用于生產琥珀酸的微生物的制作方法

專利名稱：用于生產琥珀酸的微生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含基因SDH2和/或DIC1的至少一種以及基因IDH1的微生物，涉及 這樣的微生物的應用以及涉及用于其生產的方法。
背景技術：
二羧酸具有高度的經濟潛力，因為它們可以被用作許多化學制品的前體物質。例 如，琥珀酸用作用于基于l，4-丁二醇、四氫呋喃和Y-丁內酯的塑料生產的初始階段。今 天，琥珀酸通過馬來酸酐催化水合為琥珀酸酐并隨后水加成或通過馬來酸的直接催化水合 而化學生產。 琥珀酸也通過許多微生物在生理環境條件下從糖或氨基酸形成。在厭氧條件下， 除了琥珀酸外，通常形成進一步發酵終產物如乙醇、乳酸、乙酸和蟻酸，。具有其高氧含量的 琥珀酸的生物合成需要0)2的還原固定(reduktive CO廠Fixierung)。 琥珀酸是代謝物，其通常通過厭氧發酵過程富集。而厭氧條件下所述產物的產率 和富集是需氧條件下的幾倍，完全厭氧過程的缺點是生物量(biomassen)生產的技術限制 和微生物生產者的低生產力。因此，結果是較低的生物量/產物效率。此外，難以嚴格地技 術處理厭氧微生物。 能夠在厭氧條件下合成琥珀酸的多種微生物在本領域是已知的。文件US 5， 143,834描述了產琥珀酸厭氧螺菌(A. succiniciproducens)的變異體。這是專性的 厭氧微生物，其僅可以產生中等量的琥珀酸，此外不能耐受高滲透壓和鹽濃度。文件US 7，063，968描述了微生物瘤胃分離物，曼海姆菌(Mannheimia sp.) 55E，其能夠在需氧和厭 氧條件下合成有機酸。然而，這不是琥珀酸的特異性富集，而是不同有機酸的混合物，如 蟻酸、乙酸、乳酸、和琥珀酸。這種生產者的缺點是所述菌株的經濟應用即使不是不可能， 也僅僅是很難實現的，因為為了獲得琥珀酸，不得不采用昂貴的富集和純化方法。文件US 5， 869， 301描述了用于在兩步發酵過程中利用大腸桿菌(E. coli)AFP-lll生產二羧酸的 方法，其中在第一階段微生物的生物量在需氧條件下產生，在第二階段，琥珀酸的生產以 厭氧方式進行。生物量產生的第一階段被限制在這個過程中，因為，在分批供料過程中葡 萄糖濃度必須被限制為lg/L，以便避免擾亂生物量生產過程和琥珀酸生產的乙酸鹽的富 集。因此，通過這個過程的產生生物量的可能性非常小。此外，在這個過程中琥珀酸的生 物合成途徑受到強烈的代謝物阻遏，因為糖酵解、檸檬酸循環和乙醛酸途徑的基因被葡萄 糖強烈地阻遏，這可以從文件DeRisi J. L. ， Iyer V. R. ， Brown P. 0. ， Science 278(5338): 680-686(1997)獲知。結果是在存在葡萄糖時琥珀酸的合成被很大程度地阻遏并由此受到 強烈受限。 根據文件US 6， 190,914的微生物是本領域已知的，其中通過合適的轉錄因子和 激酶的調變(modulation)，多種基因的葡萄糖阻遏被減少。但在其中無法獲取通過這樣的 微生物生產有機酸，特別是以及進一步獲取用于生產針對有機酸而被優化的微生物。
發明目的
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因此本發明的技術目的是詳細說明一種方法和用于實施后者的微生物，其允許在 發酵過程中沒有限制地生產生物量，產生乙醛酸循環的羧酸，尤其是琥珀酸，而在生產過程 中沒有生物合成途徑中的代謝物阻遏，以及確保在所述生產階段期間盡可能低的副產品富集。 發明基礎和優選的實施方式 為了實現這個技術目的，本發明教導了分離的遺傳修飾的微生物，其中基因DIC1 和SDH2的至少一種或二者以及基因IDH1在第一外源啟動子的控制下，所述第一外源啟動 子通過培養添加劑被阻遏于生長培養基，在缺乏所述培養添加劑時所述啟動子是有活性 的，以及這樣的微生物在用于產生乙醛酸循環的羧酸(尤其是二羧酸，例如琥珀酸)的方法 中的應用，所述方法包括下面的步驟a)所述微生物在生長培養基中被培養并繁殖；b)隨 后所述微生物被轉移入生產培養基，所述生產培養基包含阻遏所述第一啟動子的培養添加 劑，或者阻遏所述第一啟動子的培養添加劑被加入到所述生長培養基并被培養(如果在需 氧或厭氧條件下適用)；以及c)在步驟b)后或步驟b)期間，從培養物上清液分離羧酸并 任選地被純化。 此外，通過根據本發明的微生物或方法，通過合適的基因阻遏，乙醛酸或擰檬酸循 環的多種中間產物可以作為所述生產方法的終產物被特異性產生。當基因IDH1、 SDH2和 DIC1在第一外源啟動子的控制下時，產生的羧酸為琥珀酸(琥珀酸鹽)。當基因SDH2和 DIC1不在第一外源啟動子的控制下，并且基因IDH1、 FUM1和0SM1在第一外源啟動子的控 制下時，產生的羧酸為延胡索酸(延胡索酸鹽)。當基因FUM1和0SM1不在第一外源啟動子 的控制下，并且基因IDH1和MDH3在第一外源啟動子的控制下時，產生的羧酸為馬來酸(蘋 果酸鹽)。當基因MDH3不在第一外源啟動子的控制下，并且基因IDH1和CIT2在第一外源 啟動子的控制下時，產生的羧酸為草酰乙酸(草酰乙酸鹽)。
本發明利用下面的發現并實現下面的優點。 在細胞呼吸期間，還原當量(Reduktionsaquivalente)從擰檬酸循環獲得， 其中琥珀酸是中間產物，所述還原當量導致線粒體膜系統內電位的產生。這種膜電位隨后 在呼吸鏈的過程中用于產生ATP形式的能量。此外，碳在合成代謝過程中通過檸檬酸循環 被有效地轉化為生物量。這種形式的增能(Energetisier皿g)非常有效并且導致細胞的最 佳生長。然而只要檸檬酸循環和呼吸鏈存在于線粒體膜中，它就僅是可能的。除了檸檬酸 循環，乙醛酸代謝途徑在酵母釀酒酵母(Saccharomvcescerevisiae)中存在(還參見

圖1)。 它是一類"簡化的"(〃 Kurzschluss〃 )檸檬酸循環，因為異檸檬酸作為代謝物從所述代謝 途徑去除，一分子的琥珀酸和乙醛酸各自被形成。只要檸檬酸循環是活化的，那么琥珀酸和 乙醛酸將通過分子乙酰輔酶A(乙醇或乙酸的)被結合到乙醛酸而流回到檸檬酸循環，并從 其中產生蘋果酸。乙醛酸循環允許細胞通過乙酰輔酶A進入檸檬酸循環而無碳損失地供應 C2碳源，因為從異檸檬酸到琥珀酰輔酶A的兩個氧化脫羧步驟被旁路化。
天然地，乙醛酸循環，例如在酵母細胞中，在存在葡萄糖時，在轉錄上被強烈地阻 遏，結果是這個代謝途徑不是活化的。僅在葡萄糖完全耗盡時，并且乙醇在培養基中富集 時，涉及的基因在轉錄上被去阻遏。這個形式的調節通過乙醛酸代謝途徑的生物學含義被 解釋，S卩，C2碳化合物如乙醇或乙酸的再補充或代謝，以便在糖降解分解期間通過這些C2 碳化合物的產生來補充碳損失。所述生物合成途徑尤其在植物、真菌和酵母中被發現。
琥珀酸在呼吸階段(需氧階段)期間的富集以及由此所述階段(其中微生物獲得 生物量)沒有意義，因為碳被充分需要用于合成代謝過程。然而如果通過限制培養基成分 終止穩定期中生物量的增加，那么檸檬酸循環不再被細胞所需。這個時間可以用于通過培 養通過碳通量偏移入乙醛酸循環并由此有效進入琥珀酸合成來實現琥珀酸的特異性富集。
為了實現碳通量的這種代謝偏移，在中間產物異檸檬酸和琥珀酸后檸檬酸循環被 中斷，以便碳通量偏移進入乙醛酸循環，琥珀酸的進一步代謝被防止或改道為乙醛酸循環 的進一步的中間產物。此外，琥珀酸從乙醛酸循環進入線粒體的轉運被中斷，以便它不再可 用于位于線粒體內的檸檬酸循環。此外，細胞的天然調節機制必須被克服，因為為了琥珀酸 中通過乙醛酸途徑的有效碳開發，葡萄糖(其天然阻遏所述代謝途徑)被用作碳源。
對于其中最初在第一生長階段，生物量將被富集，在第二階段，琥珀酸將被有效地 產生并被轉移到培養基中的過程，微生物必須通過分子-遺傳方法被修飾以便檸檬酸循環 在生長階段后被中斷，乙醛酸循環在存在葡萄糖時被活化，即，去阻遏。如果這樣修飾的微 生物不再依賴于生物量的增加，那么葡萄糖的碳通量可以高度有效地發生進入羧酸或琥珀 酸。在這樣的菌株中的代謝情形在圖2中示出。為了比較目的，野生型菌株的代謝情形在 圖1中示出。 根據本發明的方法和可以用在這樣的方法中的根據本發明的微生物滿足這些要 求。它是被遺傳修飾或通過遺傳突變的微生物和相應的發酵方法，其中最初在第一階段 (呼吸階段)期間，微生物生產者的生物量的最佳增加被確保，隨后在第二階段(生產階 段)中，來自主要碳源(如葡萄糖)和C02(添補反應，C02固定)的羧酸，例如琥珀酸的富 集隨后。在生產階段期間，通過微生物的遺傳修飾，檸檬酸循環在中間產物異檸檬酸和琥珀 酸后被中斷，琥珀酸從乙醛酸循環的轉運被防止，如上所述。此外，在生產階段期間，代謝物 阻遏無效，結果是即使在C6碳分子的存在下，在培養物上清液中也存在羧酸或琥珀酸的有 效生物合成和富集。在多個步驟中代謝過程的控制通過添加或不添加或去除培養添加劑而 發生，其中所述培養添加劑阻遏第一啟動子，或其存在對于第一啟動子的活性是必需的。
因此還優選培養添加劑在生物體中不是內源性的。隨后，第一啟動子和進而由所 述啟動子調節的基因的非常簡單的控制過程可以通過添加培養添加劑到培養基或不添加 培養添加劑或分離培養添加劑來實施。所述培養添加劑可以為例如來自四環素組的抗生 素，尤其是四環素。 所述啟動子優選地選自包括〃 tet(^和tetO/'的組。采用的啟動子尤其是tet(^ 啟動子，其與第二成分一起形成轉錄反式激活蛋白(transcriptional transactivator) (tTA)，在文件Gari E. et al. ， YEAST13 :837-848 (1997)中描述的啟動子系統。通過利用 這個啟動子，在用于生物量富集的生長階段期間沒有培養添加劑被加入到培養基，呼吸代 謝正常運行。如果在生長階段末，培養添加劑被加入，那么所述啟動子和進而基因表達被阻 遏，碳不能再通過檸檬酸循環而被代謝，因此完全可以利用乙醛酸途徑并達到有效的羧酸 或琥珀酸生產。 優選地，所述微生物為酵母細胞，例如酵母釀酒酵母。用于生產過程的酵母的使 用與已建立的方法相比提供了下面的優點酵母對于有機酸和乙醇非常耐受，酵母是非 常滲透耐性的，酵母可以在較短時間內被培養到大量的生物量，酵母具有用于生物量產生 期間碳的無損耗使用和用于羧酸或琥珀酸生產的碳的無損耗使用的乙醛酸生物合成途
8徑，以及酵母可以通過非常簡單的、非常充分地建立的遺傳工具以復雜方式容易地被分 子-生物學修飾。此外，酵母是強壯的和被證明的在工業規模上的生產生物體(還參見 生物乙醇生產)，并且不造成混合酸發酵，如，例如，大腸桿菌(E. coli)或琥珀酸放線桿菌 (A. Succinogenes)。因此，除了羧酸，實際上沒有另外的發酵終產物產生，除了可以被容易 分離的乙醇。 為了提高效率和產率，建議使野生型基因IDH1、 SDH2和/或DIC1缺失或失活，例 如，通過這些基因的天然啟動子被可阻遏的啟動子系統置換。由此，確保這些基因在生產階 段，步驟b)中是非活性的，基于上述原因，其將影響羧酸或琥珀酸的生產。
此外，為了提高產率和增加生產，優選一個或多個不同的或全部的來自組〃 PYCl、 ACS1、CIT1、AC01、 ICL1、MLS1、MDH3、和CIT2〃的基因被包括并在組成性活性第二啟動子的 控制下。優選地，這是ADH1啟動子。 根據本發明的微生物特別適合于琥珀酸的生產。 對于根據本發明的方法，優選步驟a)被實施直到至少100g干生物量/l，優選至 少120g/l最優選至少140g/l的細胞密度。步驟b)可以被實施直到至少0. 4mol/l，優選至 少0.8mol/l，最優選至少l.Omol/1的羧酸濃度。在步驟a)中，范圍是4 9，優選6 8 的pH，以及范圍是O. 01 0. 5mol/l，優選至少0. 05 0. 2mol/l，最優選0. 05 0. lmo1/1 的鹽濃度可以被調節。在步驟b)中，范圍是4 9，優選6 8的pH，以及范圍是0.01 0. 5mol/l，優選至少0. 05 0. 2mol/l，最優選0. 05 0. lmo1/1的鹽濃度可以被調節。步 驟a)優選在20 35°C ，優選28 30°C的溫度下被實施，實施時間為1 1， OOOh，優選2 500h，最優選2 200h。在步驟b)中，優選溫度15 40。C，優選20 35。C，最優選28 30。C，時間為1 1， OOOh，優選2 500h，最優選2 200h。 作為用于步驟a)的培養基，例如麗VIII培養基(Lang C. ， LoomanA. C. ， A卯l. Microbiol. Biotechnol. 44(1-2) :147-156(1995))可以被使用。培養基中四環素的量少于 20mg/l，優選少于10mg/l，最優選少于lmg/1，降至低于檢測極限的值。
作為用于步驟b)的培養基，例如麗VIII培養基可以被使用，但是通常的糖蜜培養 基也可以被使用。四環素的量優選多于lmg/l，最優選多于3mg/1。 1 3mg/l或3 15mg/ 1的范圍可以被使用。 步驟c)可以在步驟b)后被實施。隨后，培養物上清液從微生物被分離，例如，通 過過濾或離心。然而，步驟c)也可以在步驟b)期間被實施，連續或不連續地。在后面的情 況中，至少部分培養物上清液被移出并被新的培養基置換，這個過程被重復，如果適用，重 復幾次。從被移出的培養物上清液，獲得琥珀酸。連續分離可以通過合適的膜或通過引導 培養基的通量通過用于分離琥珀酸的裝置來實施。 最后，本發明涉及用于生產根據本發明的微生物的方法，其中野生型微生物中或 與野生型相比被遺傳修飾的或突變的微生物中，野生型基因IDH1 、SDH2和/或DIC1被缺失 或失活，并且其中這個基因或這些基因在第一啟動子的控制下，其中所述第一啟動子被生 長培養基的培養添加劑阻遏并在缺乏所述培養添加劑時是有活性的。這個啟動子和屬于四 環素_調節的啟動子系統的tTA被引入到所述微生物中，并且所述微生物被其轉化。
優選地，來自組〃 PYC1、 ACS1、 CIT1、 ACOl、 ICL1、 MLS1、 MDH3、和CIT2〃的基因的 一種或多種不同的或全部在組成性活性第二啟動子的控制下被引入到所述微生物中，并且
9所述微生物被其轉化。第一啟動子尤其可以為〖"07啟動子，第二啟動子可以為ADH1啟動 子。 用于本發明的目的的基因和啟動子，或其核酸序列用下面的NCBI數據庫的編號
Nos.描述或在下面的文件中描述 IDH1 :Z71313 Y13139 SDH2 :Z73146 Y13138 DIC1 :EF059331 FUM1 :NC001148 0SM1 :NC001142 PYC1 :Z72584 Y13135 ACS1 :AY723758 CIT1:Z71616 Y13139 AC01 :M33131 ICL1 :X65554 MLS1 :X64407 S50520 MDH3 :M98763 CIT2:Z11113 tetO禾P tTA :Gari E. et al. ， YEAST 13 :837—848 (1997) ADH1 :Lang C. ， Looman A. C. ，Appl Microbiol Biotechnol. 44 (1-2) :147-156(1995) 酵母細胞的轉化可以以常規方式進行，其相關參考文獻為文件Schiestl R. H. et al. ， Curr Genet. Dec,16(5-6) :339-346(1989)， 或Manivasakam P. et al. ， Nucleic Acids Res.S印11,21(18) :4414-4415 (1993)，或Morgan A. J. ， Experientia S聊l.，46: 155-166(1983)。 適于轉化的載體，尤其是質粒為，例如，從文件Naumovski L. et al. ， J Bacteriol，152(1) :323-331 (1982)， Broach J. R. et al. ， Gene，8 (1) :121-133(1979)， Sikorski R. S. et al. ，Genetics， 122 (1)_19_27 (1989)已知的。這些載體為Y印24、Y印13、 pRS-載體系列、和YCpl9或pYEXBX。 適用于本發明的目的的表達盒的生產通常根據常規重組和克隆技術，通過啟動子 與編碼所述基因的核酸序列以及如果適用，終止子的融合來進行，如，例如在文件Maniatis T. et al. ， Molecular Cloning :ALaboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY， USA， 1989，或Sihlavy T.J. ， at al. ， Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY， USA， 1984，或Ausubel F. M. et al. ， Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Assoc. and Wiley-Interscience， 1987中描述的。 下面，描述獨立意義的本發明的替換方式和/或改進。上面的解釋和變體的合適 的部分也可以在下面描述的替換方式和/或改進中以類似的方式使用，反之亦然。
改進包括在所有的替換方法中葡萄糖阻遏級聯的激酶和轉錄因子的影B向。替換方 法包括使用還原的(reductive)檸檬酸循環，用于提高酵母中，例如借助酵母釀酒酵母，呼 吸中心代謝的有機酸的生產效率。
下面，用于生產琥珀酸和呼吸中心代謝的其他有機酸的優化的方法通過酵母菌 株，尤其是具有減少的葡萄糖阻遏的釀酒酵母酵母菌株進行描述。 減少的葡萄糖阻遏通過特異性影響〃 Crabtree〃 _陽性酵母中負責葡萄糖阻遏 的合適的轉錄因子和激酶實現。這樣，有機羧酸，尤其是酵母的呼吸中心代謝的二羧酸和羥 基脂肪酸，如，例如，琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、草酰乙酸的生產效率在生產時間和產率方 面被提高。 在細胞呼吸期間，從底物如葡萄糖起始，碳沒有被轉化為乙醇或甘油，如在發酵期 間，但是進入呼吸中心代謝，即，檸檬酸循環或乙醛酸循環(參見圖3&.)、13.)和c.))。當 碳通過這兩個循環，NADH或NADra形式的氧化還原當量被形成，其電子被轉移到呼吸鏈的 第一蛋白復合體，其位于線粒體內膜。這些電子隨后將通過呼吸鏈的另外的蛋白復合體逐 步傳遞氧到最終的電子受體，所述氧隨后被還原為水。這個被控制的氫氧反應釋放的能量 被用于克服梯度轉運質子進入線粒體的膜間空間，其隨后在回流入線粒體時將通過呼吸鏈 的復合體V驅動所謂的"質子泵"，由此產生ATP形式的能量。 在發酵條件下，與呼吸相比(其中每分子葡萄糖38ATP可以被產生)，酵母產生，除 了甘油，主要是乙醇(參見圖3c.))并且每分子葡萄糖僅產生2個ATP形式的能當量。在 發酵期間，通過乙醇或甘油的合成，NADH被再氧化成NAD，在呼吸期間，通過遞送氧上的電 子，NADH不被再氧化成NAD，因為在厭氧條件下，不可利用氧作為最終的電子受體。在發酵 條件下，僅非常少的碳經歷呼吸中心代謝，以致檸檬酸循環的中間產物作為用于合成生長 必須的氨基酸的前體分子仍然是可利用的。 酵母釀酒酵母是"Crabtree"-陽性的。這意味著所述酵母在主要碳源上發酵， 如葡萄糖，即使在有氧條件下，也不呼吸。這個發酵活性可以從由培養基中已經存在的約 100mg/l葡萄糖的葡萄糖濃度起始觀察到，因為在這個濃度，酵母細胞的呼吸容量的限制被 實現。這個的原因是在存在葡萄糖時，呼吸中心代謝的多個基因，即，檸檬酸和乙醛酸循環 的基因(參見圖3a.)和b.))和呼吸鏈的基因被在轉錄上強烈地阻遏(Gancedo 1998)。這 個現象還稱為葡萄糖或代謝物阻遏。負責葡萄糖阻遏的機制還沒有被充分闡明。然而，已 知多個活化和阻遏轉錄因子和激酶負責葡萄糖阻遏級聯。 此外，負責可替換的碳源的代謝的所有基因在存在葡萄糖時被強烈地阻遏， 以致所述酵母將總是首先開發葡萄糖作為底物，這就是為什么它還稱為"親葡萄糖的 (glucophil)" (Gancedo 1998)。僅在所有的葡萄糖耗盡時，用于可置換的碳源的代謝的基 因、呼吸代謝和呼吸鏈的基因，以及氧化應激反應的基因被表達(Haurie et al. 2001)。在 培養基中的葡萄糖被耗盡時，這個轉錄表達特點的顯著改變被稱為"雙峰移動(diauxisher shift)"。在所述"雙峰移動"期間，存在呼吸方向上呼吸-發酵平衡的移動。酵母細胞從 發酵變為呼吸，并且現在可以代謝發酵期間由呼吸代謝產生的乙醇。"雙峰移動"僅存在，如 果葡萄糖消耗過程中的代謝物阻遏被中止。與野生型菌株相比，盡管存在葡萄糖，也不表現 出任何或減少的葡萄糖阻遏的酵母菌株更適合于在主要碳源上產生二羧酸，如琥珀酸、延 胡索酸、蘋果酸和草酰乙酸，因為這些酸是檸檬酸和乙醛酸循環的中間產物，其基因受到這 個阻遏。減少的葡萄糖阻遏導致呼吸方向上呼吸-發酵平衡的移動，其具有的結果是完整 的呼吸系統的增長和在希望的有機酸方向上通過中心代謝的碳通量的增加。
在呼吸條件下，進一步的乙醛酸循環(參見圖3b.))被增加。乙醛酸代謝途徑的
11生物學意義是C2-碳化合物如乙醇和乙酸的再補充或代謝，其可以通過乙醛酸循環被供應 而沒有碳損失入代謝，由此C2-化合物的生長將僅變得可能。在通過乙醛酸循環的有機酸 的生產期間，存在的優點是檸檬酸循環中異檸檬酸到琥珀酰-CoA的兩個氧化脫羧步驟，由 此兩倍C02形式的碳的損失(參見圖3e.))可以被旁路化。 碳通量進入乙醛酸循環的偏移由此顯著地有助于酵母中有機酸生產期間產率的 提高。最終，在檸檬酸循環中釋放的0)2的碳起源于相應的底物如葡萄糖或起源于(A固定 (添補反應)。檸檬酸和乙醛酸循環的多種酶，其基因被葡萄糖轉錄阻遏，也在蛋白水平受 到由葡萄糖的調節或失活。由此這些基因的在轉錄上去調節不足以獲得活性基因產物。蛋 白水平上的失活影響也必須被旁路化，其可以通過減少的葡萄糖阻遏獲得。
實例是乙醛酸循環的主要酶之一，異檸檬酸裂合酶(Icllp，圖3b.)1)。這種酶，其 對于有機酸的有效生產是必需的，在存在葡萄糖時受到通過磷酸化的失活和增加的蛋白水 解降解(Lopez-Boado et al. 1988 ;0rdiz et al. 1996)。 下面，根據權利要求的本發明的替換方法的可替換的，但是也任意可結合的特征 被解釋。細胞溶質蘋果酸脫氫酶(Mdh2p)，也受到由葡萄糖誘導的增加的蛋白水解降解 (Hung et al.2004)。細胞溶質蘋果酸脫氫酶被用于通過檸檬酸循環的還原部分的琥珀酸 合成，從丙酮酸和草酰乙酸、蘋果酸和延胡索酸起始到琥珀酸(圖3f. ) 1)。還原性檸檬酸循 環，即，檸檬酸循環的非環狀返回部分(圖3f.)是用于琥珀酸在葡萄糖上生產期間化學計 算最大摩爾產率的先決條件。僅結合乙醛酸循環的還原性檸檬酸循環允許琥珀酸生產期間 通過NADH再氧化到NAD+和C02固定最高達到每mol葡萄糖1. 71mol琥珀酸的最大產率。
剝奪細胞溶質蘋果酸脫氫酶(Mdh2p)的葡萄糖-誘導的蛋白水解降解的另一可能 性是最初的12個N-末端氨基酸以及，任選地，C-末端脯氨酸縮短的Mdh2p蛋白的過度表 達。最初的12個N-末端氨基酸和C-末端脯氨酸對于Mdh2p的降解是必需的(H皿g，Brown et al. 2004)。 通過檸檬酸循環的還原部分的琥珀酸生產的另一瓶頸是蘋果酸到延胡索酸的反 應(圖3f.)2)。這種反應由酶延胡索酸酶(Fum lp)催化。它是呼吸中心代謝的幾種酶之 一，其沒有同工酶。然而，它位于細胞溶質及線粒體內。單一的翻譯產物的定位由N-末端 線粒體耙向序列和蛋白折疊決定(Sass et al.2003)。 蘋果酸到延胡索酸的反應是熱力學上非常不利的，因為延胡索酸酶對延胡索酸的 親和力是對蘋果酸的17倍。因此，采用酵母釀酒酵母的天然延胡索酸酶，有效利用用于琥 珀酸生產的檸檬酸循環的還原部分是不可能的。 為了克服這些問題，延胡索酸酶必須在酵母中異源地表達，所述酶優選源自生物 體，其天然進行混合的酸發酵。在這些生物體中，還原性檸檬酸循環有效地多，因為在混合 酸發酵中，琥珀酸是天然發酵終產品。這樣的生物體的延胡索酸酶的熱力學在蘋果酸到延 胡索酸的反應方面比釀酒酵母有利地多。作為用于異源表達的延胡索酸酶的供體生物體， 例如，大腸桿菌、產琉王白酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、琉王白酸放 線桿菌(Actinobacillus succinogenes) 、 Ma皿heimia succiniciproducens、谷氨酸棒桿 菌(Corynebacteriumglutamicum)可以被使用。 用于通過還原性檸檬酸循環的琥珀酸生產的最后步驟是延胡索酸到琥珀酸的反 應。這種反應在細胞溶質中由酶延胡索酸還原酶(Frdslp，圖3f.)3)催化。這種酶的過度表達增加還原的琥珀酸生產的效率。 因此，本發明還教導了分離的遺傳修飾的微生物，其中天然基因MDH2的截短的變 體被引入到所述微生物中，和/或天然基因FUMl被來自與所述微生物不同的生物體的基因 FUM1置換，和/或其中基因FRDS1被過度表達，和/或PYC1和/或PYC2之一或二者被過度 表達。 優選地，基因MDH2的截短的變體編碼MDH2蛋白，其最初的12個N-末端氨基酸和 可選地C-末端脯氨酸被縮短。 所述微生物可以為酵母，尤其選自包含以下的組"釀酒酵母、酵母菌屬 (Saccharomyces)、復膜抱子酵母屬(Saccharomycecopsis)、類酵母屬(Saccharomycodes)、 裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、威克酵母屬(Wickerhamia)、德巴利氏酵母 屬(Debayomyces)、漢遜酵母屬(Hanse皿la)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、畢 赤氏酵母屬(Pichia)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、假絲酵母屬(Candida)、接合酵 母屬 (Zygosaccharomyces) 、 0gataea、 Kuraishia、 Komagataella、 Yarrowia、 梅奇氏 酵母屬(Metschnikowia)、擬威爾酵母屬(Williopsis) 、 Nakazawaea、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、孢圓酵母屬(Torulaspora)、布勒擲 孢酵母屬(Bullera)、紅酵母(Rhodotorula) 、 Willopsis、克勒克酵母屬(Kloeckera) 和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)"，基因FUM1可以選自包含下列的組的生物體"大 腸桿菌(Escherichia coli)、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)、方文線桿菌、曼氏桿菌 (Mannheimia)、棒狀桿菌"。來自包括"FRDS1、PYC1和PYC2"的組的基因的至少一種可以在 第二外源組成性活性啟動子的控制下，例如ADH1-啟動子的控制下。 優選地，兩種天然基因MDH2和FUM1被置換或補充，和/或兩種基因FRDS1和PYC1 被過度表達。 這樣的微生物可以用于具有大大增加的產率的琥珀酸的生產。這是通過以下實現 的a)所述微生物可選地在生長培養基中在需氧條件下被培養和繁殖，b)隨后所述微生物 在可選地厭氧條件下被培養，以及c)步驟b)后或步驟b)期間，琥珀酸從培養物上清液被 分離并可選地被純化。至于步驟a)到c)中的條件，上面的解釋以類似的方式應用。
根據本發明的微生物可以通過下面產生在野生型微生物中或在初始的生物體中 (相對于野生型被遺傳修飾或突變)，野生型基因MDH2或FUM1之一或者二者，被缺失或失 活或補充，所述補充通過MDH2基因和/或外源FUM1基因的各自的變體被引入到所述微生 物中，并且所述微生物被其轉化，和/或通過基因FRDS1、 PYC1和PYC2的至少一種，優選至 少兩種基因FRDS1和PYC1，在第二啟動子控制下被引入到所述微生物中，并且所述微生物 被其轉化。 用于生產二羧酸的呼吸模式的另一優點是酶丙酮酸羧化酶(Pyclp和Pyc2p)的增 加的表達，其催化丙酮酸到草酰乙酸的反應，其中(A形式的碳被固定(參見圖3d))。丙酮 酸羧化酶的酶促反應是檸檬酸循環的還原部分(圖3f.))和糖異生的第一步。糖異生，即， 儲存物質糖原的構建，主要發生在呼吸條件下(Haurie，Perrot et al. 2001)。在這種酶促 步驟中的C02固定允許具有平坦(evened-out)或甚至正性的C02平衡的過程，其關于所述 過程具有大的環境關聯性。 此外，在下面的本發明的所有上述替換方法描述的改進中，甘油和乙醇形式(參見圖3.c))的副產品的產生和進而產率損失通過呼吸的增加被減少，因為甘油和乙醇代表 酵母的發酵終產物。 在"雙峰移動"的過程中的表達特點的改變涉及釀酒酵母中約6000個基因的幾乎 四分之一 (Young et al. 2003)。這些深刻的改變由代謝物阻遏級聯的一些激酶和轉錄因子 誘導，其均在多個靶基因的啟動子區中產生調節作用。這顯示除了呼吸中心代謝的基因，還 有數量眾多的另外的基因由葡萄糖阻遏。為了酵母中有機酸的有效生產，因此通過過度表 達僅僅在轉錄上去調節中心代謝的基因是不充分。必須剝奪這種阻遏的呼吸系統的多種另 外的葡萄糖-阻遏的基因。這涉及編碼線粒體轉運系統、氧化還原當量的交換、呼吸鏈的蛋 白和線粒體生源(biogenese)的基因。在沒有或減少的葡萄糖阻遏的酵母菌株中，完整的 呼吸系統在主要碳源和其他碳源上更有效。由于二羧酸，如琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸和草 酰乙酸是呼吸代謝的中間產物，這樣的菌株非常適合于這些酸的生產。由于菌株穩定性和 效率的原因，僅有限數量的基因可以個別地在轉錄上去調節，多種基因的葡萄糖-誘導的 阻遏的中止僅可以通過在高級水平上影響負責這種阻遏的合適的轉錄因子來實現。
在酵母釀酒酵母中，代謝物阻遏級聯的幾種激酶和轉錄因子是已知的并被研究， 其在呼吸系統的它們的靶基因的啟動子區阻遏地起作用。此外，轉錄因子是已知的并被研 究，其在"雙峰移動"過程中導致它們的靶基因的增加的表達，即，以誘導性或活化方式起作 用。為了在高級水平上葡萄糖阻遏的中止或減少，并因此用于呼吸系統的許多基因的活化， 合適的激酶和轉錄因子必須被阻遏或活化。這樣，呼吸系統的有機酸的生產效率可以被提 高。 總之，具有減少的或中止的葡萄糖阻遏的酵母菌株已經通過合適的激酶和轉錄因 子的活化或阻遏用于在主要碳源上呼吸中心代謝的有機二羧酸的生產，與野生型菌株相 比，具有下面的優點 通過檸檬酸和乙醛酸循環的碳通量被增加
所述菌株具有更高和更快的生長
乙醇和甘油形式的副產品的較少產生
乙醛酸循環被擴大 負責中心代謝中的C02固定的酶被表達到增加的程度 呼吸系統，如線粒體轉運系統、呼吸鏈、線粒體生源和用于氧化還原當量的交換 的所有基因是有活性的 檸檬酸和乙醛酸循環的酶在蛋白質水平上被剝奪葡萄糖_誘導的負性調節
這些優點導致關于生產時間和產率的更有效的生產。此外，通過更少的0)2被產 生和更多的C02被固定，生態效率增加。 所述酵母細胞不僅表現出在葡萄糖上的代謝物阻遏，而且表現出在其他可發酵的 C6和C5糖上的代謝物阻遏，例如半乳糖或核糖，在不可發酵的碳源如，例如甘油上，也到較 低的程度(Gancedo 1998)。因此，在葡萄糖-去阻遏的菌株中，在所有可發酵和許多不可發
酵的碳源上可以預期更有效的生產。 在本文中，一方面轉錄因子將被命名。 Snflp/Snf4p復合體屬于蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶并且對于"雙峰移動"的過程 中葡萄糖阻遏的中止扮演中心角色。Snflp/Snf4p復合體的位置在所述級聯的層級中在頂
14部上非常遠，其負責葡萄糖阻遏或去阻遏。在"雙峰移動"的過程中，Snflp/Snf4p復合體被 磷酸化Snfl激酶Saklp、 Toslp和Elmlp并由此被活化(Rubenstein et al. 2006)。活化
的復合體位于細胞核中，其中它影響位于層級水平中的進一步的下游的兩個轉錄因子。這 些是蛋白Miglp和Cat8p(Treitel et al. 1998)。 鋅指蛋白Miglp是轉錄阻遏物，其募集蛋白Tuplp和Cyc8p，以便隨后作為復合體 結合到多個葡萄糖_阻遏的基因的啟動子的相應共有序列，由此隨后的基因的轉錄被防止 (Treitel and Carlson 1995)。 Cat8p是轉錄活化蛋白并在培養基中不再有葡萄糖時，誘導至少34種基因的表 達。這些主要是乙醛酸循環的基因，其是酵母中有機酸的有效生產所必需的。此外，負責乙 醛酸和檸檬酸循環的中間產物的胞內運輸的一些基因受到Cat8p的調節(Haurie， Perrot et al. 2001)。 活性Snflp/Snf4p復合體磷酸化Migl蛋白，進而其被失活并被從細胞核轉位 (translocalized) (De Vit et al. 1997)并磷酸化Cat8p和Siplp，功能同源物，其導致這 兩個蛋白的活化。 因此，位于細胞核內的活性Snflp/Snf4p復合體顯著地有助于葡萄糖阻遏的中 止，因為它直接影響阻遏級聯的另外的轉錄因子。這個復合體由蛋白Snflp和Snf4p，以及 分別的蛋白Gal83p、Siplp和Sip2p之一組成(Jiang and Carlson 1997)。后面的蛋白對 總復合體在細胞內的定位有影響并代表復合體的鏈接。Snf4p是調節亞基，Snflp是催化亞 基。Snflp通過3個冗余激酶Saklp、Toslp或Elmlp之一磷酸化位置210處的氨基酸蘇氨酸 而被活化。Glc7p/Reglp I型蛋白磷酸酶針對這個磷酸化起作用(Santangelo 2006) 。Reglp 是這個蛋白磷酸酶的調節亞基并通過結合到Glc7p引導這個復合體到一系列的底物，其參 與包括葡萄糖阻遏、細胞生長、及糖原產生的不同的過程中(Cui et al.2004)。 Reglp與 Snfl蛋白的激酶結構域相互作用并引導Glc7p到Snflp的活化環，其導致Snflp的脫磷酸 和失活，由此導致許多基因的葡萄糖阻遏。 Frederick et al. (1996)能夠鑒定Reglp-Reg2p的同源物。Aregl或Areg2突 變體在可發酵和不可發酵的碳源上表現出明顯較慢的生長。A regl A reg2雙重突變體甚 至具有更嚴重的缺陷(Frederick and Tatchel11996) 。 A regl A reg2突變體中REG2的過 度表達在生長方面減輕這些缺陷，然而強烈減少的葡萄糖阻遏沒有被影響。這表明主要是 Reglp對于維持葡萄糖阻遏起作用。 為了即使在存在葡萄糖時也保持Snflp/Snf4p在活性狀態，可以設想兩種機制。 首先，蛋白Saklp，其作為主要激酶負責磷酸化并由此負責Snflp/Snf4p復合體的活化，將 通過基因SAK1的在轉錄上去調節被過度表達。 此外，通過Glc7p/Reglp蛋白磷酸酶的脫磷酸將被防止。GLC7的阻遏或缺失導致 無法存活的細胞，由此這通過基因REG 1的阻遏或缺失僅是可能的。 通過這兩種措施，Saklp和Glc7p/Reglp之間的調節斗爭在活性Snflp/Snf4p復 合體的方向上可以被移動，其顯著地有助于葡萄糖阻遏的中止。 H即2/3/4/5蛋白質復合體調節大量的葡萄糖-阻遏的基因。這些是呼吸鏈和擰 檬酸循環的主要基因。作為活化蛋白，它誘導"雙峰移動"期間這些基因的轉錄并強烈有助 于呼吸_發酵平衡在呼吸方向上的移動。基因HAP2、 HAP3和HAP5被組成性表達(McNabband Pinto2005)。 HAP4僅通過在不可發酵的碳源上的生長被天然地表達。在HAP4過度表
達突變體的培養期間，觀察到這個突變，與野生型相比，導致提高的生長率、生物量和乙酸
鹽生產，并導致減少的乙醇和甘油生產(Blomet a1.2000)。 H即2/3/4/5蛋白復合體通過檸
檬酸循環和呼吸容量的碳通量被增加和線粒體生源被促進來擴大呼吸系統。 通過H即4p的過度表達，由此有機羧酸的生產效率，尤其是酵母的呼吸中心代謝
的二羧酸和羥基脂肪酸，如，例如琥珀酸，延胡索酸、蘋果酸、草酰乙酸的生產效率，在生產 時間和產率方面被提高。 受到葡萄糖阻遏的大多數基因通過幾個轉錄因子被調節。在這些基因的啟動子 區，可以發現非常常見的用于幾個轉錄因子，例如Miglp、 H即2/4/5/6p、 Cat8p等的結合結 構域。 此外，這些蛋白質互相調節。Cat8p的轉錄例如在葡萄糖存在下受到嚴格的阻遏， 主要通過Migl蛋白，其還阻遏基因SNFl的轉錄(Schullerand Entian 1991)。在基因HAP4 的啟動子區中，Miglp結合序列也被鑒定(Gancedo 1998)。可以顯示葡萄糖阻遏級聯的幾 個轉錄因子的影響具有加性效應(Lascaris et al. 2004)。因此這變得清楚，即，僅超過一 個轉錄因子或復合體的結合的影響可以導致代謝物阻遏的全面減少或消失。
因此，本發明還包括分離的遺傳修飾的微生物，尤其是作為上述變體之一的改進， 其中基因HAP4或SAK1的一個被過度表達，或者其中兩個基因HAP4和SAK1被過度表達，和 /或基因REG1被阻遏或缺失。 優選地，這是Crabtree-陽性酵母，尤其選自包括下面的組"釀酒酵母、酵母 菌屬、復膜孢子酵母屬、類酵母屬、裂殖酵母屬、威克酵母屬、德巴利氏酵母屬、漢遜酵母 屬、有孢漢遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、克勒克酵母屬、假絲酵母屬、接合酵母屬、Ogataea、 Kuraishia、 Komagataella、 Yarrowia、梅奇氏酵母屬、擬威爾酵母屬、Nakazawaea、 Kluyverornyces、隱球酵母屬、孢圓酵母屬、布勒擲孢酵母屬、紅酵母、Willopsis、克勒克酵 母屬和擲孢酵母屬"。 尤其是，基因HAP4或SAK1之一或者二者可以在第二外源、組成性活性啟動子，尤 其是ADHl-啟動子的控制下。 這樣的微生物通常適于生產有機羧酸，尤其是琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、草酰乙 酸、乳酸、乙酸、和/或蟻酸，具有提高的產率。何種羧酸以特別高的產率形成，依賴于進一 步的遺傳測量，如上所述。關于所述羧酸的生產，以類似的方式應用上面的解釋。
最后，本發明涉及用于生產這樣的微生物的方法，其中在野生型微生物中或在相 對于野生型被遺傳修飾的或突變的初始的生物體中，野生型基因REG1缺失或失活，和/或 其中基因HAP4或SAK1的至少一種，優選二者基因都在第二啟動子的控制下被引入到所述 微生物中，所述微生物被其轉化。可選地，測量另外可以是合理的，其在上面根據本發明的 微生物的另外的變體的上下文中被描述。 用于上述替換方法和/或改進的目的的基因或其核酸序列描述在NCBI數據庫中， 具有下面的編號Nos.:
HAP4 : NP—012813
REG1 : NP_010311
SAK1 : NP_011055
MDH2 : NP_014515FRDS1 :NP_010867 f咖B :NC_004431aceA :U00096AE000111-AE000510 上面的文件具有下面的參考文獻資料 Blom， J. ， M. J. De Mattos and L. A. Grivel 1 (2000). 〃 Redirection of therespiro_fermentative flux distribution in Saccharomyces cerevisiae byoverexpression of the transcription factor Hap4p. 〃 Appl Environ Microbio166(5) :1970-3. Cui， D. Y. ， C. R. Brown and H丄Chiang (2004). 〃 The type lphosphatase Reglp_Glc7p is required for the glucose—induced degradationof fructose_l， 6_bisphosphatase in the vacuole. 〃 J Biol Chem279(11) :9713-24.
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pathways are co_regulated by the protein kinase Snfl and thetranscription
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異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和二羧酸轉運體在生長期間在四環素可阻遏的 tetO啟動子的控制下被表達。在生產期間，酶活性以可控方式被消除。釀酒酵母被如此修 飾以致三種靶基因的天然啟動子例如通過在酵母基因組中的特異性整合被可阻遏的啟動 子交換。 由此獲得的酵母菌株釀酒酵母(S. cerevisiae)的結構GRFura3 tTAtetOprom-SDH2和tetOprom-IDHl和tetOprom-DICl產生自下面的表1。
表1.
菌株
描述
GRFura3
GRFura3tTA
leu2, ura3, his3
tTA::Leu2,leu2,ura3, his3
GRFu;i:a3tTAi:ep:r. SDH2 tetOprom: : sdh2prom, leu2, his3, ura3
tTA::Leu2
tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetOprom::idhlprom
tetOprom::diclprom, leu2, his3, ura3 GRFura3
repr.SDH2 repr.工DH1 repr.DIC1
=GRFura3tTArepr.SDH2 repr.工DHlrepr.D工C1
實施例2 :具有組成性活性琥珀酸合成的微生物 由于在琥珀酸生物合成路徑上的乙醛酸循環和其他反應在酵母細胞中在葡萄糖 存在時是天然轉錄上被強烈阻遏的，結果是這種生物合成途徑不是活性的，這種代謝途徑 的酶的全部或選擇的和丙酮酸羧化酶(所述酶負責添補反應(C02固定))在用于琥珀酸 從葡萄糖的生物合成的生產階段期間被轉錄上優選地去調節。為了所述基因在酵母釀酒 酵母中的被去調節的表達，組成性ADH1啟動子被使用，其通過長期的天然序列的修飾導 致獨立于葡萄糖和乙醇的組成性表達(參見Lang C. ， Looman A. C. ， Appl Mi-crobiol Biotechnol. 44(1-2) :147-156 (1995))。在轉錄上去調節的是基因PYC1、ACS1、CIT1、AC01、 ICL1、MLS1、MDH3和CIT2。為此， 一種表達系統被使用，其允許PYC1、ACS1、CIT1、AC01、 ICL1、 MLS1 、MDH3和CIT2的同時在轉錄上去調節的表達。各個基因(PYC1 、ACS1 、CIT1 、AC01 、 ICL1 、 MLS1、MDH3和CIT2)通過PCR從菌株釀酒酵母S288c的染色體酵母DNA被擴增并被提供有 限制性連接物并隨后在組成性ADH1啟動子控制下被單獨地整合在酵母染色體中。
由此獲得的酵母菌株釀酒酵母的構成從表2產生。
表2.菌抹
GRFura3tTa
repr.SDH2repr.工DH1repr.. D工C1GRFura3tTA r印r.sDH2
repr.IDH1repr.DIClder.PYClGRFura3tTA
repr.SDH2
描述
tTA: : Leu2, tetOprom: : sdh2proiu,tet〇7prom: : idhlprom,
tet〇pr〇m: : dielprora his3, ura3, leu2
tTA::Leu2, tetOprom:tet〇7pr〇m::idhlprom,tet〇7pr〇ru: :dielprom,ura3, leu2
:sdh2prom,
der.pYCl::pycl, his3,
tTA::Leu2, tet〇pr〇m::sdh2prom, tetO—prom::idhlprom,
tetOprom::diclprom, der.PYCl::pycl,der，ACSl::acsl, his3, ura3,
20
repr.IDHlrepr.D工Clder.PYClder.ACSl
GRFura3tTA
repr.SDH2
repr.IDHlrepr.D工Clder.PYClder.ACS1der.C工TlGRFura3tTA
repr.SDH2
repr.工DH1
repr.D工Clder.PYC1der.ACSlder.CITlder.ACOlGRFura3tTA
repr.SDH2
repr.IDHl
repr.D工Clder.PYClder.ACSlder,CITlder.ACOlder.ICLl
leu2
tTA:::Leu2, tetOprom: : sdh2prom, tetO-prom::idhlprom,
tetOprom:der.ACSl:der.C工Tl:
diclprom, der.PYC1::pycl,3CS 1,
citl, his3, ura3, leu2
tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tetO-prom::idhlprom,
tetOprom:der.ACSlder.CITl:
leu2
diclprom, der.PYCl ::pycl,:3csl,
citl, der.ACOl::acol, his3, ura3.
tTA:::Leu2, tetOprom: : sdh2prom, tetO—prom::idhlprom,
tetOprom:der.ACSlder.CITl:der.ICLl:
diclprom, der.PYC1::pycl,:scsl,
citl, der.ACOl::acol,icll, his3, ura3, leu2GRFura3tTA
repr.SDH2
repr.IDH1
repr.DIClder.PYClder.ACSlder.CITlder.ACOlder.ICLlder.MLSlGRFura3tTA
repr.SDH2
repr.IDH1
repr.DIC1der.PYClder.ACSlder.C工Tlder.ACOlder.工CIAder.MLSlder.MDH3GRFura3tTA
repr.SDH2
rep:r . IDH1
rep;r . DIC1
der.PYClder.ACSl
tTA::Leu2, tetQprom::sdh2prom, tet〇-prom::idhlprom,
tetOprom:der.ACSl:der.CITl:der.ICLJ:
diclprora, der . PYC1: : pycl,
3CSl ,
citl, der.ACOl::acol,icll, der.MLSl::mlsl,
h丄s3, ura3, leu2
tTA::Leu2, tetOprom::sdh2prom, tet〇—prroin: : idhlprrom,
tetOprom::diclprom, der.PYCl::pycl,der.ACSl::acsl,
der.C工Tl::citl, der.ACOl::acol,der.ICL1: :icll, der.MLSl: :mis 1,der.MDH3::mdh3, his3, ura3, leu2
tTA::Leu2, tetOprom:prom::idhlprom,
sdh2prom, tetO-
tetOprom:der.ACSlder.C工Tl:der:. ICL1:der.MDH3:leu2
diclprom, der.PYC1::pycl,:acsl,
citl, der.ACOlicll, der.MLSlmdh3, der.CIT2
:mlsl,
:cit2, his3, ura3,der.C工Tlder.ACOlder.ICLl
der.MLSlder.MDH3der .CIT2 實施例3 :在釀酒酵母GRFura3中在基因座LEU2處在CMV啟動子的控制下轉錄反式激活蛋白的表達 tTA-表達盒的編碼核酸序列通過PCR標準方法被擴增，以便所得到的片段由下面的成分組成loxP-kanMX-loxP-CMVprom. _tTA(YEAST20 :1255-1262,2003)。作為引物，寡核苷酸序列被選擇以便在5'和3'懸突處分別包含LEU2基因的5'或3'序列，在退火片斷中包含loxP區的5'序列和tTA基因的3'序列。由此確保一方面包含KanR和tTA的完整片段被擴增，另一方面這個片段可以隨后被轉化入酵母中，通過同源重組，這個完整片段被整合在酵母的LEU2基因座中。 作為選擇標記物用于針對G418的抗性。得到的菌株釀酒酵母GRFura3tTA包含在CMV啟動子的控制下的基因tTA的拷貝。為了隨后再次去除針對G418的抗性，產生的酵母菌株用cre重組酶載體pSH47轉化(Gulde證U，Heck S， Fielder T，Beinhauer J，Hegema皿JH. (1996)Anew efficient gene disruption cassette for repeated use in buddingyeast. Nucleic Acids Res. Jul 1 ;24(13) :2519-24)。通過這種載體，cre重組酶在酵母中被表達，結果是兩個loxP序列內的序列區將被重組出去。結果是兩個loxP序列中僅一個和CMVprom. -tTA盒仍然包含在原始LEU2基因座中。結果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此適合在酵母菌株中通過這種cre-lox系統整合或去除另外的基因。載體pSH47可以隨后通過在補充有尿嘧啶(20mg/L)和F0A(5-氟乳清酸)(lg/L)的YNB瓊脂平板上反選擇再次去除。為此，攜帶這種質粒的細胞必須首先在非選擇性條件下被培養，隨后在包含FOA的選擇性平板上被選取(drawn)。在這些條件下，僅那些本身不能夠合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這個情況下，這些是不再包含質粒(PSH47)的細胞。 實施例4 :釀酒酵母GRFura3中在四環素-調節的tet07啟動子的控制下SDH2的表達 用于tet07啟動子盒的編碼核酸序列通過PCR和標準方法被擴增，以便所得到的片段由下面的成分構成loxP-kanMX-loxP-ADHlterm. -tet07operator-CYClprom.(YEAST13 :837-848(1997) ;Nucleic Acid Research 24(13) :1519-2524(1996))。作為引物，寡核苷酸序列被選擇以便在5'和3'懸突分別包含SDH2基因的天然啟動子的5'或3'序列，在退火片斷中包含loxP區的5'序列和CYC lprom的3'序列。由此確保一方面包含KanR和tet07啟動子的完整片段被擴增，另一方面這個片段可以隨后被轉化入酵母中，通過同源重組，這個完整片段被整合在所述酵母的SDH2基因座中，在基因SDH2的編碼區前。 作為選擇標記物用于針對G418的抗性。得到的菌株釀酒酵母GRFura3 r印r.SDH2包含在四環素調節的tet07啟動子和天然SDH2終止子的控制下的基因SDH2的拷貝。為了隨后再次去除針對G418的抗性，產生的酵母菌株用cre重組酶載體pSH47轉化(Guldener U， Heck S， Fielder T， Beinhauer J， Hegema皿JH. (1996) :A new efficient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jull ;24(13) :2519-24)。通過這種載體，ere重組酶在所述酵母中被表達，結果是兩個loxP 序列內的序列區將重組出去。結果是兩個loxP序列中僅一個和tet07啟動子盒仍然包含 在基因SDH2的編碼序列前。結果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此適合在酵母菌株中 通過這個cre-lox系統整合或去除另外的基因。載體pSH47可以隨后通過在補充有尿嘧 啶(20mg/L)和F0A(5-氟乳清酸)(lg/L)的YNB瓊脂平板上反選擇再次去除。為此，攜帶 這種質粒的細胞必須首先在非選擇性條件下被培養，隨后在包含FOA的選擇性平板上被選 取。在這些條件下，僅那些本身不能夠合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情況下，這些是 不再包含質粒(PSH47)的細胞。 實施例5 :釀酒酵母GRFura3中在四環素_調節的tet07啟動子的控制下IDH1的 表達 用于tet07啟動子盒的編碼核酸序列通過PCR和標準方法被擴增，以便所得 到的片段由下面的成分構成loxP-kanMX-loxP-ADHlterm. -tet07operator_CYClprom. (YEAST13 :837-848(1997) ;Nucleic Acid Research 24(13) :1519-2524(1996))。作為引 物，寡核苷酸序列被選擇以便在5'和3'懸突分別包含IDH1基因的天然啟動子的5'或 3'序列，在退火片斷中包含loxP區的5'序列和CYClprom的3'序列。由此確保一方面包 含KanR和tet07啟動子的完整片段被擴增，另一方面這個片段可以隨后被轉化入酵母中， 通過同源重組，這個完整片段被整合在所述酵母的IDH1基因座中，在基因IDH1的編碼區
、戶-
目" 作為選擇標記物用于針對G418的抗性。得到的菌株釀酒酵母GRFura3r印r. IDH1包含在四環素調節的tet(^啟動子和天然IDH1終止子的控制下的基因IDH 1的拷 貝。為了隨后再次去除針對G418的抗性，產生的酵母菌株用ere重組酶載體pSH47轉化 (Guldener U， Heck S， Fielder T， Beinhauer JHegema皿JH. (1996) :A new effi，cient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jull ;24(13) :2519-24)。通過這種載體，ere重組酶在所述酵母中被表達，結果是兩個loxP 序列內的序列區將重組出去。結果是兩個loxP序列中僅一個和tet(^啟動子盒仍然包含 在基因IDH1的編碼序列前。結果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此適合在酵母菌株中 通過這種cre-lox系統整合或去除另外的基因。載體pSH47可以隨后通過在補充有尿嘧 啶(20mg/L)和F0A(5-氟乳清酸)(lg/L)的YNB瓊脂平板上反選擇再次去除。為此，攜帶 這種質粒的細胞必須首先在非選擇性條件下被培養，隨后在包含FOA的選擇性平板上被選 取。在這些條件下，僅那些本身不能夠合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情況下，這些是 不再包含質粒(pSH47)的細胞。 實施例6 :釀酒酵母GRFura3中在四環素_調節的tet07啟動子的控制下DIC1的 表達 用于tet07啟動子盒的編碼核酸序列通過PCR和標準方法被擴增，以便所得 到的片段由下面的成分構成loxP-kanMX-loxP-ADHlterm. -tet07operator_CYClprom. (YEAST13 :837-848(1997) ;Nucleic Acid Research 24(13) :1519-2524(1996))。作為引 物，寡核苷酸序列被選擇以便在5'和3'懸突分別包含DIC1基因的天然啟動子的5'或
243'序列，在退火片斷中包含loxP區的5'序列和CYClprom的3'序列。由此確保一方面包 含KanR和tet07啟動子的完整片段被擴增，另一方面這個片段可以隨后被轉化入酵母中， 通過同源重組，這個完整片段被整合在所述酵母的DICl基因座中，在基因DICl的編碼區
、戶-
目" 作為選擇標記物用于針對G418的抗性。得到的菌株釀酒酵母GRFura3r印r. DIGl包含在四環素調節的tet07啟動子和天然DICl終止子的控制下的基因DICl的拷 貝。為了隨后再次去除針對G418的抗性，產生的酵母菌株用ere重組酶載體pSH47轉化 (Guldener U，Heck S， Fielder T，Beinhauer J，Hegema皿JH. (1996) :A new effi，cient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jull ;24(13) :2519-24)。通過這種載體，ere重組酶在所述酵母中被表達，結果是兩個loxP 序列內的序列區將重組出去。結果是兩個loxP序列中僅一個和tet(^啟動子盒仍然包含 在基因IDH1的編碼序列前。結果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此適合在酵母菌株中 通過這個cre-lox系統整合或去除另外的基因。載體pSH47可以隨后通過在補充有尿嘧 啶(20mg/L)和F0A(5-氟乳清酸)(lg/L)的YNB瓊脂平板上反選擇再次去除。為此，攜帶 這種質粒的細胞必須首先在非選擇性條件下被培養，隨后在包含FOA的選擇性平板上被選 取。在這些條件下，僅那些本身不能夠合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這個情況下，這些是 不再包含質粒(pSH47)的細胞。 實施例7 :釀酒酵母GRFura3tTAr印r. SDH2r印r. IDH1 r印r. DICl中在組成性ADH1
啟動子的控制下PYC1、ACS1、CIT1、AC01、CIT2、 ICL1、MLS1和MDH3的表達 下面的描述應用于對于所述提及的基因的在轉錄上去調節的基因的整合的連續
執行，遵循下面的方案。 用于ADHlprom-PYCl (ACS1 、 CIT1 、AC01 、 CIT2、 ICL1 、MLS1 、MDH3) -TRPlterm的表達 盒的編碼核酸序列通過PCR和標準方法從載體pFlat-PYCl (ACS1、 CIT1、 ACOl、 CIT2、 ICL1、 MLS1、 MDH3)被擴增。得到的DNA片斷在Klenow處理后在EcoRV界面被平端克隆入載體 pUG6并導致載體pUG6-PYCl (ACS1 、 CIT1 、 AC01 、 CIT2、 ICL1 、MLS1 、MDH3)。在質粒分離后，載 體pUG6-PYCl (ACS1、 CIT1、 ACOl、 CIT2、 ICL1、 MLS1、 MDH3)的延伸的片段通過PCR被擴增， 以便得到的片段由下面的成分構成loxP-kanMX-loxP-ADHlprom-PYCl(ACSl、 CIT1、 ACOl、 CIT2、ICL1、MLS1、MDH3)色氨酸終止子。作為引物，寡核苷酸序列被選擇以便在5'和3' 懸突分別包含PYC1(ACS1、CIT1、AC01、CIT2、 ICL1、MLS1、MDH3)基因的5'或3'序列，在 退火片斷中包含loxP區的序列5'和色氨酸終止子的3'。由此確保一方面包含KanR和 PYC1 (ACS1 、CIT1 、AC01 、CIT2、 ICL1 、MLS1 、MDH3)的完整片段被擴增，另一方面這個片段可以 隨后被轉化入酵母中，通過同源重組，這個完整片段被整合在所述酵母的PYC1(ACS1、CIT1、 AC01、CIT2、 ICL1、MLS1、MDH3)基因座中。 作為選擇標記物用于針對G418的各自的抗性。得到的菌株釀酒酵母GRFura3tTA r印r. SDH2r印r. IDH1 r印r. DICldereg. PYC1 ACS1 CIT1AC01 ICL1 MLSl MDH3 CIT2包含在 tet07啟動子和天然終止子的控制下的基因SDH2、 IDH1、DIC1的拷貝以及在組成性ADH1啟 動子和TRP1終止子的控制下的基因PYC1、CIT1、ACS1、AC01、ICL1、MLS1、MDH3和CIT2的每 種的一個拷貝。為了隨后再次去除針對G418的抗性，分別產生的酵母菌株用cre重組酶載 體pSH47轉化(Gulde證U， HeckS， Fielder T， Beinhauer J， Hegema皿JH. (1996) :A固effi，cient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jull ;24(13) :2519-24)。通過這種載體，ere重組酶在所述酵母中被表達，結果 是兩個loxP序列內的序列區將重組出去。結果是兩個loxP序列中僅一個和各自的表達盒 盒仍然包含在最初的各自的基因座中。結果是酵母菌株再次失去G418抗性并由此適合在 酵母菌株中通過這種cre-lox系統整合或去除另外的基因。載體pSH47可以隨后通過在補 充有尿嘧啶(20mg/L)和F0A(5-氟乳清酸)(lg/L)的YNB瓊脂平板上反選擇被再次去除。 為此，攜帶這種質粒的細胞必須首先在非選擇性條件下被培養，隨后在包含FOA的選擇性 平板上被選取。在這些條件下，僅那些本身不能夠合成尿嘧啶的細胞可以生長。在這種情 況下，這些是不再包含質粒(PSH47)的細胞。 實施例8 :與相應的對照菌株釀酒酵母GRFura3相比，根據如上所述的本發明的酵 母菌株的酵母培養物中琥珀酸含量的測定。 根據如上所述的本發明的酵母菌株和釀酒酵母GRFura3各自在28。C和160rpm 在麗VIII培養基(Lang and Lomann， 1995)中以20ml培養物的量培養48小時。隨后， 500 iU的這種預培養物被轉移到50ml的相同培養基的主培養物，均在搖動燒瓶中在28°C 和160rpm被培養2天。在得到無細胞培養物上清液后，琥珀酸、乙酸和乙醇的含量通過HPCL 分析測定。結果是與對照菌株相比，根據本發明的酵母菌株存在強烈增加的琥珀酸濃度。
實施例9 :具有組成性活性還原性檸檬酸循環，用于生產有機酸，尤其是琥珀酸的 微生物。 還原性檸檬酸循環，S卩，從丙酮酸和草酰乙酸、蘋果酸和延胡索酸起始到琥珀酸的
檸檬酸循環的非環狀返回部分(圖3f.)是用于在葡萄糖上生產琥珀酸的最大摩爾產率的
先決條件。僅還原性檸檬酸循環結合乙醛酸循環在琥珀酸的生產期間允許通過NADH到
NAD+的再氧化和C02固定達到每mol葡萄糖1. 71mol的琥珀酸的最大產率。 基因PYC1的在轉錄上去調節的反應在實施例2和實施例7中解釋。PYC1編碼兩
種丙酮酸羧化酶之一，其催化丙酮酸到草酰乙酸的C02固定反應，其是還原性檸檬酸循環的
第一步。 細胞溶質蘋果酸脫氫酶(Mdh2p)催化下面的步驟，S卩，草酰乙酸到蘋果酸的反應， 其受到由葡萄糖誘導的增加的蛋白水解降解。 這種蛋白水解降解通過蘋果酸脫氫酶(Mdh2p)被表達為最初的12N-末端氨基酸 縮短的Mdh2p蛋白而被防止。為此，來自菌株釀酒酵母S288c的染色體酵母DNA的在"開放 閱讀框"(MDH2t， t =截短的，縮短的)的開始處相應縮短的MDH2基因通過PCR被擴增并提 供有限制連接物，隨后在組成性ADH1啟動子的控制下被整合入酵母染色體中。為了這種縮 短的基因在酵母釀酒酵母中的去調節的表達，組成性ADH1啟動子被使用，其通過長時間的 天然序列的修飾導致不依賴于葡萄糖和乙醇的組成性表達(Lang and Looman， 1995)。
用于在檸檬酸循環的還原性部分上的琥珀酸生產的下面的步驟是蘋果酸到延胡 索酸的反應。這種反應由酶延胡索酸酶(Fumlp)催化。蘋果酸到延胡索酸的反應是熱力學 上非常不利的，因為延胡索酸酶對延胡索酸具有的親和力是對蘋果酸的17倍。
因此，延胡索酸酶在酵母中被異源表達，其起源于生物體，其天然運行混合酸發 酵，因為這樣的生物體的延胡索酸酶的關于蘋果酸到延胡索酸的反應的熱力學比在釀酒酵 母中有利的多。
26
為此，來自菌株大腸桿菌(E. coli)JM109的染色體細菌DNA的基因f咖B通過PCR 被擴增并提供有限制連接物，隨后在組成性ADHl啟動子的控制下被整合入酵母染色體中。 為了這種基因在酵母釀酒酵母中的去調節的表達，組成性ADHl啟動子被使用，其通過長時 間的天然序列的修飾導致不依賴于葡萄糖和乙醇的組成性表達(Lang and Looman， 1995)。
用于在還原性檸檬酸循環上的琥珀酸模生產的最后的步驟是延胡索酸到琥珀酸 的反應。這種反應在細胞溶質中通過酶延胡索酸還原酶(Frdslp)被催化。這種酶的過度表 達增加了還原性琥珀酸生產的效率。為此，來自菌株釀酒酵母S288c的染色體酵母DNA的 FRDSl基因通過PCR被擴增并提供有限制連接物，隨后在組成性ADHl啟動子的控制下被整 合入酵母染色體中。為了這種縮短的基因在酵母釀酒酵母中的去調節的表達，組成性ADHl 啟動子被使用，其通過長時間的天然序列的修飾導致不依賴于葡萄糖和乙醇的組成性表達 (Xang and Looman, 1995) 通過酵母自身的異檸檬酸裂合酶(乙醛酸循環的主要酶之一)的磷酸化的葡萄 糖_誘導的蛋白水解降解或失活通過異源異檸檬酸裂合酶在酵母釀酒酵母中被表達而被 避免。這種酶起源于天然包含乙醛酸循環并是"Crabtree"-陰性的微生物，因為來自這樣 的生物體的異檸檬酸裂合酶不受到葡萄糖-誘導的負性調節，或者不受到在蛋白水平上的 蛋白水解降解。活性乙醛酸循環對于在主要碳源上的具有高產率的有機酸的有效生產是必 要的。 為此，來自菌株大腸桿菌(E. coli) JM109的細菌DNA的基因aceA通過PCR被擴增 并提供有限制連接物，隨后在組成性ADHl啟動子的控制下被整合入酵母染色體中。為了這 種基因在酵母釀酒酵母中的去調節的表達，組成性ADHl啟動子被使用，其通過長時間的天 然序列的修飾導致不依賴于葡萄糖和乙醇的組成性表達(Lang and Looman， 1995)。
實施例10 :具有減少的或失活的代謝物或葡萄糖阻遏，用于呼吸中心代謝的有機 酸生產的微生物的生產。 除了上面描述的實施例的措施，下面描述的措施可以是合理的，因為由此在所有 的變體中獲得更好的產率。 在存在葡萄糖時減少的葡萄糖阻遏通過特異性影響合適的負責葡萄糖阻遏的轉 錄因子和激酶獲得。這樣，有機羧酸，尤其是酵母的呼吸中心代謝的二羧酸和羥基脂肪酸， 如，例如琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、草酰乙酸在主要碳源上，如例如葡萄糖和其他己糖和戊 糖上的生產效率在生產時間和產率方面被提高。 在主要碳源上有機羧酸的生產效率的這種提高產生自下面的性質，具有減少的或 中止的葡萄糖阻遏的菌株與野生型相比包括下面的性質 碳通量通過檸檬酸和乙醛酸循環增加 所述菌株具有更高和更快的生長 乙醇和甘油形式的副產品的較少產生 乙醛酸循環被擴大 負責中心代謝中的co2固定的酶被表達到增加的程度 呼吸系統，如線粒體轉運系統、呼吸鏈、線粒體生源的所有基因和用于氧化還原
當量的交換的所有基因是有活性的 檸檬酸和乙醛酸循環的酶在蛋白質水平上從葡萄糖_誘導的負性調節被去除
為了在存在葡萄糖和其他主要碳源的時，實現葡萄糖阻遏的特異性減少，2種基因 被在轉錄上去調節或過度表達，其在存在葡萄糖時被強烈阻遏。為了這些基因在酵母釀酒 酵母中的去調節的表達，組成性ADH 1啟動子被使用，其通過長時間天然序列的修飾導致 不依賴于葡萄糖和乙醇的組成性表達(Lang and Looman， 1995)。 基因HAP4和SAK1被在轉錄上去調節。Hap4p是轉錄活化蛋白復合體Hap2/3/4/5 的部分，Saklp是用于磷酸化和進而Snfl/Snf4復合體的活化的主要激酶。為此，表達系統 被使用，其允許HAP4和SAK1的同時在轉錄上去調節表達。 兩種基因(HAP4和SAK1)通過PCR從菌株釀酒酵母S288c的染色體酵母DNA被擴 增并提供有限制連接劑，隨后在組成性ADH1啟動子的控制下被單獨地整合入酵母染色體 中。 為了在存在葡萄糖或其他主要碳源時獲得葡萄糖阻遏的特異性減少，另外的葡萄 糖阻遏級聯的基因缺失或由被調節的啟動子控制。這是基因REGl，其編碼Glc7p/Reglp I 型蛋白磷酸酶的調節亞基。非活性的Glc7p/Reglp磷酸酶導致Snfl/Snf4復合體被磷酸化 并由此保持活性，其非常有助于葡萄糖阻遏的減少或中止。 由于無活性基因REG1在酵母釀酒酵母中導致生長缺陷，所以由四環素調節的 tetO啟動子被包括在這個基因前。在羧酸生產過程的生長階段期間，所述基因REG1在四 環素可阻遏的tetO啟動子的控制下被表達。在生產階段期間，通過添加培養添加劑，如， 四環素，到培養基，所述基因表達和進而Reglp的酶活性以被調節的方式被去除。釀酒酵 母被修飾以致靶基因的天然啟動子例如，通過酵母基因組中的靶向整合被可阻遏的啟動子 交換，所述酵母菌株包含，如實施例1所描述的，tetO啟動子系統所需的轉錄反式激活蛋白 (tTA)。 在tet0啟動子下調節的基因REG1的實際實施可以完全按照實施例4到6實現， 僅置換被tet0啟動子控制的基因，基因REG1必須被使用。
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權利要求
分離的遺傳修飾的微生物，其中天然基因MDH2被基因MDH2的截短的變體置換或補充，和/或天然基因FUM1被來自不同于所述微生物的生物體的基因FUM1置換或補充，和/或其中基因FRDS1被過度表達，和/或基因PYC1和/或PYC2之一或二者被過度表達。
2. 根據權利要求1所述的微生物，其中基因MDH2的截短的變體編碼MDH2蛋白，其最初 的12個N-末端氨基酸，以及，任選地，C-末端脯氨酸被縮短。
3. 根據權利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物為酵母，尤其是選自包括"釀 酒酵母、酵母菌屬、復膜孢子酵母屬、類酵母屬、裂殖酵母屬、威克酵母屬、德巴利氏酵母屬、 漢遜酵母屬、有孢漢遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、克勒克酵母屬、假絲酵母屬、接合酵母屬、 0gataea、 Kuraishia、 Komagatael la、 Yarrowia、梅奇氏酵母屬、擬威爾酵母屬、Nakazawaea、 克魯維酵母屬、隱球酵母屬、孢圓酵母屬、布勒擲孢酵母屬、紅酵母、Willopsis、克勒克酵母 屬和擲孢酵母屬"的組，并且其中基因FUM1來自選自包括"大腸桿菌、產琥珀酸厭氧螺菌、 琥珀酸放線桿菌、Mannheimia succiniciproducens、谷氨酸棒桿菌"的組的生物體。
4. 根據權利要求1 3任一項所述的微生物，其中來自包括"FRDS1、PYC1和PYC2"的 組的基因的至少一種在第二外源、組成性活性啟動子的控制下，例如在ADH1啟動子的控制 下。
5. 根據權利要求1 4任一項所述的微生物，其中天然基因MDH2和FUM1 二者都被置 換和/或其中基因FRDS1和PYC1 二者都被過度表達。
6. 根據權利要求1 5任一項所述的微生物在琥珀酸生產中的應用。
7. 根據權利要求1 5任一項所述的微生物在用于琥珀酸生產的方法中的應用，其中 所述方法包括下面的步驟a) 任選地，在需氧條件下在生長培養基中培養并繁殖所述微生物，b) 隨后，任選地在厭氧條件下培養所述微生物，以及c) 在步驟b)之后或步驟b)期間，從培養物上清液分離琥珀酸，并任選地進行純化。
8. 根據權利要求7所述的應用，其中步驟a)被實施直到至少100g干生物量/l，優選 至少120g干生物量/l，最優選至少140g干生物量/1的細胞密度。
9. 根據權利要求7或8所述的應用，其中步驟b)被實施直到至少0.4mol/l，優選至少 0. 8mol/l，最優選至少1. 0mo1/1的琥珀酸濃度。
10. 根據權利要求7 9任一項所述的應用，其中步驟a)在20 35t:，優選28 3(rC 的溫度下實施，時間為1 1， OOOh，優選2 500h，最優選2 200h。
11. 根據權利要求7 10任一項所述的應用，其中步驟b)在15 4(TC，優選20 35°C的溫度下實施，時間為1 1， 000h，優選2 500h，最優選2 200h。
12. 用于生產根據權利要求1 5任一項的微生物的方法，其中在野生型微生物中或在相對于野生型被遺傳修飾或突變的初始生物體中，野生型 基因MDH2或FUM1之一或者二者被缺失或失活或被補充，其中MDH2基因和/或外源FUM1基因的各自的變體被引入到所述微生物中，并且所述 微生物被其轉化，和/或其中基因FRDS1、 PYC1和PYC2的至少一種，優選至少基因FRDS1和PYC1 二者，在第二 啟動子的控制下被引入到微生物中，并且所述微生物被其轉化。
13. 分離的遺傳修飾的微生物，其中基因DIC1與SDH2的至少一種或者二者以及基因IDH1在第一外源啟動子的控制下，其中所述第一外源啟動子被生長培養基的培養添加劑阻 遏并且在缺乏所述培養添加劑時是有活性的。
14. 根據權利要求13所述的微生物，其中額外地，基因FUM1、 0SM1、 MDH3和CIT2的至 少一種或幾種在所述第一外源啟動子的控制下。
15. 根據權利13或14所述的微生物，其中所述培養添加劑在所述生物體中不是內源性 的，優選為來自四環素組的抗生素，尤其是四環素。
16. 根據權利要求13 15任一項所述的微生物，其中所述啟動子選自四環素_調節的 tet0啟動子組。
17. 根據權利要求13 16任一項所述的微生物，其中所述微生物為酵母細胞。
18. 根據權利要求17所述的微生物，其選自包括"釀酒酵母、酵母菌屬、復膜孢子酵母 屬、類酵母屬、裂殖酵母屬、威克酵母屬、德巴利氏酵母屬、漢遜酵母屬、有孢漢遜酵母屬、畢 赤氏酵母屬、克勒克酵母屬、假絲酵母屬、接合酵母屬、0gataea、 Kuraishia、 Komagatael la、 Yarrowia、梅奇氏酵母屬、擬威爾酵母屬、Nakazawaea、克魯維酵母屬、隱球酵母屬、孢圓酵 母屬、布勒擲孢酵母屬、紅酵母、Willopsis、克勒克酵母屬和擲孢酵母屬"的組。
19. 根據權利要求13 18任一項所述的微生物，其中野生型基因SDH2和DIC2的至少 一種以及基因IDH1被缺失或失活，例如通過缺失這些基因的天然啟動子或這些基因的編 碼區。
20. 根據權利要求13 19任 一 項所述的微生物，其中組"PYC1 、 ACS 1 、 CIT1 、 AC01 、 ICL1、 MLS1和CIT2，任選地還有MDH3"的基因的一種或幾種不同的或全部被包含并在組成 性活性第二啟動子的控制下，優選在ADH1啟動子的控制下。
21. 根據權利要求13 20任一項所述的微生物在琥珀酸生產中的應用。
22. 根據權利要求13 20任一項所述的微生物在用于生產乙醛酸和/或檸檬酸循環 的羧酸的方法中的應用，其中所述方法包括下面的步驟a) 在需氧條件下在生長培養基中培養并繁殖所述微生物，b) 隨后，將所述微生物轉移到包含抑制第一啟動子的培養添加劑的生產培養基中，或 者將抑制第一啟動子的培養添加劑加入到所述生長培養基中，并任選地在厭氧條件下進行 培養，以及c) 在步驟b)之后或步驟b)期間，從培養物上清液分離羧酸，并任選地進行純化。
23. 根據權利要求22所述的應用，其中基因IDH1、 SDH2和DIC1在第一外源啟動子的控制下，所產生的羧酸為琥珀酸，或者其中基因SDH2和DIC1不在第一外源啟動子的控制下，其中基因IDH1、FUM1和0SM1在 第一外源啟動子的控制下，并且其中羧酸為延胡索酸，或者其中基因FUM1和0SM1不在第一外源啟動子的控制下，其中基因IDH1和MDH3在第一 外源啟動子的控制下，并且其中羧酸為蘋果酸，或者其中基因MDH3不在第一外源啟動子的控制下，其中基因IDH1和CIT2在第一外源啟動 子的控制下，并且其中羧酸為草酰乙酸。
24. 根據權利要求22或23所述的方法，其中步驟a)被實施直到至少100g干生物量/ l，優選至少120g干生物量/l，最優選至少140g干生物量/1的細胞密度。
25. 根據權利要求22 24任一項所述的應用，其中步驟b)被實施直到至少0. 4mo1/ l，優選至少0. 8mol/l，最優選至少1. Omol/1的羧酸濃度。
26. 根據權利要求22 25任一項所述的方法，其中步驟a)在20 35。C，優選28 30。C的溫度下實施，時間為1 1，000h，優選2 500h，最優選2 200h。
27. 根據權利要求22 26任一項所述的方法，其中步驟b)在15 4(TC，優選20 35°C的溫度下實施，時間為1 1， OOOh，優選2 500h，最優選2 200h。
28. 用于生產根據權利要求13 20任一項所述的微生物的方法， 其中在野生型微生物中或在相對于野生型被遺傳修飾或突變的初始生物體中，野生型基因SDH2和DIC1的至少一種或者二者以及基因IDH1被缺失或失活，以及其中基因SDH2和DIC1的至少一種或者二者以及基因IDH1在第一啟動子的控制下被 引入到所述微生物中，其中所述第一啟動子被生長培養基的培養添加劑阻遏并且在缺乏所 述培養添加劑時是有活性的，并且所述微生物被其轉化。
29. 根據權利要求28所述的方法，其中組"PYC1、ACS1、CIT1、AC01、ICL1、MLS1和CIT2， 任選地還有MDH3"的基因的一種或幾種不同的或全部在組成性活性第二啟動子的控制下被 引入到所述微生物中，并且所述微生物被其轉化。
30. 根據權利要求28或29所述的方法，其中第一啟動子為tet0啟動子，并且第二啟動 子為ADH1啟動子。
31. 分離的遺傳修飾的微生物，尤其是根據權利要求1 5或13 20任一項所述的微 生物，其中基因HAP4或SAK1之一被過度表達，或者其中基因HAP4和SAK1 二者都被過度表 達，和/或其中基因REG1被阻遏或缺失。
32. 根據權利要求31所述的微生物，其中所述微生物是Crabtree-陽性的酵母，尤 其是選自包括"釀酒酵母、酵母菌屬、復膜孢子酵母屬、類酵母屬、裂殖酵母屬、威克酵母 屬、德巴利氏酵母屬、漢遜酵母屬、有孢漢遜酵母屬、畢赤氏酵母屬、克勒克酵母屬、假絲酵 母屬、接合酵母屬、Ogataea、 Kuraishia、 Komagataella、 Yarrowia、梅奇氏酵母屬、擬成爾 酵母屬、Nakazawaea、克魯維酵母屬、隱球酵母屬、孢圓酵母屬、布勒擲孢酵母屬、紅酵母、 Willopsis、克勒克酵母屬和擲孢酵母屬"的組。
33. 根據權利要求31或32所述的微生物，其中基因HAP4或SAK1之一或者二者在第二 外源、組成性活性啟動子的控制下，尤其是在ADH1啟動子的控制下。
34. 根據權利要求31 33任一項所述的微生物在有機羧酸生產中的應用，尤其是在生 產琥珀酸、蘋果酸、延胡索酸、草酰乙酸、乳酸、乙酸、和/或蟻酸中的應用。
35. 根據權利要求31 34任一項所述的微生物在生產有機羧酸，尤其是琥珀酸的方法 中的應用，其中所述方法包括下面的步驟a) 任選地在生長培養基中在需氧條件下培養和繁殖所述微生物，b) 隨后，任選地在厭氧條件下培養所述微生物，以及c) 在步驟b)之后或步驟b)期間，從培養物上清液分離羧酸，并任選地進行純化。
36. 根據權利要求35所述的應用，其中步驟a)被實施直到至少100g干生物量/l，優 選至少120g干生物量/l，最優選至少140g干生物量/1的細胞密度。
37. 根據權利要求35或36所述的應用，其中步驟b)被實施直到至少0.4mol/l，優選 至少0. 8mol/l，最優選至少1. 0mo1/1的琥珀酸濃度。
38. 根據權利要求35 37任一項所述的應用，其中步驟a)在20 35。C，優選28 30。C的溫度下實施，時間為1 1，000h，優選2 500h，最優選2 200h。
39. 根據權利要求35 38任一項所述的應用，其中步驟b)在15 4(TC，優選20 35°C的溫度下實施，時間為1 1， OOOh，優選2 500h，最優選2 200h。
40. 用于生產根據權利要求31 33任一項所述的微生物的方法， 其中在野生型微生物中或在相對于野生型被遺傳修飾或突變的初始生物體中，野生型基因REG1被缺失或失活，和/或其中基因HAP4或SAK1的至少一種，優選二者在第二啟動子的控制下被引入到所述微 生物中，并且所述微生物被其轉化。
全文摘要
本發明涉及分離的遺傳修飾的微生物，其中基因SDH2和DIC1的至少一種以及基因IDH1在第一啟動子的控制下，其中所述第一啟動子通過培養添加劑被阻遏于生長培養基，在缺乏所述培養添加劑時所述啟動子是有活性的。作為包含“PYC1、ACS1、CIT1、ACO1、ICL1、MLS1和CIT2，以及任選地還有MDH3”的組的一部分的基因是組成性活性的。本發明還涉及這類微生物的應用，尤其是用于生產琥珀酸。
文檔編號C12N9/88GK101720357SQ200880020933
公開日2010年6月2日 申請日期2008年4月16日 優先權日2007年4月20日
發明者A·拉布, C·蘭, M·博特納, M·維恩 申請人:器官平衡有限責任公司