以樹鼩CD81基因構建的質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法

專利名稱：：以樹鼩CD81基因構建的質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學領域，涉及一種檢測和評價樹駒被HCV(丙型肝炎病毒)體內、體外感染前后CD81分子變化情況的方法，更具體的說，涉及一種以克隆的樹駒CD81質粒為標準物，在此基礎上建立的以Taqman探針熒光定量PCR的檢測方法。
背景技術：
：丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/體液傳播，占輸血后肝炎的70%。HCV感染是全世界范圍內造成慢性肝病的主要原因。WHO估計全球有1.7億人感染丙型肝炎病毒。在我國健康人群中抗HCV陽性率為0.7X3.1X，約3800萬人[2]。HCV感染易導致慢性化，50%80%的成人急性感染易發展為慢性肝炎，其中20%30%將發展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%4%發展成肝細胞癌。然而，到目前為止還沒有相關的疫苗和有效治愈的藥物，最主要的原因在于沒有有效的體外細胞培養體系和適合的小動物模型。致使其慢性化感染機制不清楚，導致于HCV疫苗研制，臨床治療舉步為堅。樹駒(Tupaiabelangeri，Treeshrew)大量分布于我國云南、廣西，及東南亞一帶，體型小，易飼養，繁殖快。由于生物學等級高，樹駒對許多與人類疾病相關的病毒易感，很早就被用作靈長目包括人類的疾病動物模型。近年來研究發現，在神經傳導、視覺、糖尿病、肝癌等疾病的研究中得到廣泛應用。除此之外，研究顯示樹駒不僅可以被丙型肝炎病毒(HCV)在體內感染，而且樹駒的原代肝細胞宜可以體外被感染。這樣就為HCV慢性感染機制的研究提供了良好的研究平臺。對于HCV慢性感染機制的研究，其受體的研究又是研究的最大熱點，研究表明HCV的感染由多個受體介導進入靶細胞，這些受體主要包括CD81、B族I型清道夫受體(SR-BI)、低密度脂蛋白受體(LDLr)、樹突狀細胞特異性細胞間粘附分子撲獲的非整合素分子(DC-SIGN)和淋巴細胞特異性細胞間粘附分子撲獲的非整合素分子(LC-SIGN)及最近報道的HCV輔助受體緊密連接蛋白(Claudin-1)其中CD81是對HCV受體研究中，被認為最可能的一種主要受體。CD81它屬于四跨膜蛋白(teraspanin，TM4SF)超家族成員，含有4個跨膜轉膜區和2個胞外區，在多種組織中表達，具有十分重要的生物學功能。人CD81分子量為25.8kD，其蛋白質分子有236個氨基酸殘基，有4個跨膜區(TMl-4)，一大一小兩個膜外區(EC1和EC2)，其氨基與羧基末端序列均位于細胞膜內側，EC1位于跨膜區TM1和TM2之間，形成的小環SEL高度保守，它對于EC2優勢的細胞表面表達具有非常重要的作用。EC2位于TM3禾PTM4之間，形成不同的大環LEL決定各個物種CD81的多樣性，介導CD81與HCV的結合有非常重要的作用。樹駒作為一種可能的新的HCV動物模型，在其體內和體外，HCV的感染與CD81的表達相關性如何呢，作為一種可能的動物模型就CD81表達這個層面上與人相比有什么異同呢，CD81的表達又與其它那些受體相關呢(比如Claudin-1)等等，就樹駒CD81這些分子生物學方面的到目前為止研究很少，然而要想對這些方面有更清楚的研究，那么對樹駒CD81基因表達技術的研究更為基礎。實時熒光定量PCR檢測技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，其中Taqman探針的方法更是特異性強、靈敏性高、重復性好、定量準確、速度快等特點。由于現在沒有找到合適的HCV小動物模型，并且HCV的受體和輔助受體沒有確定，致使被認為最重要的受體之一CD81的研究也僅限于對人類CD81研究局限中，樹駒作為一種很有可能成為HCV合適的小動物模型，對它的CD81的認識更是知知甚少。
發明內容鑒于現有技術中存在的空缺，本發明的目的就在于建立樹駒CD81基因熒光定量TaqmanPCR檢測方法。建立一種穩定性強、重復性好、靈敏性高的樹駒CD81檢測方法，從受體的層面，進一步證實樹駒是作為HCV研究合適的小動物模型。為HCV慢性感染化機制、HCV的藥物治療以及疫苗的研究提供一定的基礎。為了實現本發明的上述目的，本發明采取熒光定量TaqmanPCR技術，根據克隆的樹駒CD81cDNA序列，設計特異性引物和探針，建立了用于檢測樹駒CD81基因表達量的標準曲線，并驗證其在批間、批內、組間、組內四個方面的重復性問題和靈敏性。本發明提供的技術方案如下一種以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法，包括對樹駒CD81基因片段的克隆并測序，以克隆的樹駒CD81基因片段為目標，設計TaqmanPCR引物和探針，設計實驗找到最優條件下引物的退火溫度、引物濃度、探針濃度，提純樹駒CD81質粒計算CD81基因片段拷貝數，以計算好的樹駒CD81質粒用10倍梯度稀釋，配制拷貝數為l(fl(fcopies陽性質粒建立標準曲線，用該檢測體系對HCV體外感染的樹駒原代肝細胞樣品CD81的變化情況進行檢測。其中，(i;)PCR引物為兩條CD81寡聚核苷酸引物F/R:F:5'-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3'R:5'-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3'(2)以樹駒肝臟中提取的RNA為模板，獲得樹駒CD81cDNA片段，將該片段純化并測序；(3)該片段純化后，通過T-A克隆導入PMD-18T質粒中，然后轉化至大腸桿菌感受態細胞JM-109中進行擴增；篩選陽性克隆子提取克隆子并進行純化，獲得樹駒CD81分子測定的外參照陽性質粒。此外，CD81寡聚核苷酸引物和探針為CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3'CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3'CD81Probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，該方法包括(1)檢測體系退火溫度的確定，(2)檢測體系探針濃度和引物濃度的確定，(3)配置103107拷貝數的CD81質粒，以此為模板建立了該檢測體系的標準曲線，(4)在批間、批內、組間、組內四個層次驗證該方法體系的重復性和穩定性，(5)利用確定濃度的CD81質粒分別10倍梯度稀釋107、106、105、104、103、102、101、10°copies，得到動力學曲線，檢測該檢測體系的靈敏性；(6)利用該檢測體系，對不同HCV感染劑量的樹駒原代肝細胞中CD81基因進行檢測，確定不同感染劑量后的細胞中CD81的拷貝數。本發明以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法的建立，它包括的步驟概括為A對樹駒CD81基因片段的克隆并測序。B以克隆的樹駒CD81基因片段為目標，通過PrimerExpress2.0軟件在該片段上設計合適的引物和探針。C設計實驗得到最優條件下的引物的退火溫度、引物濃度、探針濃度并提純質粒計算CD81基因片段拷貝數。D以計算好的樹駒CD81質粒，以10倍梯度稀釋，配制拷貝數為103107COpieS陽性質粒建立標準曲線。E驗證本方法的重復性、穩定性和靈敏性。F通過該檢測方法對不同HCV感染劑量的樹駒原代肝細胞樣品中CD81基因進行檢測。下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明的范圍。圖1為樹駒HCV受體CD81基因片段RT-PCR電泳檢測結果。圖2為樹駒中HCV受體CD81的全基因組核苷酸序列測序結果。圖3為不同退火溫度條件下CD81基因片段擴增電泳檢測結果。圖4為不同引物濃度下CD81基因片段擴增電泳檢測結果。圖5為不同探針濃度(50nm、100nm、150nm)擴增曲線和Ct值。圖6為以IX103IX107拷貝數為模板建立的標準曲線和線性關系。圖7為批內TaqmanPCR重復性檢測擴增曲線。圖8為組間重復性檢測TaqmanPCR擴增曲線。圖9為不同濃度的樣品TaqmanPCR擴增曲線和線性關系。圖10為HCV感染劑量的樹駒原代肝細胞樣品中CD81基因檢測結果。具體實施例方式實施例1:以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法的建實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或彭秀玲等人，基因工程實驗技術，(科學技術出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。丙肝病毒的基因圖譜參考已報道的文獻如金奇主編，醫學分子病毒學(科學出版社，2001)。對樹駒CD81基因片段的克隆并測序1.PCR弓I物的設計和PCR的擴增PCR引物是根據GenBank中下載的40余條不同物種的CD81核酸序列，通過序列比對后得到保守序列，在其中設計而獲得，由美國genebase公司合成。從樹駒肝組織(lOOmg)中用TrL20LSystem(GIBCO/BRL)提取RNA，用100y1的10mMDDT加上5%RNasin(Promega)懸浮。10y1的樣品保存在-80。C用于每次RT-PCR。—步法RT-PCR反應，10XOneStepRNAPCRBuffer5iU、MgCl2(25Mm)10ii1、dNTPMixture(各10mM)5ii1、RNaseInhibitor(40U/P1)1P1、AMVRTaseXL(5U/y1)1y1、AMV-OptimizedTaq(5U/y1)1P1、外圍上游特異性引物(20yM)ly1、外圍下游特異性引物(20iiM)ly1、樹駒總RNA1y1、RNaseFressdH2024y1。以50y1反應體系，按以下條件進行RT-PCR反應50°C30min、94°C2min;然后進行40個循環擴增94°C30sec、57°C30sec72°C2min;72°C5min、-20"冰箱保存備用。擴增產物大小為711bp，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。2.PCR產物的純化使用DNAGelExtractionKit(BBI，USA)完成PCR產物的純化。具體操作步驟如下(l).配制1%瓊脂糖凝膠，將上述步驟1所得PCR產物點樣，80伏電壓電泳25分鐘。(2).紫外燈下切下含有目的DNA瓊脂糖膠塊，放入新的1.5mleppendorftube中。(3).按每400ii1/lOOmg瓊脂糖凝膠的比例加入BindingBuffer,置于50S0。C水浴中10分鐘，使膠徹底融化。(4).將融化的膠溶液轉移到套放于收集管內的純化柱中，室溫放置2分鐘。8000rpm離心1分鐘。(5).取下純化柱，倒掉收集管中的廢液，將純化柱放入同一個收集管中，加入500ii1WashSolution,8000rpm室溫離心1分鐘。(6).重復步驟(5)—次。(7).取下純化柱，倒掉收集管中的廢液，將純化柱放入同一個收集管中，12,000rpm室溫離心15秒。(8).將純化柱放入一個新的l.5mleppendorftube中，在柱子膜中央加入30y1ElutionBuffer或水(pH>7.0)，室溫或37。C放置2分鐘。(9).12,000rpm室溫離心1分鐘。純化的PCR產物儲存于-70°C，待用。3.純化產物與pMD18-T載體的連接和轉化3.1受體菌JM109感受態細胞的制備(1).從37。C培養16-20小時的JM109新鮮平板上挑取一個單菌落，轉至5mlLB培養液中，37°C，150rpm振蕩培養過夜。(2).將培養物轉至50mlLB培養液中，37°C，250rpm振蕩培養3小時。(3).將培養物轉移至離心管中，在冰上放置15分鐘，使培養物冷卻至Ot:。然后12000rpm4。C離心IO分鐘，以回收細胞。(4).棄上清，用預冷的0.1MCaCl2洗滌細胞沉淀，12000rpm離心IO分鐘；然后用10mlO.IMCaCl2懸浮菌體，冰浴30分鐘，然后12000rpm4。C離心10分鐘，以回收細胞。(5).盡量倒出上清液。然后用4ml0.1MCaCl2溶液重懸細胞。(6).于4t:放置1224小時后方可使用。制備好的感受態細胞可以直接使用或加入30^甘油分裝貯存于-7(TC，待用。3.2純化產物與pMD18-T載體的連接和轉化使用pMD18-TVector(大連寶生物工程公司)與步驟2純化的PCR產物進行連接反應先用0.2mlPCR管將0.5y1pMD18-TVector和4.5y1PCR純化產物混合均勻，再加入5ii1ligationSolutionl混合均勻，16°C連接30分鐘或過夜連接。3.3轉化感受態細胞JM109(1).將100ii1JM109感受態細胞與10ii1連接反應液輕輕混合均勻。(2).冰浴30分鐘，然后42。C熱激活90秒，再冰浴2分鐘。(3).加400ii137t:預熱的LB液體培養基，于37。C搖床振蕩150rpm培養45分鐘。(4).取培養菌液涂布含100iig/mlAmp的LB固體培養基。(5).將培養平皿放置于37t:培養12-16小時后，挑取若干(4-6個/樣品)長出的單菌落進行PCR快速鑒定。3.4陽性重組子的篩選和鑒定(1).挑取在Amp+選擇培養基上長出的菌落若干個(4-6個/樣品)，先置于含有100iig/ml青霉素的LB液體培養基中培養5ml，37。C振蕩過夜培養。(2).取500iU菌懸液，12000rpm離心1分鐘以沉淀菌體，棄上清，向沉淀中加入170ii1STET裂解液，重懸菌體。(3).煮沸裂解45秒，12000rpm離心10分鐘，小心吸取上清，棄沉淀。(4).以此上清作為模板，用nested-PCR內引物(YF2/YR2、C3/C4或El/E3)進行PCR擴增和電泳檢測。檢測到特異性條帶者即為陽性克隆。挑選陽性克隆置于50ml含有100iig/ml青霉素的LB液體培養基中進行擴大培養。3.5陽性重組質粒的提取使用MiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0(大連寶生物工程公司)完成陽性重組質粒的提取。具體操作步驟如下(1).取14ml的過夜培養菌液，l2,000rpm離心2分鐘，棄上清。(2).用250ii1的SolutionI(含RNaseAl)充分懸浮細菌沉淀。(3).加入250ii1的SolutionII輕輕地上下翻轉混合56次，使菌體充分裂解，形成透明液體。(4).加入400ii1的4。C預冷的SolutionIII，輕輕地上下翻轉混合56次，直至形成緊實凝集塊，然后室溫靜置2分鐘。(5).室溫12,000rpm離心5分鐘，取上清。(6).將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。[OO91](7).將上述操作(5)中上清液轉移至SpinColumn中l2,000rpm離心1分鐘，棄濾液。(8).將500ii1RinseA加入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒，棄濾液。(9).將700ii1RinseB加入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒，棄濾液。(10).重復操作步驟(9)。(11).將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入60ii1的ElutionBuffer,室溫靜置1分鐘。(12).12,000rpm離心1分鐘洗脫重組質粒DNA。4.重組質粒的核苷酸序列測定本研究中所有重組質粒的核苷酸序列測定均委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序工作(圖2)。5.TaqmanPCR檢測體系的建立5.1TaqmanPCR引物探針序列的設計和合成根據重組質粒片段711bp序列，利用Primerexpress.2.0設計引物和探針，弓|物跨越內含子，目的片段長度118bp。序列情況如下Tupaia-CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3，Tupaia-CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA'-3，T邵aia-CD81probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，弓I物和探針均由大連寶生物有限公司合成。5.2PCR擴增及退火溫度的確定根據本引物和探針特點分別設計退火溫度56t:、58°C、60°C、62。C確定其最佳退火溫度。采用下述反應體系和條件，以PMD-18TCD81質粒為模板應用PCR儀進行擴增PermixTaq酶Buffer25ul、DEPC處理水16ul、T邵aia-CD81FP/RP各自2ul、模板5ul混合均勻。循環次數為40個，94。C2min;94°C30s，(56°C、58°C、60°C、62°C)30s，72°Clmin，40個循環。72°C5min擴增；4。C備用。擴增產物2.5%瓊脂糖電泳檢測。通過電泳檢測結果可知不同退火溫度下都能得到112bp的擴增片段，但54t:和56t:條件下有明顯的非特異性擴增，6(TC條件下電泳條帶清晰，條帶位置正確無非特異性擴增，因此本檢測體系確定Tm=60°C(圖3)。5.3引物和探針濃度的確定引物濃度以相同條件下能夠檢測到的模板濃度最低，擴增產物條帶單一、清晰為引物選擇標準。以100nm、200nm、300nm、400nm4個不同濃度的CD81TaqManPCR上下游引物濃度，分別用于同一濃度CD81重組質粒為模板，共分為4個反應系列組，同時進行PCR擴增。反應體系為25iiL:RealtimePCRMasterMix12.5y1、T邵aia-CD81FP/RP各自2yL、DEPC處理水6yL、模板2.5y1混合均勻。循環參數為40個，循環次數為40個，94°C2min;94°C30s，X°C30s，72°Clmin，40個循環。72。C5min擴增；fC備用。擴增產物2.5%瓊脂糖電泳檢測。不同引物濃度下電泳顯示引物200nm條件下為最低濃度，該濃度能很好的擴增目的片段(圖4)。探針濃度以相同模板濃度下循環域值(Ct)最小、熒光信號比(Rn)活度最大8為探針選擇標準。采用50nm、lOOnm、150nm3個探針濃度，分別用于同一濃度CD81重組質粒為模板，進行TaqManPCR檢測。反應體系為25yL:RealtimePCRMasterMixl2.5iiL、T邵aia-CD81FP/RP各自2iiL、T邵aia-CD81probe0.5iiLDEPC處理水5.5iiL、模板2.5iiL混合均勻。循環參數為40個，循環次數為40個，94°C2min;94°C30s，X°C30s，72°Clmin，40個循環。72。C5min擴增；4。C備用。觀察擴增曲線和檢測報告。通過不同探針濃度擴增曲線和Ct值顯示，該檢測體系在100nm條件下Ct=8.45值最小，Rn最大擴增曲線良好(圖5)。5.4質粒的純化及拷貝數的測定質粒的純化步驟參見大連寶生物相關試劑盒說明書。純化質粒測其A26。/A28。(1.82.0)根據以下公式計算拷貝數拷貝數(copies/m)二質粒濃度(ug/ul)X阿氏常數/質粒分子量。阿氏常數為6.02X1023;質粒分子量二一個堿基對的分子量(649)X重組質粒的總長度(bp)。5.5TaqmanPCR標準曲線的建立將已知拷貝數的質粒按照1X1041Xl(f拷貝數濃度進行10倍系列稀釋，得到5個不同分子含量的PMD-18TCD81陽性質粒濃度樣品，分別進行TaqManPCR分析，根據反應結果中樣品的分子數的對數值及其Ct值的對應關系繪制出定量標準曲線。從上圖可知本檢測體系標準曲線擴增曲線標準，線性關系良好，其斜率-4.784，截距48.185，R2=0.9996。可得本檢測體系線形方程為Ct=-4.7841og(Copynumber)+48.185(圖6)6.TaqManPCR檢測體系的評價6.1檢測體系重復性、穩定性的評價該檢測體系重復性、穩定性從批間、批內、組間、組內四個方面設計實驗進行驗證。批間不同批次間配置的同濃度重組質粒，IO倍梯度稀釋拷貝數為103107copies各批間不同時間檢測3次(每5天一次)，分別計算它們各自曲線相關系數的變異系數。過不同批次每隔五天測定標準曲線的相關系數的變異系數為0.155%，遠小于5%可見該檢測體系變異系數小，準確性高(見表1)。表1不同批次間配置的同濃度重組質粒各自曲線相關系數的變異系數<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>批內同一批配置的一定濃度重組質粒，IO倍梯度稀釋拷貝數為1031(fcopies同時檢測6次，計算它們曲線相關系數的變異系數。通過計算同批次組內6組擴增曲線CT值的標準差為0.232，變異系數為1.079%，變異系數小重復性好(圖7)。組間對重組質粒高、中、低不同濃度(l()8copies、106copies、104copies)各3次重復同時檢測，計算它們各自Ct值變異系數。三次檢測結果Ct值的變異系數分別為0.816%、0.582%、0.308%，變異系數小重復性好(圖8)。組內對一定濃度重組質粒，以-2(TC保存隔30天重檢。計算它們Ct值變異系數。組內兩次實驗Ct值變異系數分別為1.343%和1.079%均小于5%，該檢測體系穩定性、重復性好(見表2)。表2—定濃度重組質粒的t值變異系數時間組間各ct值_標準差變異系數初檢21.3621.7321,6322,1122.1021,930.2931,343%30天重檢21.662.1.6621.5221.522L3921.(M0,2321,079%6.2檢測體系靈敏性的評價將計算得到的標準重組質粒做10倍梯度稀釋，拷貝數分別為108、107、106、105、104、103、102、101、10°COpieS，得到動力學曲線，以Ct值〉35個循環為下限檢測該檢測體系的靈敏性。通過擴增曲線圖可知本檢測體系可檢測到102拷貝數級別(圖9)。6.3樹駒原代肝細胞樣品中CD81基因進行檢測不同HCV感染齊U量1X106、5X105、3X105、1X105、5X104、3X104、1X104、5X103、3X103、lXl()5copies的樹駒原代肝細胞感染后的樣品，進行CD81基因的檢測。通過擴增曲線圖可知隨著HCV的感染劑量的增大，CD81的表達呈下降的變化(圖10)。1.CD81基因片段PCR擴增的兩條寡聚核苷酸引物序列F/R:F:5'-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3'R:5'-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3'2.以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針PCR方法中CD81寡聚核苷酸引物和探針序列為CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3'CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3'CD81Probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，3.樹駒中HCV受體CD81的全基因組核苷酸序列測序結果001ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAAGTGCATCAAGTACCTGCTCTTCGTCTTCAACTTCGTC061TTCTGGCTGGCCGGCAGGTGGATCCTAGGTGTGGCCCTTTGGCTCCGGCATGATCCACAG121ACCACCAACCTCCTCTATTTGGAGCTGGGAGACCGACCTGCACCCAATACCTTCTACGTA10181GGCATCTACATCCTCATTGCCGTGGGTGCCGTGATGATGTTCGTGGGCTTCCTGGGCTGC241TACGGGGCCATCCAGGAGTCCCAGTGCCTGCTGGGGACGTTCTTCACCTGCCTGGTGATC301CTCTTTGCCTGTGAGGTGGCCGCCGGCATCTGGGGCTTTGTCAACAAGGACCAGATCGCC361AAGGACGTGAAGCAGTTCTACGACCAGGCCCTACAGCAGGCTGTGGTGGATGACGAAGCC421AACAACGCCAAGGCCGTGGTGAAGACTTTCCACGAGACGCTCAACTGCTGTGGTTCTGGC481ACGCTGTTCACCCTGACCACCTCAGTGCTGAAGAACAACCTGTGTCCCTCAGGCAGCAAC541GTCATCAGCAACTTGTTTAAGGAGGACTGCCACCAGAAGATAGATGACCTCTTCTCTGGG601AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCGGCCATCGTGGTCGCTGTGATCATGATCTTTGAGATG661ATCCTGAGCATGGTGCTGTGCTGTGGCATCCGGAACAGCTCCGTGTACTGA權利要求一種以樹鼩CD81基因構建的質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法，包括對樹鼩CD81基因片段的克隆并測序，通過T-A克隆技術構建了PMD-18T-CD81質粒，以克隆的樹鼩CD81基因片段為目標，設計TaqmanPCR引物和探針，設計實驗找到最優條件下引物的退火溫度、引物濃度、探針濃度，提純該質粒并計算CD81基因片段拷貝數，以計算好的質粒用10倍梯度稀釋，配制拷貝數為103～107copies陽性質粒建立標準曲線，用該檢測體系對HCV體外感染的樹鼩原代肝細胞樣品CD81的變化情況進行檢測。2.根據權利要求1所述以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針PCR方法，其特征在于(1)PCR引物為兩條CD81寡聚核苷酸引物F/R:F:5'-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3'R:5'-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3'(2)以樹駒肝臟中提取的RNA為模板，獲得樹駒CD81cDNA片段，將該片段純化并測序；(3)該片段純化后，通過T-A克隆連接到PMD-18T質粒中，然后轉化至大腸桿菌感受態細胞JM-109中進行擴增；篩選陽性克隆子提取克隆子并進行純化，獲得樹駒CD81分子測定的外參照陽性質粒。3.根據權利要求1所述以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針PCR方法，其特征在于CD81寡聚核苷酸引物和探針為CD81FP:5'-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3'CD81RP:5'-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3'CD81Probe:5'(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3，4.根據權利要求1以樹駒CD81質粒為標準品的Taqman探針PCR方法，其特征在于(1)檢測體系退火溫度的確定，(2)檢測體系探針濃度和引物濃度的確定，(3)配置103107拷貝數的CD81質粒，以此為模板建立了該檢測體系的標準曲線，(4)在批間、批內、組間、組內四個層次驗證該方法體系的重復性和穩定性，(5)利用確定濃度的CD81質粒分別IO倍梯度稀釋107、106、105、104、103、102、101、10°COpieS，得到動力學曲線，檢測該檢測體系的靈敏性；(6)利用該檢測體系，對不同HCV感染劑量的樹駒原代肝細胞中CD81基因進行檢測，確定不同感染劑量后的細胞中CD81的拷貝數。全文摘要本發明涉及一種檢測和評價樹鼩被HCV(丙型肝炎病毒)體內、體外感染前后CD81分子變化情況的方法，更具體的說，涉及一種以克隆的樹鼩CD81質粒為標準物，在此基礎上建立的以Taqman探針熒光定量PCR的檢測方法。屬于分子生物學領域.。該方法包括對樹鼩CD81基因片段的克隆；在克隆的CD81基因片段上利用PrimerExpress2.0軟件設計合理的探針和引物；設計實驗找到最優條件下的退火溫度(Tm值)、引物濃度、探針濃度；進一步以樹鼩CD81質粒為標準品以10倍梯度稀釋建立了標準曲線；并且驗證了該方法重復性、穩定性和靈敏性。最后用該檢測體系，對HCV體外感染的樹鼩原代肝細胞樣品CD81的變化情況進行了檢測。該方法可以準確、快速、便捷的檢測出樹鼩CD81的變化情況。文檔編號C12Q1/68GK101691602SQ20081023373公開日2010年4月7日申請日期2008年12月22日優先權日2008年12月22日發明者馮悅,劉麗,夏雪山,趙文華,魏大巧申請人:昆明理工大學