤酵母中存在許多微體細胞器，它們可以大量儲存蛋白質，該特點對表達外源蛋白質非常有利，可以使其免受蛋白酶的降解；C:可以對表達的外源蛋白進行適度的糖基化等修飾，使外源蛋白能夠最大程度上保持其天然結構U丄.Cereghino，J.M.Cregg,HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris)。利用巴氏德畢赤酵母表達載體表達外源蛋白的優點A:高表達含有醇氧化酶的強啟動子，細胞生長速度快，能夠較高的表達外源蛋白；B:高穩定該載體不是以自主復制的形式存在而是整合在酵母菌的染色體上，所以構建的重組菌株很穩定；C:高分泌1995年RomanosM.等報道含有a交配因子的分泌和先導序列，可以使外源蛋白分泌到培養上清，而且表達的外源蛋白的純度達到75%以上；D:培養成本低，產物易分離純化；E:可以大體積高密度連續發酵培養；F:作為真核表達系統，可對目的蛋白進行翻譯后加工和修飾；G:該表達系統有多種受體菌和表達載體供選擇,進行胞內表達或分泌表達，有利于產物的提取和加工。本發明將新型雞a干擾素的基因序列通過電轉化方式整合到酵母上的特定位置。這株重組菌表達的干擾素經抗病毒活性測定具有很高的抗病毒活性，本設計研制出的干擾素的抗病毒活性與山東某公司的天然a干擾素的工程菌的活性進行了比較其活性提高了6.8倍。并且采用畢赤酵母表達系統表達外源基因，酵母本身蛋白分泌到上清中的很少，這樣就增加了所表達外源蛋白的純度，有利于該干擾素的規模化生產。我國是一個養雞大國，但目前有多種傳染病嚴重危害著我國養雞業的發展，影響了我國雞肉的對外貿易。雞的病毒性疾病尤其是烈性傳染性病毒性疾病，如禽流感、新城疫、馬立克氏病等的地區性流行給養雞業帶來數億計的損失。因此，急需從多個角度對IFN的結構進行改造，以賦于其新的功能以及大量生產高質量的IFN制劑研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強劑用于增強雞體的抵抗力和提高現有疫苗的保護率，這也是本發明設計的目的。本研究采用的畢赤氏酵母基因工程菌生產的新型雞a干擾素與傳統生產的雞a干擾素和用大腸桿菌表達的a干擾素相比有以下幾個優點A獲得具有生物活性的重組雞a干擾素方法和程序都簡單只需收集表達的上清進行透析除鹽、過濾除菌處理后無需純化即可投入臨床使用；B無毒害物質酵母不會分泌向大腸桿菌表達的外源蛋白那樣附帶一些對雞體細胞有毒害的毒素；C純度高酵母表達的雞a干擾素的SDS-PAGE結果經薄層掃描顯示，重組酵母雞a干擾素的目的條帶占總表達蛋白量的80%;D廣譜抗病毒作用現國外資料表明雞干擾素對雞的各種病毒性疾病的病毒(勞氏肉瘤病毒等等)均有較好的抑制作用，尤其對一些烈性傳染性病毒性疾病如禽流感、新城疫、馬立克氏病、法氏囊病的早期治療和防制有很好的作用，能在很大程度上遏制各種雞傳染性的病毒性疾病的流行和爆發；E抗病毒作用強該新型基因組表達的蛋白經過4365158.3倍稀釋后，能完全抑制100-1000TCID50的水皰性口炎病毒的攻擊。與天然的雞a干擾素相比，有更強的抗病毒作用，其抗病毒作用提高了6.8倍。本試驗還測定經lOOOU/mL和100U/mL的新型重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細胞中新城疫病毒的滴度分別比對照降低了1.71Logl0TCID5。和0.87LoglOTCID5。；經lOOOU/mL和100U/mL的新型重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細胞中禽流感病毒的滴度分別比對照降低了1.81Logl0TCIDs。和0.90LoglOTCIDM。，高濃度的干擾素作用更明顯；F有強大的免疫調節作用醫學臨床把干擾素用于SARS、肝炎以及各種病毒性疾病治療和預防的成功例子為重組雞a干擾素用于雞群各種病毒性疾病的治療和防制提供了可靠的依據。近年我國雞群因爆發的流行性的病毒性疾病給養殖業帶來的損失數以億計，而且諸如禽流感等病毒性傳染病的局部地區的流行給養雞業和人群的安全帶來很大的威脅，這種損失是難以用金錢來衡量的。重組酵母雞a干擾素的研制成功并具有較強的抗病毒活性，以及它所具有的一系列的便于工業化生產的優點，必將給我國雞病毒性疾病的防制帶來新的局面。四圖1:重組雞a干擾素基因PCR產物電泳分析1，DNA分子量標準；2-9,第一輪PCR產物;10-13，第二輪PCR產物;14-15,第三輪PCR產物;16,第四輪PCR產物，為最終目的片段圖2:pPICZa-A-chlFN-con-a陽性克隆載體的酶切鑒定1，空質粒酶切對照；2,EcoRI和Xbal酶切的重組表達載體；3，4500DNA分子量標準圖3:重組酵母菌的PCR鑒定1，4500DNA分子量標準；2，未重組上的空酵母X-33對照；3，陽性重組酵母菌圖4:PCR擴增示意圖五具體實施例方式一、試驗材料Ssc/en'cWaco//DH5a,酵母菌X-33，pPICZa-A載體購自南京天根生化科技公司；新城疫病毒、禽流感病毒購自江蘇農科院獸醫所；SPF雞胚購自南京乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠；所用化學試劑均購自Takara公司；商品雞天然a干擾素購于山東某生物科技有限公司；設計該干擾素時選擇野生型及抗病力較強的品種的a千擾素亞型為模板；將收集的干擾素氨基酸序列用DANMAN或者LasergeneDNAstar等軟件進行比對分析，以擇量錄取原則，選擇出現頻率最高的氨基酸，拼接出一個人造干擾素氨基酸序列模板。LasergeneDNAstar分析新干擾素氨基酸結構，與其他表達或不表達蛋白質結構進行比較結構越簡單越有利于表達；確定好氨基酸序列后，按照偏嗜密碼子的偏嗜性改造新型干擾素基因序列，在偏嗜性差別不大或密碼子出現頻率不很極端的情況下，選擇GC含量高的偏嗜密碼子，使酵母表達的基因GC含量控制在45。/。左右，接近酵母本身基因組的GC含量。確定好新基因序列后根據其長度設計引物，用PrimerPremier5.0軟件共設計了十六條引物，根據擴增長度按常規擴增條件反應進行擴增。二、試驗設計及生產方法(一)重組到畢赤酵母上的新型雞a干擾素的基因序列的的設計及擴增(A)在GenBank上查找雞ci干擾素的基因序列，選擇野生型及抗病力較強的品種的a干擾素亞型為模板共27種；(B)通過DNAStar進行基因序列比較，以擇量錄取原則，將出現頻率高的氨基酸進行重新組合，拼接出一個人造干擾素氨基酸序列模板，該氨基酸序列模板為含582bp的新的堿基序列SEQIDNO.l,加兩個酶切位點及保護性堿基，共597bp,根據密碼子偏嗜性，全部換用酵母的偏嗜性密碼子(趙翔霍克克李育陽畢赤酵母的密碼子用法分析)。基因GC含量控制在45%左右，接近酵母本身基因組GC含量(GrahamSinclair,FrancisY.M.Choy.Synonymouscodonusagebiasandtheexpressionofhumanglucocerebrosidaseinthemethylotrophicyeast,Pichiapastoris);(C)確定好新基因序列后根據其長度設計引物，用PrimerPremier5.0進行引物設計，共設計16條，每條引物之間重疊15-20bp見表1。表l設計的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(D)SOE法進行PCR擴增，見圖4反應體系5XPrimeSTARBuffer10.0|xL;P上游引物1.0;P下游引物1.0|_iL;ddH2033如L;在PCR儀上設置95°C5min，隨后94'Cl8s,54°C18s，72°C18s，共30個循環，結束循環后72°C10min;對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞a干擾素基因大小。以上面體系對引物兩兩進行擴增，然后回收PCR產物，再以PCR產物為模板進行如下體系擴增5XPrimeSTARBuffer10.0|_iL;PrimeSTAR0.4;P上游引物0.25nL;dNTP4.0nL;P下游引物0.25模板l2.0nL;模板22.0|iL;ddH2031.1pL;在PCR儀上設置95。C5min,隨后94。Cl8s，54。C18s,72'Cl8s，共30個循環，結束循環后72°C10min;對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞a千擾素基因大小。最后擴增出PCR產物的基因片段大小為597bp見圖1;(二)含有雞a干擾素基因酵母表達載體的構建與鑒定將人工合成的重組雞a干擾素基因SEQIDNO.1加￡coRI和Z力al兩個酶切位點或者將以該基因設計引物用PCR擴增該雞a干擾素基因SEQIDNO.1的產物與pPICZa-A酵母載體，分別進行I和Xfel雙酶切，回收酶切產物，T4DNALigase連接過夜,連接產物轉化E.coliDH5a感受態細胞得到重組表達載體，重組表達載體再進行酶為EcoRI和XbaI的雙酶切鑒定，酶切切下大小為582bp的條帶則鑒定為陽性載體,對陽性載體送上海英俊公司進行DNA序列測定，序列測定完全符合SEQIDNO.1，其陽性載體即為構建的含有雞a干擾素基因酵母表達載體，命名為pPICZa-A-rChlFN-a;見圖2;(三)酵母菌感受態細胞的制備挑取畢赤酵母X-33菌平板上的一個單菌落轉接于2mLYPD試管中，28'C250rpm恒溫搖過夜活化12h后，取500pL的活化后的畢赤酵母X-33菌液轉接于50mL的含有無菌5mLYPD培養基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28'C恒溫搖床250rpra搖蕩培養20h左右，待菌液0D6。。=1.3-1.5時，4°C2500rpm/min離心lmin收獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用lmL冰預冷水洗滌兩遍，再ffllmL冰預冷的lmol山梨醇洗滌，4'C2500rpm/min離心lmin，最后用0.8mL冰預冷的lmol山梨醇懸浮菌體，分裝不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即為為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態細胞；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a的表達載體電轉化入酵母菌(1)取經SacI酶線性化后的上述含有雞a干擾素基因的酵母表達載體lOjiL,與80上述酵母菌畢赤酵母X-33感受態細胞混勻，然后轉移到冰預冷的0.2cm的電轉化杯中,冰上放置5min:(2)將電轉化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進行電擊一次，電擊條件電壓1500V,電容25uF,電阻200Q,時間5ms;(3)電擊結束，立即加入lmL冰預冷的lmol山梨醇，混勻，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28'C恒溫培養箱，培養lh，然后取250nL轉化物涂含有100pg/mLZeocin抗性的YPDS培養基平皿上，置28'C恒溫培養2-4天，將在YPDS培養基上生長的pPICZa-A-rChIFN-a載體重組酵母菌落進行陽性鑒定；(五)含pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌株的陽性鑒定(1)提取酵母基因組DNA:將上述YPDS培養基上生長的pPICZa-A-rChIFN-a載體重組酵母菌落挑至含lOOng/mLZeocin的YPDS液體培養基中，28。C搖床培養36h_48h，然后從該菌液中提取酵母基因組DNA:取lmL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min離心lmin,棄上清，用lmL的滅菌水重懸菌體，重復兩次，然后加lOOpL的滅菌水，IO(TC煮IO分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，IOO'C煮IO分鐘，12000rpm/niin離心取上清液，即為酵母基因組DNA,以其為模板進行PCR陽性鑒定(Linder，S.,Schliwa,M.，Kube-Granderath，E.,1996.DirectPCRscreeningof,/。加"》clones.BioTechniques);(2)用來陽性鑒定的AOX1引物上游5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以A0X1引物為特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為10XPCRBuffer:5.OpL;10mMdNTPs:l.O(xL;20pmol/VL5'A0X1引物0.5jaL;基因組DNA模板5.0)iL;20pmol/iaL3'A0X1引物0.5pL;T叫酶0.5pL;滅菌水補體積至50nL擴增程序95'C5min,94。Clmin，54。C1.5min,72°C2.5min,30個循環，72。C7min，擴增結束，取5|xL反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴增片段總長度為U68bp的條帶，則為含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽性菌株；見圖3;(六)高拷貝酵母菌株的篩選將YPDS培養基平皿中長出的上述含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽性菌落，以影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000ng/mL的YPDS固體培養基中，篩選的Zeocin抗性菌株即為含有pPICZa-A-rChlFN-a基因的高拷貝菌株；(七)含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母高拷貝菌株的誘導表達從含有上述高拷貝菌株的YPDS培養基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養基中，經28。C搖床培養至0D6a)=2-6時，室溫1500rPm/min離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用lOOmL的BMMY培養液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28'C搖床進行誘導表達，每24h向培養基中補加終濃度為體積比1%的甲醇，以保持誘導的持續表達，在誘導72h時收集培養的含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母菌體表達的上清備用；(八)含有pPICZa-A-rChIFN-a載體高表達酵母菌株表達產物的獲得將上述收集的含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母菌體的表達上清裝入透析袋，用1XPBS進行透析除鹽離子，透析后用直徑0.22陶的濾膜進行過濾除菌及雜質，即得到了本發明重組雞a干擾素基因的表達蛋白；同時通過不同時段取樣的電泳分析，進行SDS-PAGE電泳(U.K.Laemmli,CleavageofstructuralproteinsduringassemblyoftheheadofbacteriophageT4)發現在誘導了72h時的上清的電泳圖上在31千道爾頓與44千道爾頓之間有一條大約37千道爾頓的明顯的蛋白電泳條帶，比預測的分子量大，其原因可能在表達時有不同程度的糖基化；(九)酵母表達的雞a干擾素的生物活性的測定，并與商業雞天然a干擾素進行活性比較采用微量細胞病變抑制法(侯云德.分子病毒學[M])取孵化9-10d的SPF雞胚，去頭、四肢及內臟，無菌狀態下用PBS洗三遍后，剪碎。吹打成單個細胞后上96孔板，生長約12h使細胞全部貼壁生長后，去除生長液，每孔加入IO倍倍比稀釋的干擾素，用100個TCID5o的劑量的口泡炎病毒(VSV)進行攻毒，細胞對照則加無病毒的營養液，同時設立陰性對照(只加10倍稀釋的干擾素，不加病毒)、陽性對照(不加干擾素，只加病毒)，空白對照(不加干擾素，不加病毒)，在倒置顯微鏡下觀察待對照孔出現75%以上病變的時候，判斷結果；商業雞天然a干擾素進行同樣的活性測定；A、抗水皰性口炎病毒的結果接入病毒24小時后觀察可見陽性對照孔完全出現100%嚴重病變，而加入進行10倍倍比稀釋的酵母表達干擾素的細胞孔中，106未見任何細胞病變，在107稀釋的孔中有45%左右的出現輕微病變，陰性對照孔中的雞胚成纖維細胞未見異常。從上述結果得出重組酵母雞a干擾素的生物學活性為4.43X10eU/mL;商業雞天然a干擾素的生物學活性為6.51X105U/mL，重組酵母雞a干擾素的生物學活性是天然a干擾素的生物學活性的6.8倍；表.2、pPICZa-A-rChIFN-a與商業雞天然a干擾素生物學活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>B、重組酵母菌表達的雞a干擾素的抗NDV、AIV的結果(1)AIV、NDV的TCIDBo的測定在96孔細胞板上，雞胚成纖維細胞測定新城疫病毒、禽流感病毒的TCIDs。。；(2)對病毒的抑制作用(曹瑞兵，周國棟，周海霞，等.豬e干擾素在畢赤酵母中的分泌表達及其對偽狂犬病毒的抑制作用)雞胚成纖維細胞記數后用培養液稀釋到適當的密度，滴加到24孔板，置于37°C，5%C02的培養箱中待細胞貼壁成單層(約12-18h)后。分別加入終濃度為1000U/mL和100U/mL的復合重組a雞干擾素繼續培養，每個處理8個孔，同時設4孔病毒對照和4孔空白對照。24h后去上清，用無血清培養液洗滌細胞后，每孔加入100TCID5。/mL的AIV、NDVlmL。37'C吸附lh后，棄去病毒液。每孔加入lmL的含2%小牛血清的營養液，置于37'C，5%C02的培養箱繼續培養至病毒對照孔的細胞出現明顯的病變，當陽性對照出現明顯病變時約60h-72h，將24孔板在-20'C凍融2次，各處理分別取3個樣測定病毒滴度。(3)抗NDV、AIV的結果表.3、抗新城疫病毒的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析經1000U/mL和100U/mL的新型重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細胞中NDV的滴度分別比對照降低了1.71LoglOTCID50禾Q0.87LoglOTCID50;表.4、抗禽流感病毒的結果處理方法干擾素濃度病毒滴度(loglOTCID50/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>分析經1000U/mL和100U/mL的新型復合重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細胞中AIV的滴度分別比對照降低了1.81LoglOTCID50禾Q0.90LoglOTCID50;根據以上實驗可以說明新型復合重組酵母雞a干擾素己被成功研制出來,其4365158.3倍稀釋便可完全抑制住100TCIDso水皰性口炎病毒的增殖。陰性對照孔中的細胞生長良好，說明酵母干擾素上清對雞體細胞沒有明顯毒害。而且該復合重組酵母雞a干擾素對AIV和NDV等都具有較強的抑制能力經1000U/mL和100U/mL該重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細胞中新城疫病毒的滴度分別比對照降低了1.71Logl0TCID5。和0.87LoglOTCIDs。；經lOOOU/mL和lOOU/mL該重組的雞a干擾素處理的雞胚成纖維細胞中禽流感病毒的滴度分別比對照降低了1.81Logl0TCIDs。和0.90LoglOTCID5。。結果表明該基因表達的蛋白可抑制新城疫病毒和禽流感病毒的增殖，高濃度的干擾素作用更明顯。該研究為重組雞a干擾素的商業生產及在養雞業中的應用提供了實驗基礎，為干擾素在雞病防治應用中提供了試驗依據。序列表<110>南京農業大學<120>一種重組雞a干擾素基因及其重組載體<130>說明書<140>00<141>2008-06-12<160>18<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>582<212>DNA<213>SEQIDNO.3<220><221>雞a干擾素成熟蛋白的基因序列<222>(1)..(582)<223><400>1atggctgttccagcttctccacaacatccaagaggttacggtattttgttgttgactttg60ttgttgaaggctttggctactactgcttctgcttgcaaccaccttcgcccccaggatgcc120accttctctcacgacagcctccagctcctccgggacatggctcccacactaccccagctg180tgcccacagcacaacgcgtcttgctccttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacc240cggcaagccgacaaaaccacccacgacatccttcagcacctcttcaaaatcctcagcagc300cccagcactccagcccactggaacgacagccaacgccaaagcctcctcaaccggatccac360cgctacacccagcacctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcga420tggcctcgcaaccttcacctcaccatcaaaaaacacttcagctgcctccacaccttcctc480caagacaacgattacagcgcctgcgcctgggaacacgtccgcctgcaagctcgtgcctgg540ttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttag582<210>2<211>193<212>PRT<213>人工合成<220><221>雞a干擾素成熟蛋白的氨基酸序列<222>(1)..(193)<223><400>2MetAlaValProAlaSerProGinHisProArgGlyTyrGlylieLeu151015LeuLeuThrLeuLeuLeuLysAlaLeuAlaThrThrAlaSerAlaCys202530AsnHisLeuArgProGinAspAlaThrPheSerHisAspSerLeuGin354045LeuLeuArgAspMetAlaProThrLeuProGinLeuCysProGinHis505560AsnAlaSerCysSerPheAsnAspThrlieLeuAspThrSerAsnThr65707580ArgGinAlaAspLysThrThrHisAsplieLeuGinHisLeuPheLys859095lieLeuSerSerProSerThrProAlaHisTrpAsnAspSerGinArg100105110GinSerLeuLeuAsnArglieHisArgTyrThrGinHisLeuGluGin115120125CysLeuAspSerSerAspThrArgSerArgThrArgTrpProArgAsn130135140LeuHisLeuThrlieLysLysHisPheSerCysLeuHisThrPheLeu145150155160GinAspAsnAspTyrSerAlaCysAlaTrpGluHisValArgLeuGin165170175AlaArgAlaTrpPheLeuHislieHisAsnLeuThrGlyAsnThrArg180185190Thr<210>3<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-Pl<222>(1)..(59)<223><400>3gcagaattcatggctgttccagcttctccacaacatccaagaggttacggtattttgtt59<210>4<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P2(43-101):<222>(1)..(59)<223><400>4cagaagcagtagtagccaaagccttcaacaacaaagtcaacaacaaaataccgtaacct59<210>5<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P3(81-139)<222>(1)..(59)<223><400>5ctttggctactactgcttctgcttgcaaccaccttcgcccccaggatgccaccttctct59<210>6<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P4(119-177)<222>(1)..(59)<223><400>6gtgggagccatgtcccggaggagctggaggctgtcgtgagagaaggtggcatcctgggg59<210>7<211>58<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P5(157-214)<222>(1)..(58)<223><400>7cctccgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcgtcttgc58<210>8<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P6(193-251)<222>(1)..(59)<223><400>8cgggtgttgctggtgtccaggatggtgtcgttgaaggagcaagacgcgttgtgctgtgg59<210>9<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P7(232-291)<222>(1)..(59)<223><400>9ctggacaccagcaacacccggcaagccgacaaaaccacccacgacatccttcagcacct59<210>10<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P8(271-329)<222>(1)..(59)<223><400>10cagtgggetggagtgctggggctgctgagga加gaagaggtgctgaaggatgtcgtg59<210>11<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P9(309-368)<222>(1)..(59)<223><400>11ccccagcactccagcccactggaacgacagccaacgccaaagcctcctcaaccggatcc59<210>12<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P10(348-406)<222>(1)..(59)<223><400>12gctgtccaagcattgctcgaggtgctgggtgtagcggtggatccggttgaggaggcttt59<210>13<211>56<22>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P11(386-441)<222>(1)..(56)<223><400>13ctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaa56<210>14<211>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P12(421-479)<222>(1)..(59)<223><400>14tggaggcagctgaagtgttttttgatggtgaggtgaaggttgcgaggccatcgcgtccg59<210>15<2U>59<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P13(459-517)<222>(1)..(59)<223><400>15aaaacscttcagctgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcct59<210>16<211>58<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P14<222>(1)..(58)<223><400>16aggaaccaggcacgagcttgcaggcggacgtgttcccaggcgcaggcgctgtaatcgt58<210>17<211>64<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P15(534-597)<222>(l).洲<223><400>17gcaagctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttctag60atga<210>18<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>IFN-P16(73-597)<222>(1)..(25)<223>40O18tccgttgtgcgcgtgaagatctact2權利要求1、一種重組雞α干擾素基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.1，其大小為582bp。2、權利要求l所述重組雞a干擾素基因的應用，包括(一)含有雞a干擾素基因酵母表達載體的構建與鑒定將人工合成的權利要求1所述重組雞a干擾素基因SEQIDNO.1加AcoRI和J6al兩個酶切位點或者將以該基因設計引物用PCR擴增該雞a干擾素基因SEQIDNO.1的產物與pPICZa-A酵母載體，分別進行￡coRI和Jtel雙酶切，回收酶切產物，T4DNALigase連接過夜,連接產物轉化感受態E.coliDH5a得到重組表達載體，重組表達載體再進行酶為EcoRI和XbaI的雙酶切鑒定，酶切切下大小為582bp的條帶則鑒定為陽性載體，并將陽性載體送上海英俊公司進行DNA序列測定，完全正確的陽性載體即為構建的含有雞a干擾素基因酵母表達載體，命名為pPICZa-A-rChIFN-a;(二)酵母菌感受態細胞的制備挑取畢赤酵母X-33菌平板上的一個單菌落轉接于2mLYPD試管中，28'C250rpm恒溫搖過夜活化12h后,取500pL的活化后的畢赤酵母X-33菌液轉接于50mL的含有無菌5mLYPD培養基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28'C恒溫搖床250rpm搖蕩培養20h左右，待菌液ODeoo=l.3-1.5時，4°C2500rpm/min離心lmin收獲畢赤酵母X-33菌體，菌體依次用lmL冰預冷水洗滌兩遍，再用lmL冰預冷的lmol山梨醇洗滌，4。C2500rpm/min離心lmin，最后用0.8mL冰預冷的lmol山梨醇懸浮菌體，分裝不同的1.5mL的Eppendof管后，置4'C待用，即為制備的酵母菌畢赤酵母X-33感受態細胞；(三)含有雞a干擾素基因酵母表達載體電轉化入酵母菌感受態細胞(1)取經Sacl酶線性化后的上述含有雞a干擾素基因的酵母表達載體10pL，與80上述酵母菌畢赤酵母X-33感受態細胞混勻，然后轉移到冰預冷的0.2cm的電轉化杯中，冰上放置5min;(2)將電轉化杯放在電穿孔儀上用脈沖電流進行電擊一次，電擊條件電壓1500V，電容25uF,電阻200Q,時間5ms;(3)電擊結束，立即加入lmL冰預冷的lmol山梨醇，混勻，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28'C恒溫培養箱，培養lh,然后取25(^L轉化物涂含有100^ig/mLZeocin抗性的YPDS培養基平皿上，置28'C恒溫培養2-4天，將在YPDS培養基上生長的含pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母菌落進行陽性鑒定；(四)含pPICZa-A-rChlFN-a載體重組酵母菌株的陽性鑒定(1)提取酵母基因組DNA:將上述YPDS培養基上生長的含pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌落挑至含100ug/mLZeocin的YPDS液體培養基中，28'C搖床培養36h-48h，然后從該菌液中提取酵母基因組DNA:取lmL的菌菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min離心lrain，棄上清，用lmL的滅菌水重懸菌體，重復兩次，然后加100uL的滅菌水，100'C煮10分鐘，消解酵母菌細胞壁，然后放入液氮凍30分鐘，IOO'C煮10分鐘，120000rpm/min離心取上清液，即為酵母基因組DNA;(2)用來陽性鑒定的A0X1引物上游-5，-gactggttccaattgagaagc-3，下游.'5，-gcaaatggcattctgacatcc-3，(3)PCR擴增鑒定以酵母基因組DNA為模板，以A0X1引物為特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為:5.OpL;0.5^L;0.5)LlL;10mMd,s基因組DNA模板Taq酶1.OpL;5.OpL;0.5pL;10XPCRBuffer20pmol/pL5'A0X1引物20pmolAiL3'A0X1引物滅菌水補體積至50pL擴增程序95。C5min，94。Clmin,54。C1.5min，72。C2.5min，30個循環，72。C7min，擴增結束，取5HL反應液做瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得擴增片段總長度為U68bp的條帶，則為含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母陽性菌株；(五)高拷貝酵母菌株的篩選將YPDS培養基平皿中長出的上述含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母陽性菌落，以影印法依次接種到含Zeocin抗生素濃度梯度為250，500，1000嗎/mL的YPDS固體培養基中，篩選的Zeocin抗性菌株即為含有pPICZa-A-rChlFN-a基因的高拷貝菌株；(六)含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母高拷貝菌株的誘導表達從含有上述高拷貝菌株的YPDS培養基平皿上分別挑取兩株菌株接于25mL的BMGY液體培養基中，經28'C搖床培養至ODeoo-2-6時，室溫1500rpm/min離心5min收獲菌體，將收獲的菌體用lOOmL的BMMY培養液懸浮于500mL的三角瓶中，置于28'C搖床進行誘導表達，每24h向培養基中補加終濃度為體積比lX的甲醇，以保持誘導的持續表達，在誘導72h時收集培養的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體表達的上清備用；(七)含有pPICZa-rChlFN-a載體的高表達酵母菌株表達產物的獲得將上述收集的含有pPICZa-A-rChlFN-a載體的重組酵母菌體的表達上清裝入透析袋，用1XPBS進行透析除鹽離子，透析后用直徑0.22Mm的濾膜進行過濾除菌及雜質，即得到了本發明重組雞a千擾素基因的表達蛋白。3、權利要求2的所述重組雞a干擾素基因的應用中所構建的酵母表達載體pPICZa-A-rChIFN-a。4、權利要求2的所述重組雞a干擾素基因的應用中所獲得的含有pPICZa-A-rChIFN-a載體的重組酵母載體的菌株。5、權利要求2的所述重組雞a干擾素基因的應用中所獲得的重組雞a干擾素基因的表達蛋白。全文摘要本發明涉及一種新型重組雞α干擾素基因序列，并構建其重組表達載體，屬于用分子生物學方法獲得的基因工程生物制品。將新設計的雞α干擾素的基因序列重組到pPICZα-A載體，然后通過電轉化方式整合到酵母菌上的特定位置。并采用畢赤酵母表達系統表達外源基因，有利于雞干擾素商業化生產。該基因組表達的蛋白經過4365158.3倍稀釋后，能完全抑制100-1000TCID₅₀的水皰性口炎病毒的攻擊。與天然的雞α干擾素相比，有更強的抗病毒作用，其抗病毒作用提高了6.8倍。試驗還測定該基因表達的蛋白可抑制新城疫病毒和禽流感病毒的增殖，且高濃度的干擾素作用更明顯。文檔編號C12N15/19GK101338314SQ20081012399公開日2009年1月7日申請日期2008年6月16日優先權日2008年6月16日發明者侯鳳香,珂劉,陳溥言申請人:南京農業大學