專利名稱：豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因strB的PCR檢測方法
技術領域：
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本發明涉及一種豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因WrB的PCR檢測方法，屬檢測技術領域。
背景技術：
長期以來抗菌劑(包括抗生素，硫酸銅等)被作為生長促進劑添加到飼料中，在增加動物養殖效益的同時導致高頻率的抗生素抗性細菌的出現，這些抗性細菌攜帶的抗性基因可以被轉移到在人類致病菌，這是對人類健康的潛在威脅。Aarestrup等推測禁止使用抗生素作為生長促進劑添加到豬飼料中后，在養豬場抗生素抗性細菌仍然保持高發生率的原因可能是由于銅仍然被添加到豬詞料中作為生長促進劑，它們選擇抗生素抗性細菌并維持了它們的發生率(Aarestrup， RM., H. Hasman， L. B. Jensen, " a/. 2002. Antimicrobial resistance among enterococcifrom pigs in three European countries. Appl. Environ. Microbiol. 68:4127-4129.)。鏈霉素抗性基因^"A和^"B廣泛存在與人體、動物體、和植物體的正常菌群和病原菌中(Sundin, G. W., Monks, D. E. & Bender, C. L. Distribution of thestreptomycin-resistance transposon Tn5393 among phylloplane and soil bacteria frommanaged agricultural habitats. Co" JM/cra6fo/ 41， 792-799.)，四環素抗性基因fe《B)也是一個在革蘭氏陰性細菌中常見的抗性基因(Roberts, M. C. Update on acquiredtetracycline resistance genes. F￡MS A/icrc Wo/丄e" 245， 195-203.)。這三個基因常被作為抗生素抗性基因的代表來進行檢測。
目前我國的豬飼養業仍然在飼料中添加抗生素和銅鹽、鋅鹽作為生長促進劑，這必然對豬肉產品安全造成威脅。快速檢測豬源大腸桿菌中是否存在抗性基因對評價豬肉產品安全具有重要意義。而常規PCR檢測程序需要從細胞中提取DNA樣品，耗時長，試劑消耗多，造成檢測樣品周期長成本高。本發明采用豬源大腸桿菌單菌落直接做DNA模板，實現了用PCR方法快速、經濟地檢測豬源大腸桿菌中的抗鏈霉素基因rf/"B。
經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。
發明內容
本發明的目的在于克服現有檢測方法之不足，而提供一種豬源大腸桿菌中抗
鏈霉素基因WrB的PCR檢測方法。
本發明的檢測方法包括用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備；抗鏈霉素基因^"B的引物序列；PCR反應液組成；PCR擴增反應條件；PCR
擴增產物的檢測方法。
其中，用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備方法將分離到的待檢測的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基平板上，37 。C培養18-36 h，得到單菌落。
抗鏈霉素基因WrB的引物序列為上游5'GACTCCTGCAATCGTCAAGG3，；下游5'GCAATGCGTCTAGGATCGAG3'; PCR擴增產物大小為560 bp。
PCR反應液組成10xPCRbuffer, 10 pM上游引物序，10pM下游引物序，(3)10 nM dNTP，用一個無菌的0.5-10 ^L移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入PCR反應液中混勻，1.5-3.0 U Taq酶,反應體系20-50 pL。
PCR擴增反應條件94。C預變性5-10min; 94。C變性l min、 55°C退火l min、72°C延伸2min、共進行30-35個循環；72。C延伸10min，于4。C下保存。
PCR擴增產物的檢測方法將擴增產物于0.8-2.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像分析結果。
本發明與現有技術相比，具有較好的特異性，能在5h內完成對豬源大腸桿菌樣品是否帶有抗銅基因pcoA的檢測，檢測方法快速、簡便、且經濟。本發明為評價豬肉食品安全提供了一個技術手段，有良好的運用前景。
圖l為本發明方法檢測健康豬源抗銅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因WrB的電
泳圖，其中M:分子量標準1:抗銅大腸桿菌菌株W2a62:抗銅大腸桿菌菌株W2a513:抗銅大腸桿菌菌株Wc44:抗銅大腸桿菌菌株Wlcl25:抗銅大腸桿菌菌株G6a746:抗銅大腸桿菌菌株G5d87:抗銅大腸桿菌菌株G5d288:抗銅大腸桿菌菌株G5d689:抗銅大腸桿菌菌株Fd3510:抗銅大腸桿菌菌株G5d83
圖2為本發明方法檢測健康豬源抗鋅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因WriB的電泳圖，其中M:分子量標準1:抗鋅大腸桿菌菌株G4c692:抗鋅大腸桿菌菌株G6a693:抗鋅大腸桿菌菌株EW1-14:抗鋅大腸桿菌菌株EW1-55:抗鋅大腸桿菌菌株EW6-46:抗鋅大腸桿菌菌株EW6-57:抗鋅大腸桿菌菌株EW6-68:抗鋅大腸桿菌菌株EW6-79:抗鋅大腸桿菌菌株EW6-1010:抗鋅大腸桿菌菌株LW1-7
圖3為本發明方法檢測病豬源抗銅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因^"B的電泳圖，其中M:分子量標準
1:抗銅大腸桿菌菌株1347/02-32:抗銅大腸桿菌菌株0021/03-3 3:抗銅大腸桿菌菌株227/03-14:抗銅大腸桿菌菌株193/03-15:抗銅大腸桿菌菌株1339/036:抗銅大腸桿菌菌株334/04-77:抗銅大腸桿菌菌株516/04-具體實施例方式
實施例一健康豬源抗銅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因WrB的檢測根據本發明的檢測方法，對從健康豬糞便中分離到的10株抗銅的大腸桿菌菌株進行檢測。
1. 菌落培養物的制備
將分離到的10株抗銅的大腸桿菌菌株分別劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基
平板上，37。C培養24 h，得到單菌落。
2. PCR擴增反應
反應體系10xPCR buffer, 10pM上游引物序，10^iM下游引物序，10 pMdNTP，用一個無菌的0.5-10 ^L移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入PCR反應液中混勻，1.5UTaq酶，反應體系20 pL;
b.擴增反應條件94。C預變性5min; 94。C變性l min、 55°C退火l min、 72。C延伸2min、共進行30個循環；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 產物檢測
將擴增產物于0.8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVl凝膠成像分析結果，結果見表l和圖l， 10株健康豬源抗銅大腸桿菌菌株中均檢測出560bp的擴增產物。
表l
健康豬源大腸桿菌菌株 銅抗性 抗鏈霉素基因WrB
W2a6 ^ ^
W2a51 + +
Wlc4 + +
Wlcl2 + +
G6a74 + +
G5d8 + +
G5d28 + +
G5d68 + +
Fd35 + +
G5d83 + +
6注表中所列菌株為云南大學生命科學學院微生物實驗室分離和保存。
實施例二健康豬源抗鋅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因WrA的檢測根據本發明的檢測方法，對從健康豬糞便中分離到的10株抗鋅的大腸桿菌菌
株進行檢測。
1. 菌落培養物的制備
將分離到的10株抗鋅的大腸桿菌菌株分別劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基平板上，37。C培養18h，得到單菌落。
2. PCR擴增反應
反應體系10xPCR buffer, 10pM上游引物序，10pM下游引物序，10 pMdNTP，用一個無菌的0.5-10 nL移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入PCR反應液中混勻，2.0UTaq酶，反應體系40inL;
b.擴增反應條件94。C預變性8min; 94。C變性l min、 55°C退火l min、 72°C延伸2min、共進行33個循環；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 產物檢測
將擴增產物于l.O g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVl凝膠成像分析結果，結
果見表2和圖2， 10株健康豬源抗鋅大腸桿菌菌株中均檢測出560bp的擴增產物。表2
健康豬源大腸桿菌菌株鋅抗性抗鏈霉素基因^HB
G4c69++
G6a69++
EW1-1++
EW1-5++
EW6-4+
EW6-5++
EW6陽6++
EW6-7++
EW6-10++
LW1-7
注表中所列菌株為云南大學生命科學學院微生物實驗室分離和保存。
實施實例三病豬源抗銅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因^"A的檢測
根據本發明的檢測方法，對從赤痢豬糞便中分離到的7株抗銅大腸桿菌菌株進行檢測。
1. 菌落培養物的制備
將分離到的7株抗銅大腸桿菌菌株分別劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基平板上，37。C培養36h，得到單菌落。
2. PCR擴增反應
反應體系10xPCRbuffer, 10pM上游引物序，10^M下游引物序，10 pMdNTP，用一個無菌的0.5-10 pL移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入PCR反應液中混勻，3.0UTaq酶，反應體系50
b.擴增反應條件94。C預變性10 min; 94。C變性l min、 55°C退火l min、 72°C延伸2min、共進行35個循環；72。C延伸10min，于4。C下保存。
3. 產物檢測
將擴增產物于2.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVl凝膠成像分析結果，結
果見表3和圖3， 7株病豬源抗銅大腸桿菌菌株中均檢測出560bp的擴增產物。表3
大腸桿菌菌株銅抗性O-type/serotype抗鏈霉素基因WHB
1347/02-3+045+
0021/03-3+0139+
227/03-10149:K88， K99+
193/03-1+0149+
1339/03+CM41:K85ab+
334/04-7+CM57:K82+
516/04-2+08: K87, K88+
注表中所列分離自赤痢豬糞便中，保存在云南大學生命科學學院微生物實驗室。
權利要求
1、一種用PCR檢測豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因strB的方法，其特征在于反復該包括用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備；抗鏈霉素基因strB的引物序列；PCR反應液組成；PCR擴增反應條件；及PCR擴增產物的檢測方法。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于所述的用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備為將分離到的待檢測的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基平板上，在37 。C培養18-36 h后得到單菌落。
3、 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗鏈霉素基因st/B的引物序列為上游5'GACTCCTGCAATCGTCAAGG3';下游5' GCAATGCGTCTAGGATCGAG 3 ，。
4、 如權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的PCR反應液組成為10x PCR buffer,10幽上游引物序，10幽下游引物序，10剛dNTP，用一個無菌的0. 5-10叱移液槍頭挑取一個單菌落作為DNA模板放入PCR反應液中混勻，1.5-3.0 U Taq酶，反應體系20-50 ^L。
5、 如權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述的PCR擴增反應條件包括94。C預變性5-10min; 94。C變性lmin、 55°C退火1 min、 72°C延伸2 min、共進行30-35個循環；72。C延伸10 min，于4。C下保存。
6、 如權利要求5所述的方法，其特征在于將擴增產物于0.8-2.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UV I凝膠成像分析結果。
全文摘要
本發明涉及一種豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因strB的PCR檢測方法，屬檢測技術領域。本發明的方法包括用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備；抗鏈霉素基因strB的引物序列；PCR反應液組成；PCR擴增反應條件；PCR擴增產物的檢測方法。本發明不需要提取DNA，直接用豬源大腸桿菌培養物進行PCR擴增反應檢測抗鏈霉素基因strB。本發明具有較好的特異性、可快速、經濟地檢測豬源大腸桿菌中的抗鏈霉素基因strB。本發明具有較好的特異性、可快速、經濟地檢測豬源大腸桿菌中的抗鏈霉素基因strB。
文檔編號C12Q1/68GK101560551SQ200810233790
公開日2009年10月21日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者春 侯, 放 孫, 張智輝, 竇秋燕, 貢嬌娜 申請人:云南大學