專利名稱：基于雜交稻f1種子鑒別其親本的分子檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種雜交稻種子親本的檢測方法，特別涉及一種基于雜交稻
Fl種子鑒別其親本的分子檢測方法。
背景技術：
在雜交水稻的推廣應用過程中，種子真偽、純度的鑒定是非常重要的一 環，也是執法的難點。傳統的鑒定方法主要是田間種植鑒定，但是這一方法
鑒定存在如下缺點鑒定周期長，受環境影響大，占用土地，受限于觀察者 的經驗，影響種子的及時銷售等。
種子品種的不同本質上是由于其遺傳物質DNA核苷酸序列不同所致，這 為根據分子標記技術獲得的品種指紋圖普鑒定品種的真偽和純度提供了依 據。利用分子標記技術(SSR、 AFLP、 RAPD等)已建立了對雜交水稻組合 及其已知親本的鑒定方法。在多種分子標記技術中，SSR分子標記方法具有 多態性程度高、符合孟德爾遺傳并呈共顯性，Fl雜交種子具有雙親等位基因 的互補帶型，位點檢測頻率固定為l，對樣品DNA用量小、要求不高，不需 使用同位素、帶型統計容易，結果穩定，重演性好，操作簡便、經濟、成本 低，有大量的SSR標記可供選用等，而成為目前進行品種分子鑒定的主要方 法。但是這一方法也存在如下局限對于尚未審定的品種，由于育種者在品 比、預試、區試和示范過程中，可以不提供親本，或者擔心親本材料的流失 而不愿提供親本，這樣僅根據雜種DNA指紋圖譜是無法推導其親本圖譜的， 因而無法進行鑒定。
發明內容
為了解決現有SSR分子標記方法用于雜交稻品種鑒別存在的上述技術問 題，本發明提供一種基于雜交稻F1種子鑒別其親本的分子檢測方法，本發明方法可根據雜種種子鑒別出兩個親本。
本發明解決上述技術問題的技術方案包括如下步驟
a. 按照常規DNA抽提方法從雜交稻F1種子稻殼和幼苗抽提DNA;
b. 根據國家標準選擇SSR引物，利用選擇的引物對稻殼和幼苗的DNA進行 SSR分子標記；
c. 由對稻殼DNA的擴增獲得母本的帶譜；由對幼苗DNA擴增獲得雜種F1的 帶譜；
d. 由雜種F1帶譜和母本帶譜推導出父本帶譜；
f.將獲得的雜種F1和其父本、母本的帶譜與雜交水稻DNA指紋庫數據比 對，確定父本、母本是否為己審定的親本或者未審定的新材料。
上述歩驟a中，稻殼和幼苗DNA抽提可以按照常規DNA抽提方法，如 CTAB方法。上述步驟b中，SSR引物的選擇按照國家標準選擇24對SSR引 物(中華人民共和國國家標準GB/T20396—2006。上述步驟c中，因為稻 殼是由母本組織發育而來，攜帶有母本全部的遺傳信息，因此，獲得的稻殼 的帶譜就是母本的帶譜。上述步驟d中，由于SSR分子標記共顯性特點，以 及重復序列兩端多為單拷貝保守序列的特點，由雜種F1帶譜和母本帶譜，可 以推導出父本帶譜，即由另一條互補帶構成。上述步驟f中，對多個SSR標 記進行分析，獲得雜種及其親本的全部指紋圖譜，與雜交水稻指紋圖譜庫進 行比對，即可對親本進行鑒定。因此只要根據雜交水稻品種的F1種子，即可 鑒別出其父母本，可以顯示父母本是否為已審定的親本或者未審定的新材料。
本發明的技術效果在于1)本發明利用雜交稻種子稻殼是由果皮和種皮 組成，發育自母本組織，保留了的母本DNA信息，可以輕易從稻殼獲得母本
的DNA指紋圖普；同時依據SSR為共顯性和保守的單拷貝的特點，結合雜 種帶型，推導出父本帶型，選用一套合適的SSR引物，就可以獲得雜種及親 本的完整SSR指紋圖譜，與建立的親本SSR指紋圖譜庫比對，就可以鑒別親 本是否為已登記親本還是新創親本，為雜交稻新品種管理和執法提供具有法 律效力的依據。2)有利于兩系雜交稻中的不育系保護程序的修改。不育系申 請保護的時候，可以不提供不育系種子，只要提供雜種種子，可以獲得不育 系指紋圖普，作為品種唯一性特征的指標數據。這樣可以避免兩系不育系種 子的流失，因為兩系不育系種子可以繁殖，而三系不育系不能自行繁殖，需 要保持系才能繁殖。3)有利于雜交稻恢復系的保護程序的修改。保持系申請 保護的時候，可以不提供保持系種子，只要提供雜種種子，可以獲得保持系 指紋圖普，作為品種唯一性特征的指標數據。這樣可以避免保持系種子的流 失，因為保持系種子就是常規水稻品種，可以自行繁殖。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的說明。
圖l為稻殼DNA的抽提。l:MolecularMarker;2:金23A幼苗；3:金 優207稻殼；4:金優207幼苗；5: R207幼苗。
圖2為SSR引物RM110對金優207幼苗和稻殼以及親本幼苗的擴增結果。 1: Molecular Marker; 2: R207幼苗；3:金優207幼苗；4:金優207稻殼；5: 金23A幼苗。
具體實施例方式
實施例1:
選用的雜交稻組合為金優207及其親本金23A和R207，按照常規DNA
抽提方法從幼苗和稻殼中抽提出符合質量要求的基因組總DNA。選用RM110、 體226、 RM247、 RM278、 RM341共5個SSR引物，進行SSR分析。獲得的稻殼 的SSR標記的帶型與雜種母本完全一致，再依據SSR分子標記共顯性特點， 由雜種和母本帶型推導出父本的帶型，最終在僅有雜種種子的情況下，獲得 雜種及其親本的完整的DNA指紋圖譜。
(1) 稻殼DNA的抽提
選用的雜交稻組合為金優207及其親本金23A和R207作為材料，3種材 料幼苗和雜種種子稻殼DNA的抽提均按照Murry等CTAB的方法。取500粒稻 殼或1克幼苗葉片放入研缽中，用液氮研磨至粉末狀，然后迅速轉移至1. 5ml 離心管；加入在65。C下預熱的630W提取液(100 mM Tris-Hcl(PH8. 0)， 20mM EDTA(PH8. 0) ， 1. 4M Nacl， 2%CTAB，用超純水定容至一升，調PH8. 0，最后加入 2ml疏基乙醇)，輕輕混勻，在65"水浴30 40min，冷卻至室溫；加入等體 積的氯仿/異戊醇(24: 1)，溫和上下顛倒離心管數次；4°C、 12000 rpm離 心10min;取上清液取上清，轉入新的離心管，并加等體積的氯仿/異戊醇， 離心取上清，加入450Pl預冷的異丙醇；-20。C放置1.5h， 4°C、 12000 rpm離 心10 min;用70X乙醇漂洗DNA沉淀2 3次，在超凈工作臺上風干，加入 20 WTE溶解，-2(TC保存備用。
按照常規DNA抽提方法，可以從稻殼中抽提出符合質量要求的基因組總 DNA (圖l)，并且和從幼苗葉片中抽提的DNA無明顯的質量差別。
(2) SSR分子標記的PCR擴增、檢測以及擴增產物的比較
選用謂IIO、固226、 RM247、 RM278、 RM341共5個SSR引物。PCR擴增反應 系統成分為10XBuffer(Mg2+ ),2W; dNTP，0.4W;引物，1.4W; T叫酶 (2uM )，0.6W;模板DNA， ddH20， 14潛1，加水至20 W。擴增程序
為94"變性4分鐘，然后94。C15秒，55。C15秒，72°C30秒進行35個循環， 最后72。C延伸7分鐘。
聚丙烯酰胺電泳為用1%的瓊脂糖膠密封玻璃板后，配置6%的聚丙烯酰胺 凝膠30呢的丙烯酰胺，4ml; 10xTBE， lml; 10%APS，200W;超純水加至20ml; TEMEDC，20W。凝膠1小時以上，加入0. 5xTBE緩沖液。點樣取指示劑
(指示劑100ml水中，含溴酚藍0.25g，二甲苯氰0. 25g，蔗糖40g)
充分混合后點樣。電泳150V電壓電泳80分鐘后倒去緩沖液取膠。銀染方法
按照下述方法操作，固定將膠置于固定液(IO無水乙醇，0.5%冰乙酸)中， 慢搖6分鐘，倒去固定液，再固定一次，共12分鐘；銀染倒去固定液，加
入0.2。/。AgN03溶液慢搖12分鐘；清洗倒去AgN03溶液用超純水清洗兩次， 每次30秒；顯色加入150ml顯色液(2. 25克Na0H溶于150ml的水中，然 后加入1.5ml甲醛，隨配隨用)，慢搖至呈現清晰的DNA條帶；沖洗用自來
水將膠清洗數次。照相后包膠儲存。
選取5條在金23A和R207之間有多態性的引物，對金23A幼苗、金23A 稻殼、金優207幼苗和R207幼苗進行擴增，其中，3條引物能擴增清晰的帶， 雜種具有父母本的互補帶型。比較結果顯示，金優207稻殼和金23A幼苗的 帶型一致，表明從母本發育形成的雜種稻殼，攜帶有母本的全部遺傳信息， 可以檢測到母本的基于SSR的指紋圖普，而無需提供母本材料。 (3)父本帶型的推導
由于SSR分子標記具有共顯性的特點，以及重復序列兩端多為單拷貝保守 序列的特點，在雜種和母本帶型已知的情況下，可以非常容易推導出父本的
帶型，即由另一條互補帶構成。 (4)雜交稻及其親本指紋圖普的比對
利用已有雜交稻及其親本的SSR指紋圖譜庫，可以對獲得待鑒定的組合
進行比對。這樣在只有雜種種子的情況下，可以根據本發明提供的方法獲得
雜種及親本的完整SSR指紋圖譜，與建立的親本SSR指紋圖譜庫比對，就可
以鑒別親本是否為已登記親本還是新創親本，為雜交稻新品種管理和執法提 供具有法律效力的依據。
實施例結果顯示，按照常規DNA抽提方法，可以從稻殼中抽提出符合質 量要求的基因組總DNA，而且其SSR標記的帶型與雜種母本完全一致，再依據 SSR分子標記共顯性特點，可以非常容易推導出父本的帶型，最終在僅有雜種 種子的情況下，獲得雜種及其親本的完整的DNA指紋圖譜。
權利要求
1、一種基于雜交稻F1種子鑒別其親本的分子檢測方法，其特征在于，包括如下步驟a.按照常規DNA抽提方法從雜交稻F1種子稻殼和幼苗抽提DNA；b.根據國家標準選擇SSR引物，利用選擇的引物對稻殼和幼苗的DNA進行SSR分子標記；c.由對稻殼DNA的擴增獲得母本的帶譜；由對幼苗DNA擴增獲得雜種F1的帶譜；d.由雜種F1帶譜和母本帶譜推導出父本帶譜；f.將獲得的雜種F1和其父本、母本的帶譜與雜交水稻DNA指紋庫數據比對，確定父本、母本是否為已審定的親本或者未審定的新材料。
全文摘要
本發明公開了一種基于雜交稻F1種子鑒別其親本的分子檢測方法，包括如下步驟a.按照常規DNA抽提方法從雜交稻F1種子稻殼和幼苗抽提DNA；b.根據國家標準選擇SSR引物，利用選擇的引物對稻殼和幼苗的DNA進行SSR分子標記；c.由對稻殼DNA的擴增獲得母本的帶譜；由對幼苗DNA擴增獲得雜種F1的帶譜；d.由雜種F1帶譜和母本帶譜推導出父本帶譜；f.將獲得的雜種F1和其父本、母本的帶譜與雜交水稻DNA指紋庫數據比對，確定父本、母本是否為已審定的親本或者未審定的新材料。本發明只需利用雜交稻種子就可以鑒定其親本。
文檔編號C12Q1/68GK101348834SQ20081014313
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月4日 優先權日2008年9月4日
發明者曹孟良, 袁隆平, 辜顯旺, 邢俊杰, 陽志剛 申請人:湖南西城雜交水稻基因科技有限公司