過氧化氫酶活性的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種過氧化氫酶活性的檢測方法，屬于酶活性檢測方法領域。所述的過氧化氫酶活性的檢測方法，包括以下步驟：將過氧化氫酶標準品稀釋成一系列酶活性濃度的標準液，取10mL過氧化氯磷酸緩沖液于100mL碘量瓶中，置25℃水浴中保溫，然后加入2mL酶標準液，準確保溫3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸終止反應，對照反應液對照管先加2mL0.5mol/L硫酸終止反應后加酶液。然后取上述反應液0.1mL加2.9mL過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液于測試管中搖勻，在25℃下用分光光度計在436μm處先用空白試測管調零后再測定各反應液測試管的吸光度，得到標準酶活性與吸光度關系曲線。按上述相同的方法處理測試酶，根據其吸光度與標準曲線可得到測試酶的酶活性。本發明所述的檢測方法具有準確、實用性強、儀器要求簡單，適用于常規條件下的操作的特點，是測定過氧化氫酶活力顯色法中一種可靠方法。
【專利說明】過氧化氫酶活性的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種過氧化氫酶活性的檢測方法，屬于酶活性檢測方法領域。
【背景技術】
[0002]隨著科學的發展和社會的進步，過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的用途越來越廣泛。它較多分布于動植物細胞內，需氧微生物代謝過程也會有大量的過氧化氫酶產生，其產生和存在是一動態過程。動物肝臟細胞代謝產生的過氧化氫多，此酶也有大量積蓄，從動物肝臟提取是制備過氧化氫酶的一個重要途徑；細菌和霉菌在發酵過程中也會有大量的過氧化氫酶釋放于胞外，積蓄于發酵液中，通過生化制備方法得到純度較高的可應用于工業和醫學界的過氧化氫酶。
[0003]過氧化氫是一種強氧化劑，目前已在紡織業較多應用漂白脫色，而多余的過氧化氫可用過氧化氫酶去掉，這樣做非常符合于環保的要求。醫學上也可用低濃度過氧化氫清除壞死組織，然后再用過氧化氫酶反應多余的過氧化氫。葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶復合制劑還可用于防治動物腸道、胃部由細菌引起的一些疾病。因此過氧化氫酶的酶活力測定對于研究和應用此酶的領域顯得十分重要。
[0004]目前應用較多的測定方法是滴定法、紫外速率法等，這幾種方法在一般操作應用中都會受到某種條件限制。因此研究一種準確度高、重復性高、操作簡便、適用于常規條件下的操作的過氧化氫酶活性的檢測方法很有必要。
【發明內容】
[0005]本發明旨在提供一種準確度高、重復性高、操作簡便、適用于常規條件下的操作的過氧化氫酶活性的檢測方法。
[0006]所述的過氧化氫酶活性的檢測方法，包括以下步驟:
將過氧化氫酶標準品稀釋成一系列酶活性濃度的標準液，取1mL過氧化氯磷酸緩沖液于10mL碘量瓶中，置25°C水浴中保溫，然后加入2mL酶標準液，準確保溫3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸終止反應，對照反應液對照管先加2mL0.5mol/L硫酸終止反應后加酶液。然后取上述反應液0.1mL加2.9mL過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液于測試管中搖勻，在25°C下用分光光度計在436 μ m處先用空白試測管調零后再測定各反應液測試管的吸光度，得到標準酶活性與吸光度關系曲線。按上述相同的方法處理測試酶，根據其吸光度與標準曲線可得到測試酶的酶活性。
[0007]優選的，本發明所述的過氧化氫磷酸緩沖液配制方法為取lmL30%過氧化氫，用0.01mol/L、pH6.8磷酸緩沖液稀釋到1000mL。
[0008]更優選的，本發明所述的過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液為0.03%過氧化物酶和I %鄰聯茴香胺甲醇溶液。
[0009]本發明所述的檢測方法，其原理是過氧化氫酶催化過氧化氫分解生成氧和水。剩余的過氧化氫在有氧供體存在下用過氧化物酶催化反應，氧供體即鄰-聯(二)茴香胺被氧化成棕色產物，于436 μ m處測量吸光率，并推算出酶活性。
[0010]本發明所述的檢測方法，經測定，從標準底物濃度OD值的曲線顯示，酶活性在23?69u/mL范圍內，隨著酶活力增加而OD值下降，呈良好的線性關系，曲線關系分辨率良好。酶活力在70u/mL以上，OD值下降很快，曲線關系分辨率下降；酶活力在22u/mL以下，OD值下降過緩，曲線關系分辨率很低。為此，本發明所述的檢測方法適用于酶活性為23?69u/mL之間的酶液的酶活性檢測。其標準品測定回收率為99.37%。
[0011]本發明所述的檢測方法具有準確、實用性強、儀器要求簡單，適用于常規條件下的操作的特點，是測定過氧化氫酶活力顯色法中一種可靠方法。
【具體實施方式】
[0012]實施例一:
標準酶液配制:將過氧化氫酶標準品稀釋成一系列酶活性濃度的標準液，備用。
[0013]過氧化氫磷酸緩沖液配制:取lmL30%過氧化氫，用0.01mol/L、pH6.8磷酸緩沖液稀釋到100mL,備用。
[0014]過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液配制:取0.3g過氧化物酶和1g鄰聯茴香胺溶于100mL的甲醇溶液中，備用。
[0015]取1mL過氧化氯磷酸緩沖液于10mL碘量瓶中，置25°C水浴中保溫，然后加入2mL酶標準液，準確保溫3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸終止反應，對照反應液對照管先加2mL0.5mol/L硫酸終止反應后加酶液。然后取上述反應液0.1mL加2.9mL過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液于測試管中搖勻，在25°C下用分光光度計在436 μ m處先用空白試測管調零后再測定各反應液測試管的吸光度，得到標準酶活性與吸光度關系曲線。按上述相同的方法處理測試酶，根據其吸光度與標準曲線可得到測試酶的酶活性。
【權利要求】
1.過氧化氫酶活性的檢測方法，包括以下步驟: 將過氧化氫酶標準品稀釋成一系列酶活性濃度的標準液，取1mL過氧化氯磷酸緩沖液于10mL碘量瓶中，置25°C水浴中保溫，然后加入2mL酶標準液，準確保溫3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸終止反應，對照反應液對照管先加2mL0.5mol/L硫酸終止反應后加酶液； 然后取上述反應液0.1mL加2.9mL過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液于測試管中搖勻，在25°C下用分光光度計在436 μ m處先用空白試測管調零后再測定各反應液測試管的吸光度，得到標準酶活性與吸光度關系曲線； 按上述相同的方法處理測試酶，根據其吸光度與標準曲線可得到測試酶的酶活性。
2.如權利要求1所述的過氧化氫酶活性的檢測方法，其特征在于所述的過氧化氫磷酸緩沖液配制方法為取lmL30%過氧化氫，用0.01mol/L、pH6.8磷酸緩沖液稀釋到1000mL。
3.如權利要求1所述的過氧化氫酶活性的檢測方法，其特征在于所述的過氧化物酶-鄰聯茴香胺溶液為0.03%過氧化物酶和1%鄰聯茴香胺甲醇溶液。
【文檔編號】G01N21/31GK104297185SQ201410577230
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】李勇, 劉文斌 申請人:西安米億生物科技有限公司