一種真菌泛素交聯酶活性的多肽、其編碼序列及制備方法和應用的制作方法

專利名稱：：一種真菌泛素交聯酶活性的多肽、其編碼序列及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體地說，本發明涉及真菌楊樹菇C4gracy6eaegw/to)泛素交聯酶基因序列。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽及其制備方法，同時還涉及多肽在醫藥、抗腫瘤中的應用。
背景技術：
：楊樹菇G4grac^^aegen'to)隸屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、糞銹傘科、田蘑屬。又名柱狀田頭菇、楊樹菇、茶薪菇、柳松茸等。富含人體必需的八種氨基酸，其中賴氨酸高達1.75%，其營養價值超過香菇、金針菇等其他食用菌，同時又具有獨特的藥用價值，民間常用于抗癌、降壓，治療胃冷、腎炎、水腫等有獨特療效，有"中華神燕"之美譽，但其中的藥理成分并不明確，本發明中涉及的楊樹菇泛素交聯酶是我們首次發現的重要藥理成分。泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomepathway,UPP)是細胞內蛋白質選擇性降解的重要途徑，UPP通路包括泛素、泛素激活酶(Ub-activatingenzyme,El)、泛素交聯酶(Ub-conjugatingenzymes,E2)、泛素連接酶(Ub-proteinligases，E3)、蛋白酶體(proteasome)復合體等。2004年諾貝爾化學獎授予了在"泛素介導的蛋白質降解過程研究"中做出開創性貢獻的三位科學家。泛素分子主要通過泛素活化酶、泛素結合酶和泛素-蛋白連接酶與靶蛋白結合形成一條多泛素鏈，將底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶體所識別和降解。UPP可高效并高選擇性地降解細胞內蛋白質,尤其是一些短壽命的細胞周期調節蛋白、癌基因和抑癌基因產物以及變性變構蛋白等。泛素化過程是真核細胞內重要的蛋白質質控系統，參與細胞的多種生理活動過程，比如細胞凋亡、MHCI類抗原的遞呈、細胞周期以及細胞內信號傳導等,對維持細胞正常的生理功能具有十分重要的意義。當泛素-蛋白酶體系統對靶蛋白的降解功能失常時，可以引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白異常降解、突變細胞凋亡受阻和增殖加速，從而導致腫瘤的發生。UPP的異常改變不僅與惡性腫瘤的病因學有著直接關素，并且與惡性腫瘤的發展和預后有著密切的關系。在UPP通路中，蛋白酶體己經作為抗腫瘤藥物的設計靶點，蛋白酶體抑制劑Bortezomib(Bz)已經實驗和臨床證明是一種有效的新的抗癌治療藥物，它抑制26S蛋白酶體活性，阻斷UPP和誘導胱冬肽酶(ca印ase)活化，可以作為UPP研究的有利工具和具有潛在的抗腫瘤和抗炎作用。而UPP通路中的其他成分還沒有作為抗腫瘤藥物設計靶點的報道。本發明中提供一種真菌來源的泛素交聯酶，具有誘導腫瘤細胞凋亡的活性，是UPP通路中針對E2組分的抗腫瘤活性蛋白。
發明內容本發明的一個目的在于提供一種多肽核苷酸序列，該序列能編碼上述楊樹菇泛素交聯酶多肽序列。該序列與SEQIDNO.1中1-456位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQIDNO.1中l-456位的核苷酸序列雜交。70%的同源基因可以通過突變試劑盒進行突變，或者通過插入，缺失等基因操作獲得。較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列，最佳地，該序列具有SEQIDNO.1中1-456位核苷酸序列編碼具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。該序列是首次克隆，根據該序列可以設計引物，通過PCR或RT-PCR的方法大量擴增該核苷酸序列，連接于表達載體，生產楊樹菇泛素交聯酶。本發明的另一個目的在于提供一種真菌泛素交聯酶活性的多肽(SEQIDN0.2)所示的氨基酸序列，該多肽具有多種活性抗腫瘤活性，在醫藥上具有廣泛的應用價值。該泛素交聯酶是報道的第一個具有抗腫瘤活性的泛素交聯酶。本發明還涉及一種楊樹菇泛素交聯酶多肽的制備方法，該方法是構建原核表達載體，利用親和層析方法純化楊樹菇泛素交聯酶，該方法簡便，成本低廉。本發明還涉及一種真菌泛素交聯酶活性的多肽(SEQIDNO.2)所示的氨基酸序列在作為制備治療或預防宮頸癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤疾病藥中的應用。它可以抑制多種腫瘤細胞的生長，殺死腫瘤細胞，對腫瘤細胞的抑制作用優于或類似于臨床應用的化療藥物阿霉素效果，該泛素交聯酶有開發成抗腫瘤藥物的潛力。為實現上述任務，本發明采用以下技術措施本發明的一個目的是提供一種新的核苷酸序列，該序列編碼一種新的楊樹燕泛素交聯酶。在本發明中，真菌楊樹菇泛素交聯酶的CDNA核苷酸序列是以楊樹菇總RNA或mRNA為模板，通過RT-PCR方法得到的。具體方法如下楊樹菇菌種為福建省三明真菌研究所提供的栽培種Ag21(食用菌學報，1999，6(3):1-7，取楊樹菇的新鮮菌絲或子實體，提取總RNA或mRNA為模板(市售的提取RNA和mRNA試劑盒，如Clontech，Promega，Stratagene等公司產品，按照說明書操作)，合成逆轉錄引物5'gaccacgcgtatcgatgtcgact16(a/c/g)3'，進行逆轉錄得到cDNA第一鏈。根據楊樹菇泛素交聯酶cDNA序列，設計引物5'atggggtctgtatccgcaagac3，為正向弓|物，以5，gaccacgcgtatcgatgtcgac3，為反向弓|物，以上述cDNA第一鏈為模板，進行PCR，獲得600bp的目的片段，將此片段克隆測序，得到SEQIDNO.1的cDNA序列。本發明所要求保護的與上述cDNA序列至少有70%的同源性的基因可以通插入，缺失、突變等基因操作獲得。如可以在設計PCR引物時，在SEQIDNO.1提供的序列基礎上，可以任意進行插入，缺失和突變的引物合成，用該引物進行PCR,則可以得到至少有70%同源性的基因。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列，最佳地，該序列具有SEQIDNO.1中1-456位的核苷酸序列。根據SEQIDN0.11-456位的核苷酸序列，設計引物，引物通常為包含l-20位核苷酸序列，和與436—456位互補的核苷酸序列，通過PCR或RT-PCR的方法大量擴增該核苷酸序列。本發明要求保護的楊樹菇泛素交聯酶活性的多肽可用如下方法生產。該方法包括以下具體的操作按照常規實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版社中所述的條件進行。一種楊樹菇泛素交聯酶多肽的制備方法，它包括下列步驟1)提取楊樹菇的總RNA或mRNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈，以此鏈為PCR模板，擴增得到序列為SEQIDNO.l所示的全長序列；2)酶切步驟1得到的序列和原核表達載體，構建重組表達載體，獲得與cDNA至少有70%同源性的基因序列在SEQIDNO.1的1-456序列基礎上，根據需要，以其中的任意一段序列(一般為20-40bp，也可以長達100bp)為PCR引物，有目的的在引物合成時引入堿基的插入，缺失和突變，用該引物與SEQIDNO.1中設計酶切位點的兩端序列(436—456序列，或436—456互補序列，或1一20序列，或1一20互補序列)為一對引物，進行PCR擴增可以在原序列中有目的的引入堿基的插入，缺失和突變，得到與cDNA至少有70X同源性的基因序列，獲得重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞。3)將步驟2中得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，形成表達楊樹燕泛素交聯酶的重組細胞，酶切原核表達載體pET28b(市售，Novagen公司，也可以用市售的其他的各種表達載體)，連接酶切后的cDNA序列和表達載體pET28b，構建重組表達載體pET28—楊樹菇泛素交聯酶；4)將步驟3中得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞BL21(市售，Novagen公司，可以根據所用的表達載體選擇匹配的宿主細胞)，形成表達楊樹菇泛素交聯酶的重組細胞；5)將歩驟4中得到的重組細胞在37"C培養過夜獲得飽和培養物；將50pL飽和培養物接種于5mL含氨芐青霉素100pg/mL的培養基中，于37'C培養2小時。取lmL培養物轉移至微量離心管中。加異丙基硫代半乳糖苷IPTG至終濃度為lmmol/L，對培養物進行誘導，誘導10小時。6)利用Ni2+親和層析法純化蛋白，分離，純化步驟5中在重組細胞中誘導表達具有所示的氨基酸序列的多肽。該多肽為SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。純度檢測可以用SDS-PAGE方法檢測。本發明要求保護的楊樹菇泛素交聯酶活性的多肽可以抑制宮頸癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌腫瘤細胞的生長，殺死腫瘤細胞。基本純的該泛素交聯酶多肽或其變異形式可以單獨、或以不同的比例加入其他抗腫瘤藥物形成口服的、靜脈注射或瘤內注射的抗腫瘤藥物。在本發明中，"分離的"、"純化的"或"基本純的"DNA指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且己經與細胞中伴隨的蛋白質分開。在本發明中，術語"楊樹菇泛素交聯酶(或多肽)編碼序列"指編碼具有楊樹菇泛素交聯酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中1-456位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.l序列的編碼框卜456位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.l中1-456位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。該術語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下能與SEQIDNO.1中核苷酸1-456位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸1-456位核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有楊樹菇泛素交聯酶功能蛋白的SEQIDNO.1所示的氨基酸序列中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3，端添加數個(通常以120個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。如實施例3中，構建的表達載體轉錄的核苷酸序列在SEQIDNO.1核苷酸5'端缺失90個核苷酸，3'端缺失63個核苷酸,表達產物保持原蛋白的85%抗腫瘤活性。在本發明中，"基本純的"蛋白質或多肽是指其占樣品總物質的至少20%,較佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC方法測量多肽的純度。在本發明中，術語"楊樹菇泛素交聯酶多肽"指具有楊樹菇泛素交聯酶活性的SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，該術語還包括具有與楊樹燕泛素交聯酶相同功能的、SEQIDN0.2所示的氨基酸序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為40個以內，較佳地為20個以內，更佳地為IO個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。如實施例3中，構建的表達載體表達的重組蛋白在SEQIDNO.2序列的N端缺失了30個氨基酸，C端缺失21個氨基酸，表達產物保持原蛋白的抗腫瘤活性。該術語還包括楊樹燕泛素交聯酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與楊樹菇泛素交聯酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗楊樹菇泛素交聯酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含楊樹菇泛素交聯酶多肽的可溶性片段。通常，該片段具有楊樹菇泛素交聯酶多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。本發明還提供楊樹菇泛素交聯酶或多肽的類似物。這些類似物與天然楊樹燕泛素交聯酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可以通過定點誘變法或其他分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L一氨基酸的殘基(如D—氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y—氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化，如那些在多肽的合成和加工中和進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。本發明還包括楊樹菇泛素交聯酶多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可以用于抑制細胞內楊樹菇泛素交聯酶的表達。本發明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有楊樹菇泛素交聯酶多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼楊樹菊泛素交聯酶的核酸分子。本發明還包括檢測楊樹菇泛素交聯酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合，較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于楊樹菇泛素交聯酶多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間，引物長度一般為20-50個核苷酸。另一方面，本發明還包括對楊樹菇泛素交聯酶或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結合于楊樹菇泛素交聯酶基因產物或片段。較佳地，指那些能與楊樹燕泛素交聯酶基因產物或片段結合但不識別和結合與其他非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制楊樹菇泛素交聯酶的分子，也包括那些并不影響楊樹菇泛素交聯酶的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的楊樹菇泛素交聯酶基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳過程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的楊樹菇泛素交聯酶基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達楊樹菇泛素交聯酶或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發明的抗體包括能阻斷楊樹燕泛素交聯酶功能的抗體以及不影響楊樹菇泛素交聯酶功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用楊樹菇泛素交聯酶基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與楊樹燕泛素交聯酶基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(如E.coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。本發明的優點和效果-本發明中提供的楊樹菇泛素交聯酶核苷酸序列和蛋白質序列是一種新的泛素交聯酶的基因和蛋白質序列，未見報道，尤其第一個從藥用真菌中報道的泛素交聯酶。到目前為止，已發現的泛素交聯酶都僅報道了在泛素一蛋白酶體通路中的作用等，沒有報道抗腫瘤活性。因此，本發明的優點是"新"——本發明是一種新的，第一個報道具有抗腫瘤活性的泛素交聯酶，可以應用在醫藥領域。本發明中涉及的楊樹菇泛素交聯酶蛋白具有很強的抗腫瘤活性。在相同的濃度下，對HeLa(宮頸癌細胞)、HepG2(肝癌細胞)、SGC-7901(胃癌細胞)的抑制效果優于臨床使用的化療藥物阿霉素，對Colo320(直腸癌細胞)、PC-3(前列腺癌細胞)和MCF-7(乳腺癌細胞)的抑制效果與阿霉素相當。對荷S180骨肉瘤的小鼠進行治療，可以延長小鼠的生存時間，對腫瘤生長的抑制率為41.3%。因此，該蛋白及其基因在開發抗腫瘤藥物方面將有很大的應用價值。圖1為一種pET28-楊樹菇泛素交聯酶的構建示意圖。圖中UBC為楊樹薛泛素交聯酶的基因，pGEM-UBC為UBc的保存質粒。首先設計含有NcoI和XhoI酶切位點的上下游引物，以質粒pGEM-楊樹菇泛素交聯酶為模板，進行PCR，得到兩端含有NcoI和XhoI酶切位點的PCR產物，用NcoI和XhoI酶分別消化PCR產物和pET28b質粒，根據回收的量進行連接反應，使UBC插入pET28b的多克隆位點，完成pET28—楊樹菇泛素交聯酶(pET28b-UBC)表達載體的構建。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件，《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版社中所述的條件進行，或按照制造廠商所建議的條件。編碼楊樹菇泛素交聯酶核苷酸序列的制備方法，楊樹薛泛素交聯酶多肽制備方法，楊樹菇泛素交聯酶多肽截短體制備方法及活性實施例，抗體制備實施例，抗腫瘤實施例。實施例1楊樹菇泛素交聯酶的cDNA克隆和測序本實施例中得到一新的cDNA序歹ij，是前人未報道過的。1.引物擴增以楊樹菇總RNA為模板，用寡核苷酸A:5'gaccacgcgtatcgatgtcgactl6(a/c/g)3'為逆轉錄引物進行逆轉錄，得到cDNA的第一鏈，以寡核苷酸B:5，atggggtctgtatccgcaagac3'為正向引物，寡核苷酸C:5'gaccacgcgtatcgatgtcgac3，為反向引物，進行PCR，PCR條件為95°C起始10min，進入三步循環(95°Clmin，53。Clmin，72°C2min共30個循環)，最后72。C延伸10min。20^L反應體系包含l嗎cDNA，0.2mMdNTP，20pM正向引物和反向引物，2pL10Xbuffer,lpLTaq酶和1.5mMMgCl2。PCR產物為一600bp目的片段。2.克隆測序根據該pGEM-Teasy載體(Promega公司產品)的操作手冊，將該擴增片段克隆到pGEM-Teasy載體上，構建質粒pGEM-楊樹菇泛素交聯酶(pGEM-UBC)，進行測序，共600bp，詳細序列見SEQIDNO.l，其中1-456為編碼氨基酸序列的開放閱讀框序列。根據得到的cDNA序列翻譯出楊樹菇泛素交聯酶的氨基酸序列，共152個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQIDN0.2。實施例2楊樹菇泛素交聯酶在大腸桿菌中的表達、純化本實施例中可以得到大量表達、純化的蛋白質樣品。首先設計含有NcoI和XhoI酶切位點的上下游引物，以質粒pGEM-楊樹恭泛素交聯酶為模板，進行PCR，得到兩端含有NcoI和XhoI酶切位點的PCR產物，用NcoI和XhoI酶分別消化PCR產物和pET28b質粒，回收楊樹菇泛素交聯酶片段和目的質粒，根據回收的量進行連接反應，構建原核表達載體pET28b—楊樹菇泛素交聯酶(Pet28b-UBC)，如圖1所示。按照前述的原核表達方法，根據不同時間誘導表達重組楊樹菇泛素交聯酶的結果，選擇優化時間，大量表達。利用Ni柱純化重組楊樹燕泛素交聯酶，表達量約為3—4mg/L。實施例3楊樹菇泛素交聯酶截短體(AUBC)的制備及活性測定本實施例中得到大量表達、純化的楊樹菇泛素交聯酶截短體(AUBC)(N端截短30個氨基酸，C端截短21個氨基酸)的樣品，該樣品保留了大部分的抗腫瘤活性和酶活性。以編碼核酸序列的第63—84位核酸設計含有NcoI酶切位點的3，引物，以編碼核酸序列的第406—423位核酸設計含有終止密碼子和XhoI酶切位點的5'引物，以質粒pGEM-楊樹菇泛素交聯酶(pGEM-UBC)為模板，PCR擴增，得到兩端含有NcoI和XhoI酶切位點的PCR產物，用NcoI和XhoI酶分別消化PCR產物和pET28b質粒，回收楊樹菇泛素交聯酶片段和目的質粒，根據回收的量進行連接反應，構建原核表達載體pET28b—截短楊樹菇泛素交聯酶(Pet28b-AUBC)，該表達載體的編碼序列為原編碼序列的63—423位核甘酸序列，表達產物AUBC為原蛋白序列的21—141位氨基酸序列。AUBC的氮基酸序列和編碼核苷酸序列為UBC的氨基酸序列和編碼核苷酸序列的79.6c/。。.對AUBC和UBC酶活性和抑制HeLa細胞生長活性測定比較如圖l所示，AUBC保留了UBC82.3X的酶活性，保留了UBC85.6。/。的抑制HeLa細胞生長的活性。因此，本實施例說明UBC的氨基酸序列同源性為8(m的AUBC氨基酸序列保留了大部分的抗腫瘤活性。圖lAUBC和UBC酶活性和抑制HeLa細胞生長活性比較樣品酶活性抑制HeLa細胞生長活性UBC100%100%AUBC82.3%±6.7%85.6%±5.3%實施例4楊樹菇泛素交聯酶抗體的制備該實施例可以獲得楊樹菇泛素交聯酶的多克隆抗體，用于檢測楊樹菇泛素交聯酶。將天然蛋白和實施例2中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組蛋白用層析法進行分離后備用，也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund's佐劑乳化。用50-100ug/0.2mL乳化過的蛋白，對小鼠進行皮下注射。14天后，用非完全Freund's佐劑乳化同樣抗原，對小鼠以50-100ug/0.2mL的劑量進行皮下注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行3次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外結合楊樹菇泛素交聯酶基因翻譯產物的能力加以評估(Western方法)。實施例5楊樹菇泛素交聯酶對腫瘤細胞和荷瘤小鼠腫瘤組織的抑制作用本實施例中楊樹菇泛素交聯酶抑制檢測的7種腫瘤細胞株，證實楊樹菇泛素交聯酶具有廣普抗腫瘤作用；抑制荷S—180肉瘤小鼠的腫瘤組織生長，延長荷瘤小鼠的生存時間，證實楊樹菇泛素交聯酶對荷瘤動物的腫瘤組織有抑制生長作用。l.楊樹菇泛素交聯酶在體外對腫瘤細胞株的抑制作用本實施例檢測了楊樹菇泛素交聯酶對7種腫瘤細胞株(SW480,HeLa,SGC-7901,MGC80-3，BGC-823,HL-60andS-180)生長的抑制活性。所有的腫瘤細胞株在RPMI1640培養基(其中包含10%的胎牛血清，100mg/mL鏈霉素和100U/mL的青霉素)中培養。將不同濃度的楊樹菇泛素交聯酶(以培養基配制成5，10，50，100ug/mL)加入腫瘤細胞中，溫育24小時后，用MTT方法檢測楊樹菇泛素交聯酶對腫瘤細胞生長的抑制作用。檢測結果如表2中所示。楊樹恭泛素交聯酶對所檢測的腫瘤細胞株有很好的抑制作用，對HeLa，Colo320和SGC-7901細胞的抑制效果優于化療藥物阿霉素，在PC-3，MCF-7，HepG2等多種腫瘤細胞中表現出與化療藥物阿霉素在相同的濃度下具有相似的抑制率。表2楊樹菇泛素交聯酶(UBC)在體外對腫瘤細胞的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.楊樹菇泛素交聯酶對荷瘤小鼠腫瘤組織生長的抑制作用在本實施例中，采用BALB/c小鼠(7周，20克)，在腋窩皮下接種0.1mL小鼠骨肉瘤細胞S-180(1.18Xl08cells/mL)，接種3天后，瘤內注射楊樹菇泛素交聯酶(以生理鹽水溶解1.67mg/mL，注射0.06mL)O.lmg/只小鼠，對照注射生理鹽水。此后，隔天注射。在接種腫瘤20天后處死小鼠。切下腫瘤稱重，計算抑制率。抑制率(％)=[(C—r)/C]X100。/。(C是對照組平均腫瘤重量，T為治療組腫瘤的平均重量)。結果如表3所示。楊樹菇泛素交聯酶對處理的小鼠的腫瘤的抑制率可達36.36%，并且延長了荷瘤小鼠的壽命。表3楊樹菇泛素交聯酶對荷S—180瘤小鼠腫瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明分上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。SEQUENCELISTING<110>武漢大學<120〉一種真菌泛素交聯酶活性的多肽、其編碼序列及制備方法和應用〈130〉一種真菌泛素交聯酶活性的多肽、其編碼序列及制備方法和應用<160>2<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>456〈212〉DNA〈213〉楊樹菇〈400〉1stggggtctgtatccgcaagacgcttagccaagg犯ctgcggg卿ttC3gtccgagggt60tgtcccgttggtatcacactggtcgatgccagcgacttctcgaagtggUgtttacgata120gaggtcstgggtaactcccaccctccaattcagattcgat180gctcagtacccaatatcatcgcccgctgtccagttcgtcgtcacagatggg卿g犯gcg240cccgtccatccacatgtttactctaatgggcacatctgtgcatcgatctt300tggtcacccgtcctgagcgtaatcgcggtttgtgtgactctacagagcatgctagcatcg360aggaacggccagcggacaacgacagatacgtacgaactgctccagataac420ccg肌g犯肌cactcttccatt3tg3tg3tgacacg456〈210〉2<211〉152〈212〉PRT〈213〉楊樹菇<400〉2MetGlySerValSerAlaArgArgLeuAlaLysGluLeuArgGlulie151015GinSerGluGlyCysProValGlylieThrLeuValAspAlaSerAsp202530PheSerLysTrpLeuPheThrlieGluValMetGlyAsnSerGinTyr354045GinGlyGluAlaTyrThrLeuGinPheArgPheAspAlaGinTyrPro505560lieSerSerProAlaValGinPheValValThrAspGlyLysGluAla65707580ProValHisProHisValTyrSerAsnGlyHislieCysAlaSerlie859095LeuGlySerGluTrpSerProValLeuSerVallieAlaValCysVal100105110ThrLeuGinSerMetLeuAlaSerCysLysLysLysGluArgProAla115120125AspAsnAspArgTyrValArgThrAlaProAspAsnProLysLysThr130135140LeuPheHisTyrAspAspAspThr145150權利要求1、一種分離的編碼真菌泛素交聯酶的核苷酸序列，其序列為SEQIDNO.1所示核苷酸序列。2、一種分離的多肽，其序列為SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。3、一種真菌泛素交聯酶活性的多肽制備方法，它包括下列步驟A、提取楊樹菇的總RNA或mRNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈，以此鏈為PCR模板，擴增得到序列為SEQIDNO.1所示的全長序列；B、酶切歩驟A得到的序列和原核表達載體，構建重組表達載體；C、將步驟B中得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，形成表達楊樹菇泛素交聯酶的重組細胞；D、將步驟C中得到的重組細胞在37'C培養過夜獲得飽和培養物，將50pL飽和培養物接種于5mL含氨芐青霉素lOOpg/mL的培養基中，于37'C培養2小時，取lmL培養物轉移至微量離心管中，加異丙基硫代半乳糖苷IPTG至終濃度為1mmol/L，對培養物進行誘導，誘導10小時；E、利用Ni"親和層析法純化蛋白，分離，純化步驟D中在重組細胞中表達的多肽。4、權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防宮頸癌藥物中的應用。5、權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防胃癌藥物中的應用。6、權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防乳腺癌藥物中的應用。7、權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防直腸癌藥物中的應用。8、權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防前列腺癌藥物中的應用。9、權利要求2所述的一種分離的多肽在制備治療或預防肝癌藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種真菌泛素交聯酶活性的多肽、其編碼序列及制備方法和應用。該分離多肽的編碼序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，其步驟是，首先是提取楊樹菇的總RNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增，得到PCR產物；其次是酶切得到PCR產物和原核表達載體，構建重組表達載體；第三是將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌宿主細胞，得到表達楊樹菇泛素交聯酶的重組細胞；第四是將得到的重組細胞誘導培養過夜獲得飽和培養物；等五是利用Ni²⁺親和層析法純化蛋白，分離，純化在重組細胞中表達的多肽。多肽作為制備治療或預防腫瘤疾病藥中的應用。涉及的蛋白質具有抗腫瘤活性。在開發抗腫瘤藥物方面有很大的應用價值。文檔編號C12N15/52GK101392262SQ20081019712公開日2009年3月25日申請日期2008年9月28日優先權日2008年9月28日發明者劉洪洪,慧孫,榮欒,一梁,陳義杰申請人:武漢大學