專利名稱：：用于病毒增殖的兩階段溫度分布的制作方法
技術領域：
：本發明涉及病毒增殖領域。
背景技術：
：在動物細胞培養基中的病毒增殖是在取決于病毒和用于增殖的宿主體系的特性的溫度條件下進行的。選擇特定的溫度用于細胞的生長(在細胞培養基或者胚卵的繁殖中)，接著選定溫度用于病毒的增殖。在大多數情況下，病毒增殖溫度低于細胞增殖溫度。對溫度敏感的病毒增殖涉及到在大約圍繞用于昆蟲細胞培養(隨著例如桿狀病毒產生)的20。C的溫度范圍內、以及在用于哺乳動物細胞培養中的病毒制備的直至約37。C的溫度下影響病毒增殖速度和抗原形成，使用對于每種病毒/寄主細胞組合的特定的最適條件。更高的溫度會影響感染動力學和病毒的穩定性。當病毒在37。C溫度下增殖時，在后續的病毒復制期間會經常觀察到降低的病毒滴度和更低的病毒抗原質量。這種影響對于用于疫苗生產的大規模病毒增殖可能具有不利的后果。本發明的目標在于提供改善的生長條件，其不會影響生產的用于疫苗目的的抗原質量。
發明內容本發明提供了一種用于病毒生產的方法，其中，一種以上寄主細胞被病毒感染，然后在第一溫度下培養(例如，在31。C至37。C的溫度下培養1至48小時)；并且隨后在第二溫度下培養，該第二溫度比第一溫度低(例如，低1至6。C)。然后收集這些培養步驟中所產生的病毒。現在令人驚訝地發現，對于許多病毒包括流感(正粘病毒)、羅斯河病毒(Alphaviridae)和西尼羅河病毒(黃病毒)，培養條件可以通過使用兩階段溫度分布而被實質性地改進。更高的溫度被應用于病毒增殖的第一階段，其可促進傳染性病毒顆粒的形成。在第二階段，采用較低的溫度，以便維持在更高溫度的增殖期間中獲得的初始高滴度，并且允許穩定的抗原的形成，該抗原可以被進一步用于免疫原性疫苗的生產。圖1:在Vero細胞中于(A)32。C和(B)36。C下增殖的新喀里多尼亞(NewCaledonia)病毒的抗原顯帶圖形。圖2:在感染以后在37°C下不同時間點羅斯河病毒(RossRiverVirus,RRV)感染的NaBr曲線圖。圖3:在感染以后在35。C下不同時間點羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。圖4:在感染之后在32。C下不同時間點的羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。圖5:在感染之后在35。C/32。C下不同時間點的羅斯河病毒感染的NaBr曲線圖。圖6:在37。C和35。C/32。C下感染的羅斯河病毒接種物的Westernblot。圖7:在感染之后在35。C下不同時間點的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖，同時附有顯微圖像。圖8:在感染之后在32。C下不同時間點的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖，同時附有顯微圖像。圖9:在感染之后在35。C/32。C下不同時間點的西尼羅河病毒感染的NaBr曲線圖，同時附有顯微圖像。具體實施例方式本發明的一個方面是實現允許獨立優化和控制下述條件的在此描述的兩階段溫度分布(1)用于寄主細胞多周期感染的活性病毒的形成；(2)在后續的復制階段中獲得高滴度的維持；以及(3)在后續的生產工藝階段中的抗原形成。在本發明的一種優選實施方式中，所述病毒是正粘病毒、cc-病毒或黃病毒。優選病毒是流感病毒，并且在特定的實施方式中，優選選自下組甲型流感和乙型流感、羅斯河病毒和西尼羅河病毒。雖然在此提供的實施例顯示了通過使用本發明的兩溫度方法進行改進的針對這些病毒的抗原的生產，但本發明預期的其他病毒的非限制性例子包括選自于由RNA病毒家族所構成的組的病毒，比如呼腸孤病毒(Reoviridae)、小RNA病毒(Picornaviridae)、環狀病毒(Caliciviridae)、披膜病毒(Togaviridae)、沙#立病毒(Arenaviridae)、反轉錄病毒(Retroviridae)、黃病毒(Flaviviridae)、正禾占病毒(Orthomyxoviridae)、畐U粘病毒(Paramyxoviridae)、本雅病毒(Bunyaviridae)、彈狀病毒(Rhabdoviridae)、纖絲病毒(Filoviridae)、冠狀病毒(Coronaviridae)、星形病毒(Astroviridae)、或波納病毒(Bornaviridae);以及選自于由DNA病毒家族所構成的組，比如腺病毒(Adenoviridae)、乳多空病毒(Papovaviridae)、細小病毒(Parvoviridae)、皰疹病毒(Herpesviridae)、痘病毒或肝DNA病毒(Hepadnaviridae)。在特定的實施方式中，病毒選自下組；甲型流感/Panama(巴拿馬)./2007/99、甲型流感/NewCaledonia(新咯里多尼亞)/20/99、乙型流感/Shangdong(商東)/7/97、乙型流感/Malaysia(馬來西亞)/2506/2004、甲型流感/Hiroshima(廣島)/52/2005、以及甲型流感/SolomonIslands(所羅門群島)/3/2006。能夠在任何適合病毒產生的細胞中制備出病毒。優選細胞是動物細胞培養物或細胞系。這樣的細胞可以來自特定的組織或胚細胞。動物優選是哺乳動物或鳥。本發明的各種具體實施方式可以利用犬科細胞系、嚙齒動物細胞系、鳥類細胞系或靈長類動物組織細胞系。例如，在特定的實施方式中，細胞可以是MDCK細胞、CHO細胞、perC6細胞、HEK293細胞、或其他的通常在病毒增殖中使用的細胞。在一些特定的實施方式中，細胞是上皮細胞，尤其優選腎上皮細胞，比如非洲綠猴的Vero細胞。在本發明特定的實施方式中，在不包含動物血清蛋白的培養基中培養細胞。這樣的培養基不包括，例如，牛血清或其部分，比如胎牛血清。這樣的培養基被稱為"無血清蛋白培養基"。在病毒增殖期間，可以將病毒增殖所必需的蛋白酶比如胰蛋白酶加至培養基。在一些實施方式中，這樣的蛋白酶可以由非動物來源衍生得到，比如來自細菌或重組體來源；或者可以由動物來源衍生得到。在在此使用的術語的意義內，這樣的補加培養基仍然被認為是無血清蛋白培養基。在本發明優選的實施方式中，本發明的方法以工業規模進行。在本發明的一些實施方式中，該方法在如下規模的細胞培養基中進行大于50升的細胞培養基、50至100升的細胞培養基、100至500升的細胞培養基、500至1000升的細胞培養基、或者大于1000升的細胞培養基(例如，在6000升、10,000升、甚至更大的生物反應器中進行)。在本發明的一些實施方式中，本發明的方法在攪拌罐式生物反應器中進行。在本發明優選的方法中，第一病毒增殖溫度低于用于給定的寄主細胞類型的細胞培養增殖溫度。在一些實施方式中，第一溫度是在32。C至37。C之間，優選在33。C至36。C之間，更優選在34。C至35.5。C之間，并且尤其優選35。C。在其他實施方式中，第一溫度是在30。C至36。C之間，優選在30。C至35。C之間，更優選在31。C至35。C之間，更優選在31。C至34。C之間，更優選在32。C至34。C之間，更優選在32。C至33.5。C之間，進一步優選在33。C和34。C之間，并且最優選33.5。C;在一些實施方式中為33。C。特別地，對于較大的細胞培養體積(1000升和更大)，較低的第一溫度范圍可以是優選的。第一溫度可以是至少30。C、31。C、32°C、33°C、34°C、35。C、或36。C;或者低于38。C、37.5°C、37°C、36°C、35.5°C、或35°C。在第一溫度下的細胞培養可以超過1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30小時；或者少于60、58、56、54、52、50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14或12小時。在附加的實施方式中，第二溫度相比第一溫度下降1.5。C至5。C，優選下降2°C至4°C，更優選下降2.5°C至3.5°C，并且最優選下降3°C。溫度可以降低至少1°C、2°C、2.5°C、3°C、或4。C;或者降低小于6°C、5°C、4°C、3.5°C、3°C、2.5°C、或2°C。在其他的實施方式中，第二溫度的范圍是29°C至35°C，優選30°C至34°C，更優選31。C至33°C，更優選31.5。C至32.5°C，并且最優選是32°C。第二溫度可以高于28。C、29°C、30°C、或31。C;或者低于35°C、34°C、33°C或32°C。該方法還可以用于病毒抗原的生產。因此，在另一個方面，本發明提供一種用于生產病毒或病毒抗原的方法，其中，按在此描述的方法生產病毒，并且分離病毒或病毒抗原。可以使用標準方法進行分離，所述標準方法用于分離并任選地用于提純，包括分解細胞或者收獲細胞上清液、然后分離抗原(例如，離心或層析)。在另一個實施方式中，在純化之前或之后使病毒破碎或失活(例如，根據WO05/11800所述的方法)。另外，可以制備病毒疫苗。疫苗是抗原物質的免疫原性組合物，其中，抗原物質可以是非傳染性的病毒、其外殼、顆粒或其抗原。當被給藥疫苗時，其在宿主(例如，哺乳動物比如人類，或鳥)中導致免疫作用。疫苗接種或許會引起對疫苗的特定反應和一些較輕的炎癥，但是與對于由完全存活的病毒所引起的感染的反應相比，通常對疫苗接種的反應被大大降低。以下通過下述實施例，進一步闡明本發明，所述實施例僅是示例性的，并非是以任何方式限制本發明。實施例許多病毒膜蛋白要求翻譯后修飾，以產生有復制能力的病毒。在流感病毒中，前體血球凝集素(HA)分子(HAO)蛋白水解裂解成HA1和HA2亞基，在HA2的氨基末端區域處產生致融融合功能區，該裂解對于病毒進入細胞而言是必不可少的。因此，在細胞培養物中傳染周期的開始不得不被添加的蛋白酶催化。對于疫苗生產工藝，使用經Y射線照射的來自豬來源的胰蛋白酶。普通的用于在細胞培養物比如Vero細胞中的流感生長的溫度分布，是一種其中溫度恒定在例如33°C(對于乙型流感菌株)至37°C(對于甲型流感菌株)處的曲線(參見，例如GovorkavaEAetal.JournalofVirology,Vol.70,Nr.8,Aug.1996,p.5519-5524)。本發明的一個方面在于，通過10L生物反應器系統的小規模實驗，實現在初始傳染階段期間升高的溫度分布，這對于流感生產工藝總體周期時間而言具有積極的效果。另外，可以得到在測量為Vero蛋白質/SRD比率的抗原純度上的積極效果。為證明這些思想，按照在此描述的方法，進行100L規模實驗。實施例1:在32和36°C下的甲型流感/NewCaledonia/20/99生產在32°C下和在36°C下生物反應器操作的Vero培養物用甲型流感/NewCaledonia/20/99病毒感染。設定的參數pH、p02、細胞密度以及加至培養物的胰蛋白酶含量相似，并且反映了用于流感抗原生產的大規模條件。上升的溫度對病毒產率和周期時間的影響進行比較，結果見表l。表l:HA和殘留攝氧率(("殘留OUR")，與第0天的傳染周期*相比)的對比。溫度HAHA殘留OUR殘留OUR第2天第3天(%)*第2天(%)*第3天(2nHAU/50nL)(2nHAU/50^iL)32。C68805036°C7820<5在兩天后，觀察到36。C培養物的殘留攝氧率為20W，其比第3天低5%。在36。C下流感病毒的增殖導致高傳染性、以及因此與32。C條件下相比總培養時間的減少。相反，32。C培養導致分別在第2天和第3天更高的80%和50%殘留攝氧率。最終的HA滴度是相似的。然而，從經過具有NaBr梯度的超速離心的抗原分離實驗來看，顯帶圖形的抗原性轉變在36。C條件下在培養第3天出現(圖1B)，反之通過UV254nm檢測器測量的洗脫分布導致32。C培養下同等高的、但更對稱的波峰(圖1A)。就產品產率、尤其純度而言，36。C的條件可能因此具有一些缺點。對于當前的生產工藝，由蔗糖梯度來收獲病毒抗原。對于36。C實驗，可以因此推斷部分抗原將遷移至低密度部份(圖1B)。實施例2:在32、33、以及34。C下的甲型流感/Panama/2007/99生產8為了研究提高的培養溫度對Panama病毒產率和周期時間的影響，并行操作三個10L生物反應器系統，溫度分別設置在32。C，33。C和34。C。所有其他的參數設置點與實施例1中描述的相似。在表2中，提供了三個生物反應器系統的工藝周期時間。在達到20%殘留攝氧率(代謝耗氧量減小80%)之后，停止培養，并且比較傳染周期動力學。對于34。C實驗，可以實現周期時間減少21小時(hrs)。表2:要求達到20%殘留攝氧率的作為工藝溫度函數的工藝時間的對比(與傳染周期第0天相比)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將培養上清液離心，根據標準方案用Benzonase核酸酶和福爾馬林處理。失活的收獲物(MVHs)通過蔗糖梯度超速離心法進行純化(參見表3)。表3:由來自溫度實驗的蔗糖梯度純化病毒所獲得的甲型流感/Panama/2007/99抗原產率、SRD/蛋白質比率和Vero-蛋白質雜質的對比。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表2中可以得出結論升高的溫度條件導致減少的周期時間。然而，如表3所示，升高的溫度條件(例如，33。C和34。C)對總體病毒抗原產率和純化的病毒的質量具有消極影響，如同通過SRD/蛋白質比率和Vero-蛋白質/SRD比率驗證的那樣。因此觀察到在更高溫度下病毒抗原下降的純度。實施例3:具有在35。C下早期病毒擴增的甲型流感/NewCaledonia/20/99生產該實施例涉及的培養試驗中，對于流感病毒生產工藝的第一個24小時設置為提高的溫度。在100升規模處用甲型流感/NewCaledonia/20/99病毒感染Vero細胞培養物。普通的溫度分布(即，整個發酵工藝的32。C溫度設置點)與具有在35。C下的早期病毒擴增的改進工藝的對比被進行。該新工藝的特點在于在35。C下初始病毒復制24小時感染后(postinfection,p丄)，接著在32°C下培養直到91hrs感染后。在表4中，給出了來自100升規模操作的蔗糖梯度純化病毒的甲型流感/NewCaledonia/20/99抗原純度(SRD/蛋白質比率)和Vero-蛋白質雜質的對比。表4:甲型流感/NewCaledonia/20/99抗原純度(SRD/蛋白質比率)和Vero-蛋白質雜質作為不同的溫度分布的的函數的對比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實驗的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>病毒復制的第一個24小時期間在35。C下、隨后溫度降低至32。C的甲型流感/Panama/2007/99病毒生產與當前的32。C恒溫工藝相比具有數個優點。一般來講，流感病毒抗原的質量可以得到改善，如同被SRD/蛋白質比率和Vero-蛋白質/SRD比率證實的那樣。隨著感染時間的明顯下降，產率略微較低，但是雜質分布明顯更好，尤其是對于Vero細胞蛋白質的相對含量而言。流感病毒抗原純度在流感疫苗生產中是個因素。普遍接受的是，對于在Vero細胞中流感病毒的復制，用于前體血球凝集素裂解的蛋白水解條件和適當的溫度條件是一些重要因素。在本發明的示例性實驗中，表明在病毒復制早期階段期間具有升高的溫度的溫度分布導致在蔗糖梯度步驟中抗原的改進。另外，就周期時間而論，第一個24小時在35°C下的流感病毒生產對應于更好的工藝性能。甲型流感/Panama/2007/99和甲型流感/NewCaledonia/20/99被用作模型體系，用于證明兩溫度病毒增殖是有用的。以10和100升規模進行的培養試驗結果顯示了病毒增殖工藝的第一個24小時由32°C改變為35°C的益處。實施例5:在35°C下早期病毒擴增18hrsp丄的甲型流感/Hiroshima/52/2005生產比對在35°C卜—36hrsp丄、接著32°C直至病毒增殖結束的甲型流感/Hiroshima/S2/200S生產該實施例顯示了高溫周期持續時間的變化對50L被甲型流感/Hiroshima/52/2005病毒感染的Vero培養物的抗原產率、SRD/蛋白質比率、以及Vero蛋白質/SRD比率的影響。對于兩個單獨的樣本，在溫度下降至32。C以前，35。C溫度分別地保持18hrsp.i.和36hrsp丄。對包含病毒的上清液進行收獲、失活、并通過超速離心進行純化。在表6中，比較了來自50升規模操作的蔗糖梯度純化病毒的甲型流感/Hiroshima/52/2005抗原純度(SRD/蛋白質比率)禾QVero-蛋白質雜質。表6:甲型流感/Hiroshima/52/2005抗原產率、純度(SRD/蛋白質比率)和Vero-蛋白質雜質的對比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實驗的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在35。C下18hrsp.i.和36hrsp丄的甲型流感/Hiroshima/52/2005病毒生產分別得到類似的產率和純度分布(表6)。從該結果看，可得出如下結論在早期病毒增殖期間提高的溫度的持續時間和降低溫度直至收獲的持續時間能在兩階段溫度分布中被較大地改變。實施例6:在不同溫度(34°C，35T和36。C)下早期病毒擴增18hrsp丄、接著降低3。C(至31。C，32。C和33。C)直至病毒增殖結束的乙型流感/Malaysia/2506/2004生產該實施例涉及在32升至80升Vero培養物的病毒增殖期間不同的兩階段溫度分布的應用，所述培養物用乙型流感/Malaysia/2506/2004病毒感染。在降低3。C以前(即，分別為31。C、32°C、以及33。C)，較高溫度34。C、35。C和36。C保持18hrsp丄。對包含病毒的上清液進行收獲、失活、并通過超速離心進行純化。在表7中，比較了不同溫度分布下的來自32升至80升規模操作的蔗糖梯度純化病毒的乙型流感/Malaysia/2506/2004抗原產率、純度(SRD/蛋白質比率)和Vero-蛋白質雜質。表7:乙型流感/Malaysia/2506/2004抗原產率、純度(SRD/蛋白質比率)和Vero-蛋白質雜質的對比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實驗的病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在34。C至36。C下18hrsp.i.、接著降低3。C直到病毒增殖結束的乙型流感/Malaysia/2506/2004病毒的生產得到類似的產率和純度分布(表7)。從該結果看，可得出如下結論在早期病毒增殖期間提高的溫度的范圍和降低溫度直至收獲時間的范圍能在兩階段溫度分布中被較大地改變。實施例7:在不同溫度(33.5。C,35。C和36.5。0下早期病毒擴增18hrsp丄、接著降低3。C(至30.5。C,32。C和33.5。C)直至病毒增殖結束的甲型流感/SolomonIslands/3/2006生產該實施例涉及在32升至50升Vero培養物的病毒增殖期間不同的溫度分布的應用，所述培養物用甲型流感/SolomonIslands/3/2006病毒感染。在降低3°C(即，分別為30.5。C、32。C禾卩33.5。C)以前，較高的溫度33.5。C、35。C和36.5。C保持18hrsp.i.。對包含病毒的上清液進行收獲、失活、并通過超速離心進行純化。在表8中，比較了來自32升至50升規模操作的蔗糖梯度純化病毒的甲型流感/SolomonIslands/3/2006抗原產率、純度(SRD/蛋白質比率)和Vero-蛋白質雜質。表8:甲型流感/SolomonIslands/3/2006抗原產率、純度(SRD/蛋白質比率)和Vero隱蛋白質雜質的對比。使用蔗糖梯度來純化來自溫度實驗的病毒。生產條件產率(mgSRD/L收獲物)SRD/蛋白質比率(mg/mg)Vero-蛋白質/SRD比率(mg/mg)36.5。C下18hrsp.i./33.5。C直至結束(54hrsp丄)(32L生物反應器)4.00.530.0535。C下18hrsp.i./32°C直至結束(55hrsp.i.)(50L生物反應器)3.20.720.0333.5°C下18hrsp.i./30.5。C直至結束(69hrsp.i.)(50L生物反應器)3.00.740.02分別在33.5。C、35。C、以及36.5。C下18hrsp.i.、接著降低3。C直至病毒增殖結束的甲型流感/SolomonIslands/3/2006病毒生產得到類似的產率和純度分布(表8)。在升高的溫度下的更高產率還得到降低的純度，然而，隨著降低3。C在病毒增殖的未尾，這些雜質保持在相對低的水平。使用具有降低的溫度的兩階段溫度分布(例如33.5°C/30.5°C)，能夠取得類似的產率。然而需要更長的病毒增殖周期時間(仍然少于70hrs)方可達到這些類似的產率。純度分布，尤其對于寄主細胞特異性的Vero-蛋白質，隨著較低的溫度范圍(包括3。C溫度變化)而被典型地改進(參見表7中在34。C/31。C下乙型流感/Malaysia的結果)。從該結果看，可得出如下結論對于甲型流感和乙型流感兩類菌株，在早期病毒增殖期間提高的溫度的范圍和降低溫度直至收獲時間的范圍能在兩階段溫度分布中被較大地改變。實施例8:羅斯河病毒生產在2L反應器中于不同溫度下生產羅斯河病毒("RRV")。研究的溫度是37°C、35。C、32°C以及35。C下30hrs和30hrs后32。C下直至感染結束。在90hrsp丄之后，確定動力學參數，并且在下述時間間隔(單位小時)處收集樣本1-18、1-42、1-42、1-54、1-66、I-76和I-卯。用于NaBr分析的樣本用20nL/mL福爾馬林1.85%處理，并且于37。C下保溫48hrs。在病毒增殖期間測量殘留攝氧率(OUR)，以便監控受感染細胞的代謝活性。通過微載體培養物的顯微圖像來定量細胞脫附率(celldetachmentrate)。還確定了TCID50(50%組織培養感染劑量)。實驗條件是，在感染前，pH7.1的PBS和20。/。pO2、1.0g/L葡萄糖。在1-18時加入1.0g/L葡萄糖，并且停止灌注。在I-42后，如果葡萄糖降低到小于1.0g/L，則加入葡萄糖。結果如表9所示。離心情況1-18:5000g;I-42I-66:10000g;I-78I-90:15000g。14表9:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>所有四個培養的NaBr曲線圖以4個間隔時間(A:54h;B:66h;C:78h;D:90h)顯示于圖2至5中。用下述抗體進行Westernblot:(I)RR(ATCCVR373)，超免疫腹水液，小鼠；N.I.H.(1:1000);以及(2)抗小鼠IgG，Sigma,Cat#:A-4656,Lot#:63H8830(1:5000)。結果根據表10提供于圖6中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在兩個高溫(37。C和35。C)下的接種中，感染動力學相當大地增加，同時在42hrs后細胞脫離比率為100%，并且在53hrs之后殘留的02為大約50%。在較低溫度(32。C和35。C/32。C)下的方法相對較慢。這在1-18時的滴度分析中也是顯而易見的。然而，在I-42以后，所有的方法都達到大約1E09TCID50/mL。在較低溫度下的方法顯示出接近感染結束時更穩定的滴度(>lEO9TCID50/mL，直至1-76)。在兩種方法中，直至1-76，能夠測量出20%的殘留OUR。在所有的實驗中，在I-53以后，達到在NaBr梯度中的最大峰高。反之，在35。C接種中，對于所有的1-66樣本以及1-90樣本，測量出較低的波峰。因為溫度的提高，使得在37。C和35。C實驗期間葡萄糖水平下降更快。因為感染動力學的提高，后來沒有代謝活性是可測定的。在所有的實驗中，葡萄糖水平最后都類似。開始時快速的病毒增殖并且直至感染結束時的穩定的滴度僅在兩階段溫度實驗G5。C直至I-30，然后32。C)期間被建立。在這些條件下，在NaBr梯度實驗中測量到最高波峰，其直至I-78時也是穩定的。而且，對于35°C/32。C實驗，在Westernblot中檢測到更多穩定的條帶。實施例9:西尼羅河病毒實驗在2L反應器中于不同溫度下生產西尼羅河病毒。研究的溫度是35°C、32。C、以及35。C下30hrs和30hrs后32。C直至感染結束。收集90h內的動力學參數。在下述時間間隔處(單位為hrs)收集樣本1-18、1-30、1-42、1-42、1-52、1-66、1-74以及1-90。用于NaBr分析的樣本用20uL/mL福爾馬林1.85%處理，并且在37°C下保溫48hrs。條件是，在感染前pH7.1，20%pO2，以及1.0g/L葡萄糖。在1-18時加入1.0g/L葡萄糖，并且停止灌注。結果提供在表ll中，并且圖7-9顯示了NaBr曲線圖和顯微圖像。通過微載體培養物的這些顯微圖像來定量細胞脫附率。表11:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權利要求1.一種用于生產病毒的方法，該方法包括提供已經被病毒感染的寄主細胞；在31℃至37℃的第一溫度下培養感染的寄主細胞1至48小時；隨后在比所述第一溫度低1℃至6℃的第二溫度下培養感染的寄主細胞；以及收集上述培養步驟中所產生的病毒拷貝。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒是正粘病毒、ot-病毒或黃病毒。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是流感病毒。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述病毒選自下組甲型流感和乙型流感。5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是羅斯河病毒。6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒是西尼羅河病毒。7.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞來自動物細胞培養物或細胞系。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞是上皮細胞。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞是腎上皮細胞。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞是Vero細胞。11.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一溫度的范圍為32。C至37。C。12.如權利要求ll所述的方法，其特征在于，所述第一溫度的范圍是33。C至36。C。13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一溫度的范圍是34。C至35.5。C。14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二溫度比所述第一溫度低1.5。C至5。C。15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二溫度比所述第一溫度低2。C至4。C。16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二溫度的范圍是29。C至35。C。17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述第二溫度的范圍是30。C至34。C。18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述第二溫度的范圍是31。C至33。C。19.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞在接種以后直接培養。20.—種用于生產病毒或病毒抗原的方法，其中，由如權利要求1所述方法生產出來的病毒獲得所述產生的病毒或病毒抗原，并且分離所述產生的病毒或病毒抗原。21.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒被破碎。22.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述病毒被失活。23.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括制備所述病毒的疫苗的步驟。24.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述在第一溫度下的培養是至少兩個小全文摘要本發明提供了一種用于生產病毒的方法，該方法包括提供已經被病毒感染的寄主細胞并且在兩種不同溫度下培養被感染的寄主細胞。隨后收集培養步驟中所產生的病毒。通過使用兩階段溫度培養工藝，可以得到高滴度和改進的純度。文檔編號C12N7/02GK101688186SQ200880021212公開日2010年3月31日申請日期2008年4月30日優先權日2007年5月4日發明者利奧波德·格里伯格,曼弗雷德·賴特,沃爾夫岡·蒙特申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司