一種培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養液的制作方法

專利名稱：一種培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養液。
背景技術：
胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells, ES細胞)是通過分離內細胞團(Inner Cell Mass, ICM)細胞或早期胚胎的原始生殖細胞(Primordial Germ Cells, PGCs)，在體
外合適的條件下抑制分化培養而得到的具有無限增殖能力，能進行自我更新
(self-renewing)，具有分化為包括生殖系細胞在內的多種細胞的潛能的未分化 細胞。ES細胞具有早期胚胎細胞的特征，在體外能進行傳代、冷凍、復蘇等操作仍 保持正常二倍體核型。自從1981年英國劍橋大學的Evans和Kaufman、美國加州大 學的Martin分別成功建立了小鼠的ES細胞系以來，胚胎干細胞的研究成為全世界 范圍內關注的焦點。1999年末，美國Science (《科學》雜志)公布的年度世界十 大科學成果評選中，"干細胞研究的新發現"榮登榜首，而人類基因組計劃工程卻 屈居第二。美國Time (《時代》周刊)將干細胞研究成果列為20世紀末世界十大 科技成就之首。干細胞尤其是胚胎干細胞的研究成為21世紀生命科學領域中最具 有發展和應用前景的一大熱門話題，已成為繼人類基因大規模測序完成后生命科學 中最活躍的領域之一。
ES細胞在生命科學多個領域都有著廣泛的用途，其中最令人興奮的是醫學應用 潛能。ES細胞具有多向分化潛能，可在體外誘導分化為各種類型的干細胞或成熟細 胞，在合適的條件下可能發育為完整器官，因此可能成為臨床組織或器官移植材料 的新來源，以取代病人體內損壞的細胞組織或器官，達到治療組織缺損、遺傳缺陷、 器官障礙等難治疾病的目的。動物實驗顯示，ES細胞來源的血液細胞、神經細胞、
心肌細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等移植入體內可發揮相應功能，體外培養膀胱組織 已經取得成功，表明ES細胞走入臨床應用已經為期不遠(Thomson, 2000)。"治 療性克隆"是ES細胞在醫學上應用的又一途徑，具體程序是將病人體細胞(如皮 膚細胞)的細胞核，移植到去核的卵母細胞內，然后使之融合，體外培養胚胎，發 育到囊胚后取其內細胞團，建成ES細胞系，再誘導分化成供醫療使用的細胞或組 織(Solter, 1999)。ES細胞研究提供了在細胞和分子水平上研究人及動物早期發育過程中相關問 題的方法，可以幫助我們解決動物發育過程中的復雜問題，促進胚胎發育細節的基 礎研究，是研究脊椎動物早期胚胎發育的理想模型，有著廣闊的應用前景。ES細胞 技術結合基因打靶技術，用來研究動物體某些基因的功能。傳統上，多用轉基因或 基因敲除動物模型作為基因功能分析方法，但周期較長。而利用ES細胞系可通過
基因缺失和過度表達兩種途徑進行研究，縮短了周期。
利用ES細胞介導的轉基因技術是目前認為最有效的轉基因途徑之一，可將所 有的優良基因直接轉入待改良的種群中，可形成有優良遺傳品質的品系和高抗病力 的品系。轉移到雞體內的基因有牛生長激素基因、人類生長因子基因、雞生長因
子基因、潮霉素抗病毒基因、雞抗馬立克抗體基因、乙酰氯霉素轉移酶基因等
(Allioili， 1994; Ebara， 2000)。
ES細胞提供了對新藥的藥理、藥效、毒理和藥物代謝等研究的細胞水平研究手 段，可大大減少藥物檢測所需動物的數量，降低成本。類胚體(EB)可用于某種新 藥或化學物質的毒性及效能的評估，這對藥理學、化肥工業等領域的發展有重要意 義。
關于雞胚胎干細胞(CES細胞)的研究是目前國際上研究的熱點之一。CES細 胞的研究具有非常重要的意義。首先，雞胚胎是研究脊椎動物早期發育的主要模型 之一。其次，CES技術的一個主要應用就是通過對ES細胞的體外遺傳操作，并篩選 陽性細胞獲得轉基因雞。通過ES途徑用商品雞生產藥物蛋白。第三，生產有生物 功能的治療性藥物。第四，進行轉基因育種。在CES細胞細胞的研究的20年里， 其ES細胞的建系很大程度上受小鼠全能或多能干細胞研究方法的影響，雞的ES細 胞系大都是通過分離培養未孵化的X期胚盤細胞或發育早期雞胚PGCs所獲得。

發明內容
本發明的目的是提供一種培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養液。 本發明提供的胚胎干細胞培養液，是將80% (體積比)大鼠肝細胞條件培養基 和20% (體積比)ES細胞基礎培養液混合得到的；
所述大鼠肝細胞條件培養基是培養BRL細胞得到的培養液； 所述ES細胞基礎培養液為高糖DMEM，含有如下溶質3. 5-4. 5g/L葡萄糖、 10-15%胎牛血清(體積比)、1.5-2. 5mM L-谷氨酰胺、0. l-O. 15mM 0-巰基乙醇、 l-1.5慮羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、抗菌素。所述ES細胞基礎培養液中，所述抗菌素具體可為青霉素、鏈霉素和慶大霉素； 所述ES細胞基礎培養液中含有100-150IU/ml青霉素、100-120 u g/ml鏈霉素、 10-12ng/ml慶大霉素。
所述ES細胞基礎培養液具體含有如下溶質4.5g/L葡萄糖、15%胎牛血清(體 積比)、2raM L-谷氨酰胺、0. ImM 巰基乙醇、lrnM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞 血清(體積比)、100IU/ml青霉素、100yg/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
具體可采用含有如下溶質的高糖DMEM培養BRL細胞4. 5g/L葡萄糖、10%胎牛 血清(體積比)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素。
所述培養BRL細胞得到的培養液，自接種開始每3天收集一次，可以收集1-5次。
本發明還提供了一種培養雞胚胎干細胞的方法，包括將雞的胚胎干細胞重懸于 所述的胚胎干細胞培養液中，然后置于密度為(2-3) Xl(f細胞/孔的小鼠成纖維細 胞飼養層上進行原代培養的步驟。
所述小鼠成纖維細胞的密度具體可為2. 5X105細胞/孔。
所述方法中還包括將原代培養后的細胞重懸于ES細胞完全培養液或所述胚胎 干細胞培養液中，然后置于密度為(2-3) 乂105的小鼠成纖維細胞飼養層上進行繼 代培養的步驟；
所述ES細胞完全培養液為高糖DMEM，含有如下溶質3. 5-4. 5g/L葡萄糖、 10-15°/。胎牛血清(體積比)、1.5-2. 5mM L-谷氨酰胺、0. 1-0. 15raM P -巰基乙醇、 l-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、15-25ng/ml伴白蛋白、抗 菌素。
所述ES細胞完全培養液中，所述抗菌素具體可為青霉素、鏈霉素和慶大霉素； 所述ES細胞完全培養液中，含有100-150IU/ml青霉素、100-120 u g/ml鏈霉素、 10-12ng/ml慶大霉素。
所述ES細胞完全培養液具體含有如下溶質4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體 積比)、2raM L-谷氨酰胺、0. ImM P -巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞 血清(體積比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、lOOu g/ml鏈霉素、10ng/ml 慶大霉素。
所述小鼠成纖維細胞的密度具體可為2.5乂105細胞/孔。 1 IU青霉素的定義1 11M).60ug結晶青霉素G鈉鹽。本發明提供的培養CES的方法，具有經濟、高效的優點。 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。 以下實施例中用到的試驗材料如下
(一) 試驗動物
壽光黑雞壽光慈倫種雞場，毛色基因型為CC00EE， E為色素擴散基因，黑色 對顯性白羽為隱性，C為色素基因，0為氧化酶基因。
海蘭白種蛋山東省泰安市東岳種雞場，海蘭白雞的毛色基因型為nccoo， i
為色素抑制基因，可掩蓋黑色和淺黃色。
(二) 試驗材料
高糖DMEM(高葡萄糖)Gibco Cat No 12800-058;
伴白蛋白(Conalburain) : Sigroa Cat No C-7786;
PBS: Gibco Cat No 21600-051;
L-谷氨酰胺(L-Glutamine) : Gibico Cat No 5445;
絲裂霉素-C: SigmaCat No M0503;
鼠白血病抑制因子(mLIF) : SigmaCat No L5158;
堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) : Sigma Cat No F-5392;
人干細胞生長因子(hSCF) : SigmaCat No S7901;
類胰島素生長因子-1 (IGF-1) : SigmaCat No 13769;
胎牛血清(FBS): GibcoCat No 16141-061;
BCIP/NBT染色液上海生工 E116;
胰蛋白酶(Trypsin)GibcoCat No 27250-034;
雞血清(CBS) : GibcoCat No 16110-082;
e-巰基乙醇GibcoCat No 21985-023。
(三) 溶液
1、 BRL培養液
含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體積比)、2mM L_ 谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素。
2、 成纖維細胞培養液含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%新生牛血清(NCS)(體積比)、 2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100y g/ml鏈霉素。 3、 ES細胞基礎培養液
含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、15%胎牛血清(體積比)、2mM L-谷氨酰胺、0. lmM P-巰基乙醇、lraM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積比)、 100IU/ml青霉素、100lig/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
5、 ES細胞完全培養液
含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體積比)、2mM L-谷氨酰胺、0. lmM 3-巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積比)、 20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
6、 0. 1%明膠的配制
稱取100mg明膠，溶于無菌PBS，過夜使其充分溶解于100ml超純水中。15磅 高壓滅菌，30min。 5ml分裝，4。C保存備用。
7、 消化液的配制
稱取胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 0. 040g溶于100ml PBS中， 置于37X:水浴中使其完全溶解，以0.22iim微孔濾膜過濾除菌，lml/管分裝，4°C 保存備用。
8、 大鼠肝細胞條件培養基(BRL-CM)的制備
以1Xl()5cells/ml密度接種BRL細胞(上海銳聰科技發展有限公司)，待細胞 鋪滿后，每75cm2細胞加入13ml BRL培養液，于37r、 5%C02、飽和濕度下培養， 每3d收集一次培養液(培養液可連續收集多次)，-2(TC保存，用前調節PH到7.5 并用0. 22^m的微孔濾膜過濾。
9、 胚胎干細胞培養液
將80% (體積比)大鼠肝細胞條件培養基(BRL-CM)和20% (體積比)ES細胞 基礎培養液混合，得到胚胎干細胞培養液。
(四)小鼠成纖維細胞系(STO)飼養層的制備
取生長良好的小鼠成纖維細胞(上海亞培生物科技有限公司)，用PBS洗兩遍 后加入含10(ig/ml絲裂霉素-C的成纖維細胞培養液，37°(3孵育1. 5-2h。吸出溶液 并用PBS液洗多次，完全去除絲裂霉素-C。常規胰蛋白酶消化，輕輕吹打使其分散 為單細胞懸液。調整細胞至合適密度，接種于明膠包被的24孔培養板。37°C、 5%C02、飽和濕度下培養。24h后觀察細胞生長情況，若發現細胞過稀則補加處理后的 細胞以保證細胞能鋪成單層。將制備好的飼養層放置在培養箱中備用，在5d內使用。
實施例1、雞胚胎干細胞(CES)的培養
一、 雞胚X期胚盤細胞的分離
(1) 取新鮮的壽光黑雞種蛋，0.1% (體積比)新潔爾滅浸洗后，用75% (體 積比)的酒精擦拭消毒。
(2) 在超凈工作臺內小心的剝去卵殼，取出胚盤。
(3) 將胚盤放入PBS中，小心的除去附著的卵黃和卵黃膜。
(4) 去除胚盤暗區，將明區用無菌PBS洗2-3遍，放入離心管中輕輕吹打后， 100g離心8-10min，去上清。
(5) 高糖DMEM重懸細胞團，100g離心8-10min，去上清。
(6) 將胚盤細胞加入100|il消化液，37。C消化l-2min后，高糖DMEM中和消 化液，吹打使其分散為單細胞懸液。100g離心8-10min，去上清，收集細胞團。
二、 雞胚X期胚盤細胞的原代培養
飼養層是密度為2.5Xl()5細胞/孔(24孔板)的小鼠成纖維細胞系，每孔再加 500ul用胚胎干細胞培養液重懸的步驟一制備的細胞團，盡量保持培養板平衡，以 避免細胞分布不均勻。置于培養箱中37"C、 5%C02、飽和濕度條件下培養，每24h 換液一半。
三、 CES細胞的繼代培養
(1) 注意觀察雞胚盤細胞的生長情況，選擇細胞克隆生長良好，隆起明顯， 形態未表現分化或剛剛表現分化跡象的集落進行傳代。
(2) 用口吸管和剝離針剝離周圍的飼養層細胞和有分化跡象的細胞，選擇好 的克隆和未分化部分挑出，置于PBS中洗一次后，移入消化液中，37。C消化2-3rain。
(3) 用口吸管將細胞克隆從消化液中吸出，置于高糖DMEM中，洗2次后，移 入ES細胞完全培養液中，用口吸管輕輕吹打并借助剝離針的作用將細胞團分散為 小細胞團(20-40個)懸液，置于新制備的飼養層(飼養層是密度為2.5X105細胞/ 孔(24孔板)的小鼠成纖維細胞系)中37匸、5%C02、飽和濕度條件下培養，每24h 換液一半。實施例2、 CES細胞的鑒定
1、 形態學鑒定
對實施例1中傳至3代的CES細胞進行形態學鑒定。借助倒置顯微鏡及體視顯 微鏡，每天觀察細胞集落的外部特征。
培養4h后CES細胞大部分細胞都已經貼壁，24h后開始出現小的克隆，以后克 隆逐漸長大，克隆上有液滴，6d左右長成較大的克隆，將要分化時便需要傳代。CES 細胞克隆具有和小鼠ES細胞相似的形態ES細胞呈克隆狀生長，邊緣光滑，細胞 致密的聚集在一起，細胞間界限不清，形成鳥巢樣集落，也有的呈不規則形態(如 山包樣、葵花樣等)；克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀細胞。核大， 核質比高，核仁明顯。
2、 AKP染色鑒定
對實施例1中傳至3代的CES細胞進行AKP染色鑒定。吸去培養板中的培養液， 用PBS洗滌兩遍后，用4X的多聚甲醛4"C固定15min，然后用AKP染色液在37°C 或室溫染5-30min，直至出現理想的顏色。該反應可用添加EDTA或PBS洗滌而終止。 流水輕輕沖洗，晾干后中性樹膠封片，在倒置顯微鏡下觀察染色結果。AKP染色陽 性的細胞呈藍紫色。
BRL-CM培養的CES細胞表現出強AKP陽性，染色后呈藍紫色；分化的細胞及詞 養層細胞不著色。
3、 自發分化
不更換飼養層，長時間不進行傳代，觀察雞的ES細胞克隆自發分化的形態。 分別對實施例1中傳至3、 4、 5、 6、 7代的CES細胞進行自發分化鑒定。第3 至5代的CES克隆在長期不更換飼養層、不傳代、無分化抑制因子的情況下，l-2d 即可出現分化現象，分化的克隆形態發生明顯變化，邊界變得不清晰甚至消失，同 時伸展面積增大。3-4d大部分可觀察到幾種細胞類型。培養至第6、 7代的CES細 胞可以自發分化為成纖維樣細胞、肌肉樣細胞、神經細胞等多種細胞類型。這些分 化的細胞或呈區域性集中分布，或散落生長，或互相混雜，有時可見血管樣結構出 現，表明體外培養的CES細胞具有自發分化為多種細胞的潛能。
4、 懸浮培養
為了鑒定所培養的CES細胞是否可形成類胚體，將生長良好的實施例1中傳至3代的CES細胞克隆挑出后置于無伺養層細胞、無raLIF的ES細胞培養體系中懸浮 培養，培養液每隔一天更換一次。每天鏡檢，觀察類ES細胞克隆形成類胚體的情 況。聚集的CES細胞集落去除培養液中的生長因子，不更換飼養層，長時間不進行 傳代，觀察其自發分化的集落形態。
將形態生長良好的CES細胞克隆挑出，在預先鋪有明膠的無飼養層培養板上， 用普通無外源LIF的ES培養液培養，每2d更換一次培養液。3-5d時有類似前述的 自發分化情況；5d后有囊胚樣結構出現。
5、嵌合體雞的培養
① 實施例1培養的傳至3代的CES細胞為供體。首先挑選細胞克隆，PBS清洗 后用消化液37。C消化2 3min。
② 將CES細胞克隆移入高糖DMEM中洗兩次后移入PBS中。
③ 用口吸管輕輕吹打并借助剝離針的作用將細胞團分散為單細胞懸液， 1000rpm離心8 10min，去上清，收集細胞團。
用PBS重懸細胞團，制成細胞密度為100個/ul的細胞懸液備用。
⑤ 以海蘭白種蛋為受體(45枚)，將供體細胞注入受體種蛋的胚下腔內，轉入 代用蛋殼I中，補加蛋清(雙抗終濃度為青霉素250IU/ml、鏈霉素250ug/ml)至 滿，保鮮膜封口 (3S.2。C、 RH50%、 90°翻蛋角)孵化至72小時。
⑥ 然后轉入代用蛋殼II中(38.2°C、 RH60%、 30°翻蛋角)孵化直至21天出雛。 孵化率及嵌合率分別為45%和10.5%，證明CES具有參與受體體細胞發育的潛能。
權利要求
1、一種胚胎干細胞培養液，是將80％(體積比)大鼠肝細胞條件培養基和20％(體積比)ES細胞基礎培養液混合得到的；所述大鼠肝細胞條件培養基是培養BRL細胞得到的培養液；所述ES細胞基礎培養液為高糖DMEM，含有如下溶質3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(體積比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mMβ-巰基乙醇、1-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％雞血清(體積比)、抗菌素。
2、 如權利要求1所述的培養液，其特征在于所述ES細胞基礎培養液中，抗菌 素為青霉素、鏈霉素和慶大霉素；所述ES細胞基礎培養液中含有100-150IU/ml青霉 素、100-120 n g/ml鏈霉素、10-12ng/ml慶大霉素。
3、 如權利要求2所述的培養液，其特征在于所述ES細胞基礎培養液含有如下 溶質4.5g/L葡萄糖、15%胎牛血清(體積比)、2mML-谷氨酰胺、0. lraM P-巰基乙 醇、lraM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積比)、100IU/ml青霉素、100ug/ml 鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
4、 如權利要求1至3中任一所述的培養液，其特征在于所述培養BRL細胞得 到的培養液，自接種BRL細胞開始每3天收集一次。
5、 如權利要求4所述的培養液，其特征在于所述培養液收集l-5次。
6、 一種培養雞胚胎干細胞的方法，包括將雞的胚胎干細胞重懸于所述的胚胎干 細胞培養液中，然后置于密度為(2-3) X105細胞/孔的小鼠成纖維細胞詞養層上進行 原代培養的步驟。
7、 如權利要求6所述的方法，其特征在于所述小鼠成纖維細胞的密度為2.5 乂105細胞/孔。
8、 如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將原代培養 后的細胞重懸于ES細胞完全培養液或權利要求1至5中任一所述胚胎干細胞培養液 中，然后置于密度為(2-3) X105的小鼠成纖維細胞飼養層上進行繼代培養的步驟；所述ES細胞完全培養液為高糖DMEM，含有如下溶質3. 5-4. 5g/L葡萄糖、10-15% 胎牛血清(體積比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0. 1-0. 15mM 0-巰基乙醇、1-1. 5mM 羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、15-25ng/ml伴白蛋白、抗菌素。
9、 如權利要求8所述的方法，其特征在于所述ES細胞完全培養液中，所述抗 菌素為青霉素、鏈霉素和慶大霉素；所述ES細胞完全培養液中含有100-150IU/ml青 霉素、100-120lig/ml鏈霉素、10-12ng/ml慶大霉素。
10、如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述小鼠成纖維細胞的密度為2.5X105細胞/孔；所述ES細胞完全培養液含有如下溶質4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體積比)、 2mM L-谷氨酰胺、0. ImM P-巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積 比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
全文摘要
本發明公開了一種培養雞胚胎干細胞的方法及其專用培養液。本發明提供的胚胎干細胞培養液，是將80％(體積比)大鼠肝細胞條件培養基和20％(體積比)ES細胞基礎培養液混合得到的；所述大鼠肝細胞條件培養基是培養BRL細胞得到的培養液；所述ES細胞基礎培養液為高糖DMEM，含有如下溶質3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15％胎牛血清(體積比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mM β-巰基乙醇、1-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3％雞血清(體積比)、抗菌素。本發明還提供了應用所述胚胎干細胞培養液培養雞胚胎干細胞的方法。本發明提供的培養CES的方法，具有經濟、高效的優點。
文檔編號C12N5/06GK101423819SQ20081024009
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月18日 優先權日2008年12月18日
發明者孟春花, 張傳生, 李宏濱, 杜立新 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所