專利名稱：：小麥-簇毛麥新種質山農05078的ssr標記的制作方法
技術領域：
：本發明在對Am3和硬簇麥進行細胞學和性狀特點鑒定的基礎上，利用二者進行雜交，在其后代中選育出了高抗白粉病的種質系山農030713，利用SSR標記技術對另一個從Am3和硬簇麥雜交后代獲得的籽粒蛋白質含量高且高抗白粉病、銹病的種質系山農05078進行了標記，屬于作物遺傳育種學領域。
背景技術：
：簇毛麥(Dasypyr咖villos咖，VV，2n=14)屬禾本科小麥族小麥亞族簇毛麥屬，分蘗力比較強，多花，籽粒蛋白質含量高，耐旱，抗寒性好，高抗銹病、全蝕病和白粉病(孔凡晶，中國農業科學院博士學位畢業論文，2001，22-23)。硬簇麥(AABBVV，2n=42)是利用硬粒小麥和簇毛麥雜交人工合成的雙二倍體，保留了簇毛麥的優良性狀和特點，是進行小麥遺傳改良的優良中間材料(劉大鈞等，作物學報，1986，12(3):155-162;傅杰等，西北農林科技大學學報(自然科學版)，2001,29(6):1-8)。人工合成小麥Am3(AABBDD，2n=42)是利用波斯小麥與粗山羊草雜交后染色體加倍而形成的雙二倍體，但它所具有的A、B、D染色體組可能與經過多年分化的普通小麥所含的A、B、D染色體組不同，Am3對銹病、白粉高抗或免疫(陳尚安等，中國農業科學，1990,23(4):17-21)。是進行小麥遺傳研究的優良材料。利用Am3與硬簇麥進行雜交，有可能綜合二者優良特性，創制出兼具二者優良性狀的新種質材料。
發明內容本研究的目的是本實驗室在一些三屬雜種自交的較早世代(F4、F3代)就篩選出部分細胞學穩定的株系，其中部分材料對白粉病、條銹病等病害具有良好的抗性(李興鋒等，遺傳，2004，26(4):481-485)。但是尚缺乏對這些材料進行系統的鑒定、分析和評價。因此本研究對種質系030-1經多年大田和溫室鑒定表明對白粉病免疫，對其白粉病抗性基因性質和來源進行分析，并建立白粉病抗性基因的分子標記，將會為其在小麥遺傳改良中的應用打下基礎。小麥_簇毛麥新種質山農05078的SSR標記實驗材料所用實驗材料包括硬簇麥、Am3、山農030713、山農05078、中國春、簇毛麥、954072和馬奎斯，其中硬簇麥和Am3均由中國農科院作物所提供，山農030713(AABBDD，2n=42)和山農05078是由本實驗室選育的新種質系。954072是由山東農科院選育的小麥新品系，馬奎斯是加拿大春小麥品種，以上材料均由本實驗室種植保存。山農05078的SSR標記為進一步明確山農05078的染色體組成，隨機選取位于1A-7A、1B-7B染色體上的特異SSR引物41對，每個染色體選取3個引物(一般每個染色體的短臂上隨機選取1個引物，長臂上隨機選取2對引物，只有7A是長短臂各取一個引物)，對山農05078、山農030713、硬簇麥、Am3、中國春及簇毛麥進行SSR分析。結果發現，大部分引物都可以在山農05078、山農030713、硬簇麥、Am3及中國春中擴增出預期的特異帶，而簇毛麥不能擴增出這些帶(圖1)。雖然部分引物擴增出的目標片段長度有所變化，可能是由于個別片段發生了缺失或其他變化，但此結果說明山農05078含有A、B染色體基組的全部染色體。為了明確山農05078是否含有D基組基因，選用包括Xgwm、麗C、Xgdm、BARC系列的共180對D基組SSR引物和51對SWES系列的EST-SSR引物，對其進行了SSR分析。所用SSR引物為已被定位到小麥D基組染色體上的特異引物，所用SWES系列EST-SSR引物是陳海梅等根據普通小麥EST數據庫中序列信息開發出的引物，并利用小麥缺體_四體法定位到小麥D基組染色體上。結果表明共有196對引物能在山農05078和含有D基組的材料間擴增出差異帶，約占85%，其中54對引物能穩定地在所有含有和不含有D基組的材料間擴增出差異帶，部分電泳結果如下(圖2，圖3)。可以看出，大多數引物能在山農05078和含有D基組的材料間擴增出差異帶。其余35對引物中有4對SSR引物在山農05078和含有D基組的材料間擴增出了相同的帶紋(圖4)，有31對引物在山農05078或部分親本中擴增不出帶紋。綜合SSR和蛋白質電泳結果，推測山農05078中雖然不含有粗山羊草D基組的全部染色體，但可能有粗山羊草D基組遺傳物質的滲入。為了進一步確定山農05078中是否含有簇毛麥的遺傳物質，選用M2、Xgwm301和phv29等三個簇毛麥特異引物對其進行擴增。結果只有引物phv29能在含有簇毛麥遺傳物質的材料中擴增出一條大約430bp的特異帶(圖5)，而此帶在不含有簇毛麥遺傳物質的材料中均不存在，這說明該特異帶是簇毛麥遺傳物質的擴增產物，而山農05078也能擴增出此特異帶，推測山農05078中含有簇毛麥的遺傳物質。以下結合附圖對本發明作進一步的說明。圖1.引物Xgwm5-3A、Xgdml45_4A、BARC003-6AS和Xgwm400_7B的擴增結果(M:DL2000Marker，1:中國春；2:山農030713，3.Am3，4:山農05078,5:硬簇麥，6:簇毛麥，箭頭示差異帶)。圖2.引物SWES76-4D、SWES80-6DL、SWES121-2D和SWES231-6A/6DL的擴增結果(M:DL2000Marker，1:簇毛麥，2:硬簇麥，3:山農05078，4:Am3，5:山農030713，6:中國春，箭頭示差異帶)。圖3.引物BARC021-6DL、BARC095-2D、BARC123-6DS和BARC172-7DL的擴增結果(M:DL2000Marker，1:簇毛麥，2:硬簇麥，3:山農05078，4:Am3，5:山農030713，6:中國春，箭頭示特異帶)。圖4.引物BARC062-6DL、xgwm428-7D、wmc27-2DS和SWES76-4D的擴增結果(M:DL2000Marker，1:中國春，2:山農030713,3:Am3，4:山農05078，箭頭示特異帶)。圖5.引物phv29的擴增結果(M:DL2000Marker，1:中國春，2:Am3，3:山農030713，4:山農05078，5:硬簇麥，6:簇毛麥)。具體實施例方式農藝性狀鑒定按照國家區域試驗小麥品種田間性狀調查標準，對株高、株型、莖稈、穗型、穗長、每穗小穗數、穗粒數、不結實小穗數、芒的有無等農藝性狀進行調查。白粉病的鑒定利用小麥白粉菌優勢菌株15號分別在田間和溫室進行苗期和成株期人工接種鑒定。以感病品種銘賢169為對照并種成感染行，在感染行內接種白粉病15號菌種，當其大量繁殖后采集菌種抖灑在待鑒定材料葉片上，同時借助感染行進行誘發感染。反應型按照盛寶欽提出的0-4級分級標準記載。其標準如下0級免疫；植株無病斑，無侵染癥狀；1級高抗；病斑小，倒四葉菌絲小而少，菌絲層稀薄可見綠色葉面，偶見較大病斑，但仍透綠，產孢量極少；2級中抗；倒三葉、倒二葉感病，葉片病斑直徑小于lmm，下部葉片菌絲少而薄；3級中感；旗葉感病，葉片病斑多，但病斑不連片，直徑大于lmm，下部葉片菌絲大而厚；4級高感；穗部或旗葉感病，葉片病斑直徑一般大于lmm，菌絲層厚，產孢量多，病斑連片。基因組DNA提取和純化(1)取5g葉片置液氮中速凍后研成粉末，裝入50ml離心管。(2)加入20ml已預熱到65。C的提取液(lOOmMTris.HC1pH8.5，100mMNaCl，50mMEDTApH8.0，2%SDS)。每管中加入100ii110mg/ml蛋白酶K，混勻。(3)置65t:水浴中l-2h，不時輕輕倒轉離心管以混勻。(4)從水浴中取出離心管，加入20ml酚/氯仿(1:1)抽提，輕輕混勻20min。(5)3000轉/分離心20min，取上清，加入等體積氯仿，輕輕混勻。(6)3000轉/分離心20min，取上清，加入0.6體積異丙醇，輕輕混勻，用玻璃鉤將DNA纏出，70X酒精沖洗，稍氣干，溶于500ml1XTE。(7)加入10ii110mg/mlRNA酶，輕輕混勻，置37°Clh。(8)加入5ml酚/氯仿抽提，3000轉/分離心15min，取上清。(9)加入等體積氯仿抽提，3000轉/分離心15min，取上清。(10)加入1/10體積3M醋酸鈉，混勻，然后加入2倍體積冷乙醇，混勻。(11)用玻璃鉤鉤出DNA，70X酒精沖洗，置于1.5ml離心管，氣干，溶于1XTE，測DNA濃度經瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質量。SSR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>SSR擴增程序擴增反應在TaKaRaPCRThermalCyclerTP600上進行，擴增程序為95。C預變性5min，95。C變性lmin，50°C、55°C、60°C(因引物不同而異)復性lmin，72。C延伸lmin，共34個循環，最后72t:延伸5min。擴增結束后，置于4。C保存待檢測。簇毛麥特異引物M2、Xgwm301和phv29的合成、反應體系和反應程序分別參照遲世華(麥類作物學報，2006，26(4):1-5)、劉成(遺傳，2006，28(12):1573-1579)和曹愛忠(西北植物學報，2007，27(6):1078-1084)等方法。擴增產物的檢測擴增產物在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩壓110V電泳，銀染顯色，然后用TanonGis-2010型凝膠成像系統照相觀察。硝酸銀染色步驟(1)電泳完畢，取下膠塊在固定液中固定3min。(2)用去離子水快速沖洗2-3次，每次30-40S。(3)于銀染液中染色5-7min。(4)用水快速沖洗(10S)，不超過20S。(5)放入顯影液中顯影至第一條帶出現(一般以泳道出現為準)。(6)最后放入去離子水中停影。數據分析根據最大似然法計算重組率(莫惠棟，1984)，并按Kosambi(1944)系數將重組率轉化為CentiMorgan(cM)。權利要求小麥-簇毛麥新種質山農05078的SSR標記，其特征在于山農05078來自硬簇麥和Am3的雜交后代，高抗白粉病，SSR分子標記結果證明其染色體組成為AABB，且含有粗山羊草D基組和簇毛麥V基組的遺傳物質，山農05078可以在小麥的遺傳改良過程中作為優良的抗源和優質源加以利用。全文摘要本發明利用SSR標記技術對從Am3和硬簇麥雜交后代獲得的籽粒蛋白質含量高且高抗白粉病、銹病的種質系山農05078進行了SSR標記，并對其白粉病抗性基因性質和來源進行分析，建立白粉病抗性基因的分子標記，為其在小麥遺傳改良中的應用打下基礎。文檔編號C12Q1/68GK101760509SQ20081016029公開日2010年6月30日申請日期2008年11月19日優先權日2008年11月19日發明者李祥申請人:李祥