遺傳修飾的光合生物的高通量篩選的制作方法

專利名稱：：遺傳修飾的光合生物的高通量篩選的制作方法遺傳修飾的光合生物的高通量篩選交叉參考本申請要求下列美國臨時申請的優先權和權益=Mayfield等人于2007年6月1日提交的標題為“使用光合生物產生生物燃料”的USSN60/941，452；Mayfield等人于2008年3月20日提交的標題為“使用遺傳修飾的生物產生生物質降解酶”的USSN61/070，384;以及Mayfield等人于2008年3月20日提交的標題為“高通量篩選遺傳修飾的光合生物”的USSN61/070,437。這些在先申請中的每一個通過引用并入本文。參考并入本說明書提及的所有公開和專利申請通過引用并入本文，其程度如同每個單獨的公開或專利申請被具體并單獨地指出通過引用并入。
背景技術：
：燃料變得越來越昂貴。同時，燃料精制與污染物的產生和全球溫室效應相關。在工業中存在尋找更廉價、更安全以及對環境更加無害的方式產生燃料的日益增加的需要。從生物原料產生燃料的方法的開發是未來能源藍圖的主要部分。從生物原料生產燃料的最重要的因素之一是將某些分子結構例如纖維素消化或還原為可公認為用于燃料產生方法例如發酵的底物的分子種類的能力。分子生物學和基因工程有希望用于大量生物活性分子的生產，所述生物活性分子可用于產生這些燃料。例如，生產能夠將有機原料分解為燃料的酶有希望解決對可選的燃料增加的需要。使用基因工程技術用于產生這些酶的主要優勢是該方法能夠產生大量所期望的蛋白。在許多情況下，從非工程化分泌來源獲得足量生物原料的僅有的其它方法是通過從產生該試劑的生物的細胞純化自然發生的生物原料。因此，在基因工程到來之前，能夠降解有機原料的酶只能通過大量培養生物，通常為細菌或真菌物種并提取蛋白來分離。對于用于燃料生產，這些方法通常是復雜的并且經濟上受限制的。雖然基因工程提供方法以產生大量生物原料，特別是蛋白和核酸，但是對目前可用的方法有局限性。細菌提供適合于產生這種酶的環境；但是，一些細菌產生的副產品會污染燃料源。因此，即使細菌可用于產生生物原料，可能需要另外的步驟例如純化或精制以獲得生物活性原料和/或生物燃料。而且，非光合系統的使用需要添加昂貴的糖類或其它有機碳源以飼養重組生物。另外，通常存在與建造發酵罐相關的大量的資金投資。重組蛋白還可在真核細胞中產生，包括例如，真菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，其可提供必要的環境將表達的蛋白加工為生物活性劑。但是，這些系統通常要承受同樣的成本限制(糖類/有機碳源和發酵罐)。因此，存在這樣方法的需要以方便地產生具有生物活性的酶，該方法可產生大量酶和/或提供與產生降解酶相容的宿主生物。發明概述本文提供的是用于產生生物質降解酶和生物燃料的組合物和方法。本文公開的發明提供用于產生生物質降解酶的新的方法，其通常在遺傳修飾的光合生物例如藻類和藍細菌中。本文還提供的是用于轉化光合生物的組合物和方法以及篩選轉化子的方法。因此，本發明的一方面提供載體，其包括編碼生物質降解酶的核酸和設置用于在非維管光合生物中表達核酸的啟動子。本發明的載體可含有編碼多于一種的生物質降解酶的核酸，以及在其它情況下，可含有編碼共價連接生物質降解酶的多肽的核酸。生物質降解酶可包括分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶和分解木質素的酶。更具體地，生物質降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶或木質酶。編碼生物質降解酶的核酸可源自真菌或細菌來源，例如，那些編碼綠色木霉(Trichodermaviride)中外切-β-葡聚糖酶、里氏木霉(Trichodermareesei)中外切-β-葡聚糖酶、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)中外切-β-葡聚糖酶、里氏木霉中內切-β-葡聚糖酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中內切-β-葡聚糖酶、里氏木霉中β-葡糖苷酶、黑曲霉中β-葡糖苷酶、里氏木霉中內切木聚糖酶和黑曲霉中內切木聚糖酶的核酸。其它編碼生物質降解酶的核酸可以是與來自這些生物的基因同源。本發明的載體還可含有選擇標記，使得能夠直接篩選轉化的生物。本發明的載體可以能夠在多種光合生物中穩定轉化，這些光合生物包括但不限于光合細菌(包括藍細菌(cyanobacteria))(cyanophyta)(prochlorophyta)(rhodophyta)藻(chlorophyta)、不等If更毛藻(heterokontophyta)、tribophyta、灰@藻(glaucophyta)>chlorarachniophytes、果藻(euglenophyta)、類目艮蟲(euglenoids)、If更藻(haptophyta)>金藻(chrysophyta)、β急藻(cryptophyta)、β急滴蟲(cryptomonads)、甲藻(dinophyta)、雙Ii更·(dinoflagellata)>IiI^(pyrmnesiophyta)>±^(bacillariophyta)>Jt^(xanthophyta)>eustigmatophyta>ft"Ife^(raphidophyta)(phaeophyta)禾口i^iH^S物(phytoplankton)。本發明的其它載體能夠在萊茵衣藻(C.reinhardtii)、鹽生杜氏藻(D.salina)或雨生紅球藻(H.pluvalis)中穩定轉化。還有其它載體含有傾向于生物(例如，萊茵衣藻)的密碼子偏好的核酸。本發明的具體載體含有本文提供的序列(SEQIDN0.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26或SEQIDNO.27)。還提供包括本發明載體的宿主細胞。在一些情況下，宿主細胞是非維管光合生物，例如，分類為光合細菌(包括藍細菌)、藍藻、原綠藻、紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、類眼蟲、鞭藻、金藻、隱藻、隱滴蟲、甲藻、雙鞭藻、定鞭藻、硅藻、黃藻、eustigmatophyta、針胞藻、褐藻和浮游植物的生物。本發明的宿主細胞也可以是微觀藻類物種，包括但不限于萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻。在其它情況下，宿主細胞可以是多細胞光合生物的一種或多種細胞。對于一些實施方式，宿主細胞可以在缺乏光照下生長和/或在有機碳源存在下生長。本發明還提供組合物，其含有一種或多種外源生物質降解酶，所述降解酶源自一種或多種非維管光合生物。在一些情況下，這些組合物還可含有非維管光合生物的元件。酶與生物元件的比值(W/V)可以是至少110，或經發現元件可僅以痕量存在。組合物中的一些包括至少一種下列酶外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶和/或木質酶；其中酶或多種酶從一種或多種下列生物分離萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、雨生紅球藻、光合細菌(包括藍細菌)、藍藻、原綠藻、紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、類眼蟲、鞭藻、金藻、隱藻、隱滴蟲、甲藻、雙鞭藻、定鞭藻、硅藻、黃藻、eustigmatophyta、針胞藻、褐藻和浮游植物。對于一些實施方式，生物可以在缺乏光照下生長和/或在有機碳源存在下生長。本發明還提供含有多個載體的組合物，其中每個載體編碼不同的生物質降解酶和在葉綠體中用于表達生物質降解酶的啟動子。這些組合物可含有編碼具體酶的具體載體的多個拷貝。在一些情況下，載體將含有編碼分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶和/或分解木質素的酶的核酸。更具體地，所述多個載體可含有能夠表達外切-β-葡聚糖酶、內切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內切木聚糖酶和/或木質酶的載體。該實施方式的一些載體能夠插入至葉綠體基因組，這些插入可導致破壞轉化的葉綠體的光合能力。其它載體插入至葉綠體基因組并不破壞轉化的葉綠體的光合能力。一些載體提供用于表達生物質降解酶，其被隔離在轉化的葉綠體中。還有其它載體可含有本文提供的特定序列(SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22或SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26或SEQIDNO.27)。本發明還提供含有如上所述的載體組合物的藻類細胞，并具體地提供含有載體組合物的萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻細胞。對于一些實施方式，細胞可以在缺乏光照下生長和/或在有機碳源存在下生長。本發明的另一個載體編碼多個不同的生物質降解酶和在非維管光合生物中用于表達生物質降解酶的啟動子。生物質降解酶可以是一種或多種分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質素的酶。在一些載體中，多個不同的生物質降解酶是外切-β-葡聚糖酶、內切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木質酶和內切木聚糖酶中的兩種或更多種。在一些實施方式中，多個酶是可操作連接的。在其它實施方式中，多個酶是作為一個功能蛋白復合體表達。一些載體插入至宿主細胞基因組并不破壞生物的光合能力。編碼多個不同的酶的載體可引起酶的產生，其被隔離在轉化的生物的葉綠體中。本發明還提供用編碼多個不同的酶的載體轉化的藻類細胞或藍細菌細胞。在一些情況下，藻類細胞是萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻。在其它情況下，藍細菌細胞是集胞藻屬(Synechocystis)或聚球菌屬(Synechococcus)或螺旋藻屬(Athrospira)的種。對于一些實施方式，生物可以在缺乏光照下生長和/或在有機碳源存在下生長。本發明還另一方面提供產生一種或多種生物質降解酶的遺傳修飾的葉綠體。這些酶可以是分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質素的酶，更具體地，可以是外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶、木質酶和/或其組合。在一些實施方式中，一種或多種酶被隔離在葉綠體中。本發明還提供含有本發明的遺傳修飾的葉綠體的光合生物。還另一方面提供用于制備生物質降解酶的方法。該方法包括步驟(1)轉化光合、非維管生物以產生所述生物質降解酶或增加所述生物質降解酶的產生以及(2)從所述轉化的生物收集生物質降解酶。轉化可以用組合物進行，所述組合物含有編碼不同生物質降解酶的多個不同載體。轉化還可用編碼多個不同的生物質降解酶的載體進行。任何或所有酶可以是可操作互相連接的。在一些情況下，葉綠體被轉化。本發明的該方法可具有一種或多種另外的步驟，其包括(a)收獲轉化的生物；(b)干燥轉化的生物；(c)從細胞培養基收獲酶；(d)機械破壞轉化的生物；或(e)化學破壞轉化的生物。該方法還可包括進一步通過高效液體色譜純化酶。在一些情況下，轉化的生物是藻類或光合細菌，例如藍細菌。對于一些實施方式，生物可以在缺乏光照下生長和/或在有機碳源存在下生長。本發明還另一個方法能夠制備生物燃料。該方法的一個步驟包括用源自光合非維管生物的一種或多種生物質降解酶處理生物質一段足夠的時間以降解至少一部分所述生物質。產生的生物燃料可以是乙醇。該方法的酶可含有至少痕量的所述光合非維管生物，所述酶源于所述光合非維管生物。另外，用于該方法一些實施方式的酶包括分解纖維素的、分解半纖維素的和分解木質素的酶。用于該方法一些方面的特定酶包括外切_葡聚糖酶、內切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內切木聚糖酶和/或木質酶。該方法的生物可包括光合細菌(包括藍細菌)、藍藻、原綠藻、紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、類眼蟲、鞭藻、金藻、隱藻、隱滴蟲、甲藻、雙鞭藻、定鞭藻、硅藻、黃藻、eustigmatophyta、針胞藻、褐藻和浮游植物。用于該方法的其它生物是微觀藻類，包括但不限于萊茵衣藻、鹽生杜氏藻和雨生紅球藻。對于一些實施方式，生物可以在缺乏光照下生長和/或在有機碳源存在下生長。多種類型的生物質——包括農業廢棄物、造紙廠廢棄物、玉米秸稈、小麥秸稈、大豆秸稈、柳枝稷、浮萍、楊樹、木片、木屑、濕酒糟、干酒糟、人類廢棄物、新聞紙、回收紙產品或人類垃圾——可以是用本發明的該方法處理。生物質還可源自高-纖維素含量生物，例如柳枝稷或浮萍。用于該方法的酶或多種酶可以從所述生物釋放，該釋放可涉及化學或機械破壞生物的細胞。在可選的實施方式中，酶或多種酶選自所述生物，然后從培養基中收集。生物質的處理可涉及發酵過程，其可利用微生物而不是產生酶或多種酶的生物。在一些情況下，非維管光合生物可以添加至糖化槽。該本發明的該方法還可包括收集所述生物燃料的步驟。收集可以通過蒸餾進行。在一些情況下，生物燃料與另一種燃料混合。本發明的另外方法提供制備至少一種生物質降解酶，其通過轉化葉綠體以制備生物質降解酶。生物質降解酶可以是分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶或分解木質素的酶，以及具體地可以是外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶或木質酶。在一些情況下，生物質降解酶被隔離在轉化的葉綠體中。該方法可進一步涉及通過化學或機械方法破壞轉化的葉綠體以釋放生物質降解酶或多種酶。在一些情況下，多種酶將通過轉化的葉綠體產生。生物質降解酶可以是真菌或細菌來源，例如，外切葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶、木質酶或其組合。本發明還另一個方法提供篩選轉化的非維管光合生物，其通過從所述生物的葉綠體中擴增第一核酸序列，從所述生物的葉綠體擴增第二核酸序列以及測定所述生物的原生質狀態，其基于從所述第一序列和第二序列擴增的結果。在一些情況下，第一和第二擴增步驟同時進行。第一核酸序列可以是內源葉綠體基因組序列，第二核酸序列可以是至少部分來自外源核酸。在一些情況下，來自葉綠體的第三核酸序列可以作為對照擴增。該第三核酸序列可以是野生型序列，其在外源核酸或多個外源核酸整合后保持完整。其中該第三核酸被擴增，該擴增可與第一或第二擴增步驟同時進行或所有三個擴增可以同時進行。對于該方法的擴增，本文提供的特異性引物——SEQIDNO.USEQIDNO.2,SEQIDNO.3,SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQIDNO.7,SEQIDN0.8、SEQIDNO.9,SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14或SEQIDNO.15-可以使用。第一和/或第二核酸的擴增可利用大于三十個循環的PCR。在一些情況下，測定原生質狀態通過視覺分析從擴增步驟得到的產物進行。一種或多種擴增可以使用實時或定量PCR進行。由該方法測定的原生質狀態可以是同質性(homoplasmy)，測試的生物可以是微觀藻類，具體地，是微觀藻類物種萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻的其中之一。在該方法中，生物可含有外源核酸，所述外源核酸含有感興趣的基因和選擇標記。感興趣的基因可編碼生物質降解酶，例如分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質素的酶。具體地，生物質降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶或木質酶。另外，外源核酸可以是本文具體提供的核酸之一——SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.2USEQIDNO.22、SEQIDNO.23,SEQIDNO.24,SEQIDNO.25,SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。本發明還提供含有同質葉綠體群體的非維管光合生物，其中所述葉綠體群體包括外源核酸以及其中葉綠體群體的同質狀態由至少兩個不同的PCR反應測定。在一些情況下，葉綠體群體是多于一個的葉綠體。非維管光合生物可以是微觀藻類，具體地是萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻物種之一。可以使用至少兩個同時進行的不同PCR反應篩選生物。這些PCR反應可利用本文公開的具體引物之一——SEQIDN0.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3,SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQIDNO.7,SEQIDNO.8,SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14或SEQIDNO.15。PCR反應可利用大于三十個循環。生物可含有外源核酸，其包括至少一種感興趣的基因和選擇標記。該基因可編碼生物質降解酶，具體地是分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質素的酶。甚至更具體地，生物質降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶或木質酶。存在于本發明該生物中的外源核酸可以是本文具體所述的核酸之一——SEQIDΝ0.19,SEQIDNO.20,SEQIDNO.2USEQIDNO.22,SEQIDNO.23,SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。本文提供的另一個方法用于產生遺傳修飾的同質非維管光合生物。該方法涉及用外源核酸轉化生物的至少一個葉綠體，擴增第一核酸序列和第二核酸序列，以及測定生物的原生質狀態，其基于擴增步驟的結果。第一和第二核酸序列可以在葉綠體基因組內。另夕卜，第一核酸序列可以是內源葉綠體序列。第二核酸序列可以至少部分來自外源核酸。該方法還可涉及從葉綠體擴增第三核酸序列作為對照。在一些情況下，第三核酸是野生型序列，其在整合外源核酸后保持完整。該方法可涉及PCR，其使用本文具體公開的引物之一——SEQIDN0.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14或SEQIDNO.15。第一和第二核酸序列的擴增可利用大于三十個循環的PCR。使用該方法的原生質狀態測定可涉及視覺分析擴增(多個)步驟的產物。由該方法測定的原生質狀態可以是同質性，生物可以是微觀藻類，具體地是萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻物種之一。外源核酸可含有至少一種感興趣的基因和選擇標記。在一些情況下，感興趣的基因編碼生物質降解酶，具體地編碼分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質素的酶。甚至更具體地，生物質降解酶可以是外切_β_葡聚糖酶、內切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、內切木聚糖酶或木質酶。而且，外源核酸可以是本文具體所述之一-SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDN0.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24,SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。本發明的另一個實施方式是試劑盒，其用于測定遺傳修飾的非維管光合生物的原生質狀態。這種試劑盒可含有擴增引物(多個擴增引物)，用于擴增與內源序列相應的葉綠體基因組的第一核酸序列；以及擴增引物(多個擴增引物)，用于擴增葉綠體基因組的第二核酸序列，其是引入的或非自然發生的序列。試劑盒還可含有PCR緩沖液和/或用于擴增對照核酸序列的擴增引物(多個擴增引物)。試劑盒可含有本文具體公開的一種或多種PCR引物--SEQIDNO.USEQIDNO.2,SEQIDNO.3、SEQIDNO.4,SEQIDNO.5,SEQIDNO.6,SEQIDNO.7,SEQIDNO.8,SEQIDNO.9,SEQIDNO.10,SEQIDNO.IUSEQIDNO.12,SEQIDNO.13,SEQIDNO.14或SEQIDNO.15。本發明試劑盒中用于擴增第一核酸序列的引物(多個引物)可結合至少一部分的psbA5，UTR、psbA編碼序列、psbC5，UTR、psbD5，UTR、atpA5’UTR或3HB基因座。在一些情況下，用于擴增第二核酸序列的引物(多個引物)的至少一個可結合編碼生物質降解酶的序列的至少一部分，例如分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質素的酶。由第二核酸編碼的具體的生物質降解酶可以是外切_葡聚糖酶、內切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內切木聚糖酶或木質酶。引物可擴增本文具體公開的一種或多種序列的至少一部分——SEQIDΝ0.19、SEQIDNO.20、SEQIDΝ0·21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28,SEQIDNO.29、SEQIDNO.30或SEQIDNO.31。另外，試劑盒可含有使用說明書。附圖簡述本發明的新的特征在所附權利要求中具體說明。可通過參考下列闡明說明性實施方式的詳述獲得對本發明特征和優勢的更好理解，其中利用本發明的原則，附圖如下圖1圖解了藻類細胞的轉化、選擇、確認和測量酶的產生。圖2圖解了用于將基因插入至葉綠體基因組的兩個構建體。圖3圖解了用于PCR篩選轉化子的引物對以及預期的野生型、異質和同質菌株的條帶分布。圖4圖解了轉化內切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖5圖解了轉化外切-β_葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖6圖解了轉化β-葡糖苷酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖7圖解了轉化內切木聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖8圖解了測定由轉化的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆產生的內切-β-葡聚糖酶蛋白的水平。圖9是本發明一個實施方式的示意圖，其顯示產生的用于將多個基因插入至葉綠體基因組的構建體。圖10圖解了轉化內切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析結果。圖11圖解了轉化β-葡糖苷酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖12是用于插入至葉綠體基因組的兩個外源DNA構建體的示意圖。圖13是用于插入至藍細菌基因組的兩個外源DNA構建體的示意圖。圖14圖解了轉化內切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖15圖解了轉化內切木聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖16圖解了轉化外切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和Western印跡分析的結果。圖17圖解了細菌產生的生物質降解酶的活性。發明詳述本文所用的技術和科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常理解的意思，除非另外定義。本文參考對本領域普通技術人員已知的各種原料和方法。闡明重組DNA技術一般原理的標準參考著作包括Sambrook等，“MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.,1989；Kaufman等編輯，"HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine，，，CRCPress,BocaRaton,1995；以及McPherson編輯,“DirectedMutagenesis:APracticalApproach",IRLPress,Oxford,19910用于本發明的選擇方面，教導酵母遺傳學的一般方法和原理的標準參考文獻包括=Sherman等“LaboratoryCourseManualMethodsinYeastGenetics，，,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986；以及Guthrie等，"GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology",Academic,NewYork,1991。當提供數值范圍時，應理解的是除非內容另有說明，在該范圍上限限定和下限限定之間的每個介于其間的數值，至下限限定的單位的十分之一也是具體地公開的。包括在所述范圍內的任何所述的數值或介于其間的數值與所述范圍內的任何其它所述或介于其間的數值之間的每個較小范圍。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括在范圍內或排除在范圍以外，并且界限之一或兩個包括在或兩個均不包括在較小范圍的每個范圍也是被包括的，其中服從于在所述范圍內任何具體排除的界限。當所述范圍包括界限之一或兩個時，排除那些包括的界限之一或兩個的范圍也是被包括的。本發明涉及通過遺傳修飾的生物生產酶，例如，生物質降解酶。本發明另一方面涉及組合物和方法，用于使用生物原料來產生產物，例如乙醇，其使用由光合微生物例如但不限于藻類產生的生物質降解酶。通常地，光合生物不具有降解生物質所有必要的酶。本發明利用將外源核酸引入藻類細胞，特別是引入那些細胞的葉綠體的能力。使用分子生物學和基因工程產生表達酶的和/或表達酶促途徑的藻類菌株的一個優勢是產生大量活性酶的潛力。構建遺傳操作的藻類菌株的一個方法如圖1的流程圖所示。可見，藻類細胞(例如，萊因衣藻(Chlamydomonasreinhardti)、鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)、雨生紅球藻(Hematococcuspluvalis))用編碼感興趣的基因——通常為生物質降解酶——的核酸轉化。在一些實施方式中，轉化可將核酸引入宿主藻類細胞的任何質體(例如，葉綠體)。在引入外源核酸之后，轉化的細胞通常鋪于選擇培養基上。該方法還可包括幾個篩選步驟。最初，通常進行初次轉化子的篩選以測定克隆哪個具有外源核酸的正確插入。可以取顯示正確整合的克隆并再篩選以確保遺傳穩定性。這種方法確保轉化子含有感興趣的基因。在許多情況下，這種篩選通過聚合酶鏈反應(PCR)進行；但是，可以使用任何其它合適的本領域已知的技術。許多不同的PCR方法是本領域已知的(例如，嵌套式PCR、實時PCR)。對于任何給定的篩選，本領域普通技術人員將認識到PCR成分可以變化以獲得最佳的篩選結果。例如，當在破壞的藻類細胞上進行PCR時，因為許多這類生物具有鎂螯合劑，鎂濃度可根據需要向上調節。在這些情況下，鎂濃度可根據需要向上或向下調節(與購得的PCR試劑盒中的標準濃度比較)0.1、0·2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2,1.3,1.4、1.5,1.6,1.7,1.8、1.9或2.OmM0因此，調節后，PCR反應的最終鎂濃度可以是例如0.7,0.8、0.9、1·0、1·1、1·2、1·3、1·4、1·5、1·6、1·7、1·8、1·9、2·0、2·1、2·2、2·3、2·4、2·5、2·6、2·7、2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5mM或更高。具體的例子在本文所述實施例中使用；但是，本領域普通技術人員將認識到其它PCR技術可用于代替所述的具體方案法。篩選具有外源核酸正確整合的克隆后，通常地篩選存在編碼的蛋白的克隆。蛋白表達篩選通常通過Western印跡分析和/或酶活性分析進行。確認核酸整合和/或蛋白表達后，選擇的克隆可以進行擴增用于通過生物質降解產生生物燃料，首先以較小的體積:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、6061、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72，73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多升。在最初擴增后，可以更大數量進行生物質更大規模的降解。部分封閉的生物反應器系統的一個例子顯示于圖1，第6步。但是，用于生物質降解和/或生物燃料產生的轉化的菌株的生長也可以在人造結構中完成，例如水池、溝渠、水槽和/或堆填池。可選地，菌株也可直接在自然發生的水體中生長，例如，在海洋、海水、湖泊或河流。在某些情況下，轉化的菌株在乙醇生產工廠或其它設施附近生長。可選地，生物質降解細胞可以在產生CO2的地區附近生長(例如，發電廠、混凝土廠、煉油廠、其它工業設施、城市或高速公路，等等)。同樣，本文公開的方法進一步考慮商業方法，用于在制造和催化燃料生產的同時，通過在乙醇生產廠附近培養本文所述的一種或多種修飾的生物，將碳信用(carboncredit)銷售給乙醇廠或其它設施或產生CO2的地區。本發明考慮通過轉化宿主細胞(例如，藻類細胞例如萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、雨生紅球藻和藍細菌細胞)和/或生物——包括具有編碼一種或多種不同生物質降解酶(例如，分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶、木聚糖酶、木質酶和纖維素酶)的核酸的宿主細胞——制造生物質降解酶。在一些實施方式中，可生產單個酶。例如，可產生將預處理的纖維素片段分解為雙葡萄糖分子(纖維二糖)的纖維素酶或將纖維二糖分解為葡萄糖的纖維素酶。一些宿主細胞可以用編碼一種或多種酶的多個基因轉化。例如，單個轉化的細胞可含有編碼整個生物降解途徑的外源核酸。途徑的一個例子可包括編碼外切_葡聚糖酶(作用于纖維素末端鏈)、內切_葡聚糖酶(作用于纖維素鏈的內部)、β_葡糖苷酶(避免反應抑制劑/降解纖維二糖)和內切木聚糖酶(作用于半纖維素交聯)的基因。這種轉化了整個途徑的細胞和/或從它們中提取的酶可降解生物質的某些組分。構建體可含有相同基因的多拷貝，和/或編碼來自不同生物的相同酶的多個基因，和/或在編碼序列的一個或多個部分具有突變的多個基因。可選地，通過用途徑的各個酶轉化宿主細胞，然后將產生各個酶的細胞組合可產生生物質降解途徑。通過改變多個轉化的菌株的相對比例，該方法可進行酶的組合使其更具體地與感興趣的生物質匹配。例如，將兩倍于表達途徑中第一種酶的細胞可添加至混合物，其中反應途徑的第一步驟是限制性步驟。在用編碼酶的構建體轉化后，培養宿主細胞和/或生物。可以從生物/細胞收集生物質降解酶。可以通過本領域已知的任何方法收集，包括但不限于濃縮細胞、機械或化學破壞細胞以及從細胞培養物和/或細胞裂解液純化酶。可使細胞和/或生物生長，然后通過任何方式收集酶或多種酶。提取酶的一個方法是通過收獲宿主細胞或一組宿主細胞，然后干燥宿主細胞。然后通過粉碎細胞以暴露酶收獲來自干燥的宿主細胞的酶或多種酶。然后將粉碎的細胞的總產物用于降解生物質。許多從天然細胞提取蛋白的方法是本領域熟知的，也是本文考慮的(例如，引入外源核酸構建體，其中編碼酶的序列可操作地連接至編碼分泌信號的序列——分泌的酶從生長培養基分離)。從細胞/生物和/或周圍培養基提取蛋白后，可從粗提取物純化蛋白，以使該酶可包括總蛋白的百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或更高。純化步驟包括但不限于使用HPLC、親和柱和基于抗體的純化方法。提取和利用生物質降解酶也可通過在宿主細胞中表達含有編碼生物質產生_調節分子的核酸的載體來完成。在該實施方式中，宿主細胞產生生物質，也產生生物質降解酶。然后生物質降解酶可降解宿主細胞產生的生物質。在一些情況下，用于生產生物質降解酶的載體可以不必持續地具有活性。這些載體可包括一個或多個可活化的啟動子和一個或多個生物質降解酶。這些啟動子激活生物質降解酶的產生，例如，在生物質已生長至足夠密度或達到某種成熟度時。本發明的方法可通過將重組核酸分子引入葉綠體進行，其中該重組核酸分子包括第一多核苷酸，其編碼至少一個多肽(即，1、2、3、4或更多)。在一些實施方式中，多肽可操作地連接至第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或隨后的多肽。例如，在生物降解途徑中的幾個酶可以是直接或間接連接的，以使一旦由途徑中的一個酶產生產物，該產物接近途徑中的下一個酶。對于葉綠體轉化，本發明的一個主要優勢是利用重組核酸構建體，其含有選擇標記和一個或多個感興趣的基因。通常地，通過用兩個構建體共轉化葉綠體來對葉綠體進行轉化，這兩個構建體一個含有選擇標記，第二個含有感興趣的基因。這種轉化子的篩選由于多種原因是費力和費時的。首先，使一些轉化的生物生長所需要的時間長。第二，必須同時存在選擇標記和感興趣基因的情況下篩選轉化子。通常，通過Southern印跡對感興趣基因進行二次篩選(參見，例如PCT/US2007/072465)。本發明的構建體(圖2、圖9和圖12)可進行基于PCR的篩選方法，其中可使用對插入和野生型序列特異的引物組合篩選轉化子(圖3，道G-基因特異反應；C-對照反應；WT-野生型反應；M-多重)。該方法提供快速篩選方法并比舊的技術先進。例如，對接收未連接的標記的轉化子的選擇固有地產生較低百分比的具有轉基因的克隆。由于這個原因，從初次轉化獲得同質系的可能性很低。通過將標記和感興趣的基因連接，獲得具有該轉基因的轉基因克隆，特別是同質克隆的可能性在第一次傳代(pass)時提高。篩選轉化子的具體PCR方案在以下實施例中詳述，但是本領域普通技術人員應認識到可以改變這些方案以提供轉化子的定量分析。例如，可以利用不同比例的具體反應的引物以將插入拷貝數與對照反應比較。可以進行這樣的變化，其中多重反應(圖3，M排)同時或分開進行。插入拷貝數的測定在一些實施方式中可能是重要的，其中感興趣的外源基因最佳的表達水平部分地由基因拷貝數確定。例如，藻類宿主細胞(例如，萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、雨生紅球藻)的轉化，其引起外源核酸并入在細胞中小于一半的葉綠體基因組拷貝中，可產生感興趣的基因較少的或不可檢測的表達。可選地，外源核酸并入在細胞葉綠體基因組所有拷貝中可產生較少的或不可檢測的感興趣基因的表達，其中存在很少的基因組原始拷貝(例如，定量PCR分析應可進行同質克隆的排除，其具有較低的插入拷貝數，并因此可能不能產生足夠多的感興趣基因和/或多肽)。在其它實施方式中，可以是外源核酸并入的最優水平。在一些情況下，外源DNA可編碼蛋白，其中當它存在于拷貝數具體范圍之中時，無論通過轉錄、翻譯或其它控制機制，被最優產生。因此，這種外源DNA拷貝數的測定——例如通過定量PCR，可進行轉化的生物的選擇和/或產生，其以有效水平產生感興趣的蛋白。另外，本發明的重組核酸分子可以被可操作地連接至第二和/或其后的核苷酸序列。例如，編碼生物降解途徑酶的核苷酸序列可以被可操作地連接以使這些序列的表達可以用單個誘導刺激控制或由單個轉錄激活子控制。這些系統與細菌操縱子(例如，大腸桿菌(EscherischiacolDLac操縱子)相似。但是，本發明中可操作地連接的核苷酸序列的這些分組是合成的并被設計為在植物質體中發揮功能，優選地被并入葉綠體基因組。如本文所用，術語“可操作地連接”意思是兩個或多個分子互相關聯定位以使它們作為單個單元發揮作用并影響歸因于一個或兩個分子或其組合的功能。例如，編碼多肽的多核苷酸可以可操作地連接至轉錄或翻譯調控元件，在這種情況下，該元件賦予其調控多核苷酸的作用，其類似于該調控元件影響在細胞中與其正常相連的多核苷酸序列的方式。第一多核苷酸編碼序列還可以可操作地連接至第二(或更多)編碼序列，以使嵌合多肽可以從可操作地連接的編碼序列表達。從這樣的構建體產生的嵌合多肽可以是融合蛋白，其中兩個(或更多)編碼的肽被翻譯為單個多肽，即，通過肽鍵，或直接地或帶有短的間隔區地共價連接。在葉綠體中，基因表達調控通常地發生在轉錄后和通常在翻譯起始過程中。該調控取決于葉綠體翻譯裝置，以及核-編碼的調控因子(參見Barkan和Goldschmidt-Clermont,Biochemie82:559_572，2000；Zerges,Biochemie82:583_601，2000)。葉綠體翻譯裝置通常地類似細菌中的裝置；葉綠體含有70S核糖體；具有缺乏5'帽和通常不含有3'多聚腺嘌呤化的尾的mRNA(Harris等，Microbiol.Rev.58=700-754,1994)；以及通過選擇試劑例如氯霉素在葉綠體和細菌中抑制翻譯。本發明的一些方法利用核糖體結合序列(RBS)相對于編碼序列的適當定位。以前已注意到RBS的這種設置引起植物葉綠體中的粗放翻譯(參見美國申請2004/0014174，通過引用并入本文)，也注意到該多肽在葉綠體中表達多肽的優勢是該多肽不通過通常由核基因表達的多肽穿越的細胞區室進行，并且因此，不進行某些翻譯后修飾例如糖基化。同樣，由本發明的一些方法產生的多肽和蛋白復合體可預期的不經這些翻譯后修飾而產生。僅通過背景方式提供下列討論，并且申請人不試圖將公開的發明以范圍或通過理論限制于葉綠體基因調控機制的公開。在葉綠體中，核糖體結合和適合的翻譯起始位點選擇被認為至少部分由順式作用RNA元件調節。潛在調控子的一個例子已在葉綠體mRNA的5'UTR'中鑒定(Alexander等，Nucl.AcidsRes.26:2265_2272，1998；Hirose和Sugiura,EMBOJ.151687-1695，1996；Mayfield等，J.CellBiol.1271537-1545，1994；Sakamoto等，PlantJ.6:503_512，1994，其中每個通過引用并入本文)。這些元件可與核-編碼的因子相互作用。許多葉綠體mRNA含有類似原核生物RBS元件的元件(Bonham-Smith和Bourque，Nucl.AcidsRes.17:2057_2080，1989；Ruf和Kossel，FEBSLett.240:41_44，1988，其中每個通過引用并入本文)。但是，如幾項研究已顯示，葉綠體翻譯中這些RBS序列的功能利用性還不清楚，其區分這些元件在翻譯上的作用(Betts和Spremulli，J.Biol.Chem.26926456-26465,1994；Hirose等，FEBSLett.430257-260,1998；Fargo等，Mol.Gen.Genet.257:271_282，1998；Koo和Spremulli,J.Biol.Chem.269:7494_7500，1994；Rochaix,PlantMol.Biol.32:327_341，1996)。由于缺乏葉綠體RBS元件的共有序列以及由于產生的以研究這些推定的RBS序列的突變可能已改變5'UTR中其它重要序列的內容，這些結果的解釋十分復雜。本發明的一些方面(例如，載體)可包括RBS。這些RBS可化學合成，或可從自然發生的核酸分子分離(例如，從葉綠體基因分離)。另外，對于RBS，具有5'UTR的實施方式可包括轉錄調控元件，例如啟動子。對于本發明所用的RBS，5'UTR可以是化學合成的或可從自然發生的核酸分子分離。可用于本發明的5'UTR的非限制性例子包括但不限于atpA5'UTR、psbC5'UTR、psbD5'UTR、psbA5'UTR、rbcL5’UTR禾口/或16SrRNA5'UTR0核糖核苷酸序列可進一步包括起始密碼子(例如，AUG密碼子)，其可操作地連接至RBS。起始密碼子可以是內源的(例如，在克隆的基因中自然發生的)或可合成的(例如，在連接多肽或PCR引物中插入)。可通過本領域已知的任何方法獲得分離的核糖核苷酸序列，方法包括但不限于化學合成，使用酶促方法產生(例如，使用依賴DNA的RNA聚合酶或依賴RNA的RNA聚合酶從DNA或RNA模板產生)。編碼本發明核糖核苷酸的DNA模板可化學合成，可從自然發生的DNA分子分離，或可源自被修飾為具有所需要特征的自然發生的DNA序列。在本文中廣泛使用的術語“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”意思是通過磷酸二酯鍵連接在一起的兩個或多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。同樣，這些術語包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成的多聚脫氧核糖核酸序列或類似物，并且可以是單鏈或雙鏈，以及DNA/RNA雜交。而且，本文所用的術語包括自然發生的核酸分子，其可從細胞分離，以及合成的多核苷酸，其可由例如化學合成的方法或酶促方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)制備。應認識到的是，使用不同術語僅為了討論方便，以便區分例如組合物的不同組分，除了本文所用的術語“合成的多核苷酸”是指已被修飾的以反映葉綠體密碼子使用的多核苷酸。通常，包括多核苷酸的核苷酸是自然發生的脫氧核糖核苷酸，例如連接至2'-脫氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶，或連接至核糖的核糖核苷酸，例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶。但是，根據使用，多核苷酸也可含有核苷酸類似物，包括非自然發生的合成的核苷酸或修飾的自然發生的核苷酸。核苷酸類似物是本領域熟知的并且是可購得的，如作為含有這些核苷酸類似物的多核苷酸(Lin等，Nucl.AcidsRes.225220-5234,1994Jellinek等，Biochemistry3411363-11372,1995；Pagratis等，NatureBiotechnol.15:68_73，1997)。通常，磷酸二酯鍵連接本發明多核苷酸的核苷酸，但是可以利用其它鍵，包括硫二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、肽-樣鍵和本領域已知的任何其它鍵以產生合成的多核苷酸(Tam等，Nucl.AcidsRes.22:977_986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13:351360，1995)。多核苷酸，其包括自然發生的核苷酸和磷酸二酯鍵，可化學合成或可使用重組DNA方法，使用合適的多核苷酸作為模板產生。作為比較，多核苷酸——其包括核苷酸類似物或共價鍵而不是磷酸二酯鍵，通常是化學合成的，雖然酶例如T7聚合酶可將某些類型的核苷酸類似物并入多核苷酸，因此，可用于從合適的模板重組地產生這種多核苷酸(Jellinek等，上文，1995)。用于實踐本發明方法的多核苷酸可以從任何生物分離。通常地，用于實踐本發明的生物降解酶由來自細菌或真菌的核苷酸序列編碼。這種酶和其它們來源的非限制性例子顯示于表I。這些多核苷酸可以通過本領域已知的任何方法分離和/或合成，所述方法包括但不限于克隆、亞克隆和PCR。編碼多核苷酸的一個或多個密碼子可偏向于反映葉綠體密碼子使用。大部分氨基酸由兩個或多個不同(簡并)密碼子編碼，并被充分意識到各種生物優選于其它密碼子來利用某些密碼子。這些優選的密碼子使用，也在葉綠體中使用，在本文是指“葉綠體密碼子使用”。已報道萊因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的密碼子偏好。參見美國申請2004/0014174。當用于指密碼子時，術語“偏好”意思是多核苷酸中密碼子序列已被改變以使密碼子是在靶中優選使用的一個，靶偏好是例如，藻類細胞、葉綠體或類似物。偏好葉綠體密碼子使用的多核苷酸可重頭合成，或可使用常規重組DNA技術——例如通過位點定向突變方法——進行遺傳修飾以改變一個或多個密碼子以使它們偏好葉綠體密碼子使用。葉綠體密碼子偏好可在不同植物中有不同偏愛，其包括例如，與煙草相比在藻類葉綠體中。通常，選擇的葉綠體密碼子偏好反映植物的葉綠體密碼子使用，該植物用本發明核酸轉化。例如，如果萊茵衣藻(C.reinhardtii)是宿主，那么葉綠體密碼子使用偏向于反映藻類葉綠體密碼子使用(在第三密碼子位置約74.6%AT偏好)。本發明的一種方法可使用編碼第一多肽和至少第二多肽的多核苷酸進行。因此，多核苷酸可編碼例如第一多肽和第二多肽；第一多肽、第二多肽和第三多肽；等等。而且，任何或所有編碼的多肽可相同或不同。微觀藻類萊茵衣藻(C.reinhardtii)葉綠體中表達的多肽可以組裝以形成功能多肽和蛋白復合體。因此，本發明的方法提供產生功能蛋白復合體的方法，包括例如二聚體、三聚體和四聚體，其中復合體的亞基可相同或不同(例如，分別為同源二聚體或異源二聚體)。術語“重組核酸分子”用于本文是指由人為干預操作的多核苷酸。重組核酸分子可含有兩個或多個核苷酸序列，其以這樣的方式連接以使在自然界的細胞中未發現該產物。具體地，兩個或多個核苷酸序列可以可操作地連接，以及例如，可編碼融合多肽或可包括編碼核苷酸序列和調控元件。重組核酸分子還可基于但被操作以使其不同于自然發生的多核苷酸(例如葉綠體密碼子使用偏好、限制酶位點插入、啟動子插入、復制起點插入)。重組核酸分子可進一步含有肽標簽(例如，His-6標簽)，其可便于鑒定在細胞中的多肽表達。另外的標簽包括例如FLAG表位、c-myc表位、生物素以及谷胱甘肽S-轉移酶。這些標簽可通過本領域已知的任何方法(例如，抗-標簽抗體、鏈霉親和素)檢測。這些標簽還可用于分離可操作連接的多肽，例如通過親和層析。鉬合物核酸本文的組合物包括編碼一種或多種不同生物質降解酶和/或一種或多種不同生物質-產生調節劑的核酸以及這些核酸的載體。核酸對它們插入的光合宿主細胞可以是異源的。載體可包括編碼生物質降解酶的核酸的一個或多個拷貝和/或編碼生物質_產生調節劑的核酸的一個或多個拷貝。當使用多個拷貝時，核酸(例如，編碼單個生物質降解酶)的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個拷貝可插入至單個載體。這可在宿主細胞中增加它們產生的水平。用于本發明方法的重組核酸分子可包含在載體中。而且，當使用第二(或更多)重組核酸分子進行該方法時，第二重組核酸分子還可包含在載體中，其可以但不必與含有第一重組核酸分子的載體相同。載體可以是可用于將多核苷酸引入葉綠體的任何載體，優選地包括葉綠體基因組DNA的核苷酸序列，其足夠與葉綠體基因組DNA進行同源重組，例如這樣的核苷酸序列——其包括葉綠體基因組DNA的約400至1500或更多個的基本上連續的核苷酸。葉綠體載體和選擇葉綠體基因組用作載體的區域的方法是熟知的(參見，例如，Bock，J.Mol.Biol.312:425-438，2001；還參見，Staub和Maliga，PlantCell4:39-45，1992；Kavanagh等，Genetics152:1111_1122，1999，其中每個通過引用并入本文)。在一些情況下，這樣的載體包括啟動子。用于本發明的啟動子可來自任何來源(例如，病毒、細菌、真菌、原生生物、動物)。本文考慮的啟動子可以對光合生物、非維管光合生物和維管光合生物(例如，藻類、開花植物)是特異的。如本文所用，術語“非維管光合生物”是指任何宏觀的或微觀的生物，其包括但不限于藻類、藍細菌和光合細菌，其不具有例如在高等植物中發現的維管系統。在一些情況下，上述核酸被插入至包括光合生物例如藻類啟動子的載體。啟動子可以是在葉綠體和/或其它質體中用于表達的啟動子。在一些情況下，核酸是基于葉綠體的。考慮用于將本文的任何核酸插入至葉綠體的啟動子的例子包括美國申請號2004/0014174公開的啟動子。啟動子可以是組成型啟動子或誘導型啟動子。啟動子通常地包括接近轉錄起始位點的必要核酸序列(例如，TATA元件)。“組成型”啟動子是在大部分環境和發育條件下有活性的啟動子。“誘導型”啟動子是在環境或發育調控下有活性的啟動子。誘導型啟動子/調控元件的例子包括例如硝酸鹽-誘導的啟動子(Back等，PlantMoI.Biol.179(1991))或光-誘導的啟動子(Feinbaum等，MoIGen.Genet.226:449(1991)；Lam和Chua，Science248471(1990))或熱響應啟動子(Muller等，Gene111:165-73(1992))。萊茵衣藻(C.reinhardtii)的整個葉綠體基因組在萬維網(worldwideweb)上是公眾可獲得的，其URL為"biology,duke.edu/chlamy_genome/-chloro.html，，(參見"viewcompletegenomeastextfile，，鏈接禾口"mapsofthechloroplastgenome，，鏈接)，其中每個通過引用并入本文(J.Maul，J.W.Lilly和D.B.Stern，未公開的結果；2002年1月28日修訂；將作為GenBankAcc.No.AF396929公開)。通常，選擇葉綠體基因組DNA的核苷酸序列以使其不是基因的部分，包括調控序列或編碼序列，特別是這樣的基因，即如果由于同源重組事件被破壞將產生對于葉綠體有害作用的基因，例如，對于葉綠體基因組復制或對于含有葉綠體的植物細胞。在這方面，含有萊茵衣藻(C.reinhardtii)葉綠體基因組序列的網站還提供顯示葉綠體基因組編碼和非-編碼區域的圖譜，從而便于選擇用于構建本發明載體的序列。例如，葉綠體載體P322，其用于本文公開的實驗，是從大約位置143.Ikb的Eco(EcoRI)位點延伸至大約位置148.5kb的Xho(XhoI)位點的克隆(參見，萬維網，其URL為"biology,duke,edu/chlamy_genome/chloro.html，，并點擊"mapsofthechloroplastgenome”鏈接和"140_150kb”鏈接；也可在萬維網，URL為"biology,duke.edu/chlam-y/chloro/chlorol40.html”上直接獲得；還參見實施例1)。用于本發明實踐的載體也可含有一個或多個另外的核苷酸序列，其在載體上賦予期望的特征，包括例如序列，例如便于載體操作的克隆位點、指導載體復制或其中含有的核苷酸序列轉錄的調控元件、編碼選擇標記的序列，等等。同樣，載體可含有例如，一個或多個克隆位點，例如多克隆位點，其可但不必被定位以使異源多核苷酸可插入至載體并可操作地連接至所期望的元件。載體也可含有原核生物復制起點(ori)，例如，大腸桿菌復制起點或黏粒復制起點，從而使載體如所期望地在原核生物宿主細胞以及植物的葉綠體中傳代。調控元件，如本文所用術語，廣泛地指調節多核苷酸轉錄或翻譯或可操作地連接的多肽定位的核苷酸序列。例子包括但不限于RBS、啟動子、增強子、轉錄終止子、起始(start)密碼子、內含子切除和正確讀碼框維持的剪接信號、STOP密碼子、amber或ochre密碼子、IRES。另外，細胞區室化信號(即，將多肽靶向至胞質、核、葉綠體膜或細胞膜的序列)。這些信號是本領域熟知的并已廣泛報道(參見，例如，美國專利號5，776，689)。載體或其它重組核酸分子可包括編碼報告子多肽或其它選擇標記的核苷酸序列。術語“報告子”或“選擇標記”是指賦予可檢測表型的多核苷酸(或編碼的多肽)。報告子通常編碼可檢測的多肽，例如綠色熒光蛋白或酶例如熒光素酶，其中，當與合適的試劑接觸時(分別為特定波長的光或熒光素)，產生可目測或使用合適的儀器檢測的信號(Giacomin，PlantSci.11659-72,1996；Scikantha,J.Bacteriol.178121,1996；Gerdes,FEBSLett.38944-47,1996；還參見，Jefferson，EMBOJ.6:3901_3907，1997，f1-葡糖苷酸酶)。選擇標記通常地是分子，當其在細胞中存在或表達時，提供給含有標記的細胞選擇的優勢(或劣勢)，例如，在試劑存在的情況下生長的能力，否則該試劑將殺死細胞。選擇標記可提供工具以獲得表達標記的原核生物細胞或植物細胞或二者，因此，可用作本發明載體的組分(參見例如，Bock，上文，2001)。選擇標記的例子包括但不限于賦予抗代謝物抗性的標記，例如，二氫葉酸還原酶，其賦予對甲氨蝶呤的抗性(ReiSS，PlantPhysiol.(LifeSci.Adv.)13=143-149,1994)；新霉素磷酸轉移酶，其賦予對氨基糖苷新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性(Herrera-Estrella，EMBOJ.2=987-995,1983)；hygro,其賦予對潮霉素的抗性(Marsh，Gene32=481-485,1984)；trpB，其可使細胞利用吲哚來替代色氨酸；hisD，其可使細胞利用組胺醇來替代組氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA85=8047,1988)；甘露糖_6_磷酸異構酶，其可使細胞利用甘露糖(W094/20627)；鳥氨酸脫羧酶，其賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸的抗性(DFMO；McConlogue,1987,InCurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryed.)；以及來自土曲霉(Aspergillusterreus)的脫氨酶，其賦予對殺稻瘟菌素S的抗性(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336_2338，1995)。另外的選擇標記包括那些賦予除草劑抗性的選擇標記，例如，草胺膦乙酰轉移酶基因，其賦予對草胺膦的抗性(White等，Nucl.AcidsRes.18:1062，1990；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79625-631,1990)；突變的EPSPV-合成酶，其賦予草甘膦抗性(Hinchee等，Biotechnology91=915-922,1998)；突變的乙酰乳酸合成酶，其賦予咪唑啉(imidazolione)或磺酰尿抗性(Lee等，EMBOJ.7=1241-1248,1988)；突變的psbA，其賦予對繡去津的抗性(Smeda等，PlantPhysiol.103:911-917，1993)，或突變原卟啉原氧化酶(參見美國專利號5，767，373)，或其它標記，其賦予對除草劑例如草丁磷的抗性。選擇標記包括多核苷酸，其賦予對真核細胞的二氫葉酸還原酶(DHFR)或新霉素抗性，和四環素；對原核生物例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性；以及植物中博來霉素、慶大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、福來霉素、草銨磷、大觀霉素、鏈霉素、氨磺酰和磺酰尿抗性(參見，例如，Maliga等，MethodinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress，1995，第39頁)。報告基因已成功用于高等植物的葉綠體，并已報道重組蛋白高水平表達。另外，報告基因已用于萊茵衣藻的葉綠體，但是，在大多數情況下，產生極低量的蛋白。報告基因大大增強在大量生物有機體中監控基因表達的能力。在高等植物葉綠體中，葡糖苷酸酶(uidA，Staub和Maliga，EMBOJ.12:601_606，1993)、新霉素磷酸轉移酶(nptII，Carrer等，Mol.Gen.Genet.241:49_56，1993)、腺苷-3-腺嘌呤轉移酶(aadA,Svab和Maliga,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:913_917，1993)和維多利亞多管發光水母(Aequoreavictoria)GFP(Sidorov等，PlantJ.19:209_216，1999)已用作報告基因(Heifetz,Biochemie82655-666,2000)。這些基因的每一個均已成為葉綠體基因表達的有用的報告子，例如分析簡便、靈敏度、或原位檢測表達的能力。基于這些研究，其它異源蛋白已在高等植物葉綠體中表達，例如蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisKry毒素，其賦予昆蟲食草動物抗性(Kota等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA961840-1845，1999)，或人生長激素(Staub等，Nat.Biotechnol.18=333-338,2000)——一種潛在的生物藥物。幾種報告基因已表達在真核綠色藻類——萊茵衣藻的葉綠體中，包括aadA(Goldschmidt-Clermont，Nucl.AcidsRes.19:4083-40891991；Zerges和Rochaix,Mol.CellBiol.14:5268_5277，1994))、uidA(Sakamoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:477_501，19933，Ishikura等，J.Biosci.Bioeng.87:307_3141999)、花蟲型熒光素酶(Minko等，Mol.Gen.Genet.262421-425,1999)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumanii)的氨基糖苷磷酸轉移酶aphA6(Bateman禾口Purton，Mol.Gen.Genet263:404_410，2000)。在一些情況下，本發明的載體應含有元件例如大腸桿菌或釀酒酵母(S.cerevisiae)復制起點。這些特征，與合適的選擇標記組合，可使載體在靶宿主細胞和細菌和/或酵母細胞之間“穿梭”。本發明的穿梭載體在二級宿主中傳代的能力可使得對載體特征進行更方便的操作。例如，含有載體和推定的插入的感興趣多核苷酸的反應混合物可轉化至原核生物宿主細胞例如大腸桿菌，使用常規方法擴增和收集并檢測以鑒定含有感興趣的插入體或構建體的載體。如果期望，載體可進一步被操作，例如，通過對插入的多核苷酸進行位點定向誘變，然后再擴增和選擇具有感興趣的突變多核苷酸的載體。然后，可將穿梭載體引入至植物細胞葉綠體，其中可表達感興趣的多肽，如果期望，可根據本發明的方法分離。使用本領域已知的任何方法，可將本發明的多核苷酸或重組核酸分子引入至植物葉綠體。通過多種方法可將多核苷酸引入細胞，這些方法是本領域熟知的并部分地基于具體宿主細胞選擇。例如，使用直接的基因轉移方法，例如電穿孔或微粒介導的(生物射彈)轉化，使用粒子槍或“玻璃珠方法”或通過花粉介導的轉化、脂質體-介導的轉化、使用創傷的或酶_降解的未成熟胚或創傷的或酶_降解的胚胎發生的愈傷組織進行的轉化，可將多核苷酸引入至植物細胞(Potrykus,Ann.Rev.Plant.Physiol.PlantMol.Biol.42205-225,1991)。術語“外源的”以比較的含義用于本文以表明核苷酸序列(或多肽)是指來自不是參考來源的來源，或連接至通常不被連接的第二核苷酸序列(或多肽)或被修飾以使其以一種在參考材料中通常不相關的形式。例如，編碼生物質降解酶的多核苷酸相對于植物葉綠體核苷酸序列是異源的，其是重組核酸分子的組分，其包括例如，可操作地連接至第二核苷酸序列的第一核苷酸序列，其是引入至葉綠體的突變的多核苷酸，其中突變的多核苷酸通常未在葉綠體中發現。質體轉化是常規和熟知的方法，用于將多核苷酸引入植物細胞葉綠體(參見美國專利號5,451,513,5,545,817和5，545,818；W095/16783；McBride等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA91:7301-7305,1994)。在一些實施方式中，葉綠體轉化涉及引入所期望的核苷酸序列側翼的葉綠體DNA區域，以使外源DNA同源重組入靶葉綠體基因組。在一些情況下，可以使用葉綠體基因組DNA側翼的1至1.5kb的核苷酸序列。使用該方法，在葉綠體16SrRNA和rpsl2基因中的點突變——其賦予大觀霉素和鏈霉素抗性，可用作轉化的選擇標記(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA87:8526_8530，1990)并可產生穩定的同質轉化子，其以每100個靶葉片轟擊大約一個的頻率。微粒介導的轉化還可用于將多核苷酸引入至植物細胞葉綠體(Klein等，Nature327:70-73，1987)。該方法利用微粒例如金或鎢，其通過氯化鈣、亞精胺或聚乙二醇沉淀用所期望的多核苷酸包被。使用設備例如生物射彈PD-1000粒子槍(BioRad；HerculesCalif.)，將微粒粒子以高速加速至植物組織。使用生物射彈方法用于轉化的方法是本領域熟知的(參見，例如；Christou,TrendsinPlantScience1=423-431,1996)已使用微粒介導的轉化，例如，以產生大量轉基因植物物種，包括棉花、煙草、玉米、雜交白楊和番木瓜。重要的谷類作物，例如小麥、燕麥、大麥、高粱和水稻也已使用微粒介導的遞送轉化(Dimn等，NatureBiotech.14494-498,1996；Shimamoto,Curr.Opin.Biotech.5158-162,1994)。用上述方法轉化大多數雙子葉植物是可能的。單子葉植物的轉化也可使用例如上述生物射彈方法、原生質體轉化、部分透化的細胞電穿孔、使用玻璃纖維引入DNA、玻璃珠攪拌方法等等轉化。可以用顯性選擇標記包括但不限于細菌aadA基因代替隱性rRNA或r_蛋白抗生素抗性基因提高轉化頻率(Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90:913_917，1993)。轉化后通常需要大約15至20個細胞分裂周期以達到同質狀態。對本領域普通技術人員顯而易見的是葉綠體可含有其基因組的多拷貝，因此，術語“同質的”或“同質性”是指感興趣的具體基因座的所有拷貝是基本上相同的狀態。質體表達一其中基因通過同源重組插入至存在于每個植物細胞中的環形質體基因組的所有幾千個拷貝，利用與核-表達的基因相比巨大的拷貝數優勢以使表達水平能夠容易超過全部可溶植物蛋白的10%。使用微觀藻類——萊茵衣藻來示例本發明的方法。根據本發明的方法使用微觀藻類表達多肽或蛋白復合體提供了大量的微觀藻類可生長的優勢，其包括商業用途(CyanotechCorp.；KaiIua-KonaHI)，從而產生大量所期望的產物，以及如果期望，可分離大量所期望的產物。但是，在任何植物的葉綠體中表達例如功能性哺乳動物多肽——包括蛋白復合體——的能力可產生這些植物的作物，并因此，具有方便地產生大量多肽的能力。因此，可使用任何具有葉綠體的植物實踐本發明的方法，包括例如，大型藻類、例如，海洋藻類和海草，以及生長在土壤中的植物，例如，玉米(Zeamays)、蕓苔屬某種(例如，B.napus,B.rapa,B.juncea)——特別是用作種子油來源的蕓苔屬物種、紫花苜蓿(Medicagosativa)、7_K禾苗(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、稷(歹Ij女口，珍珠稷(Pennisetumglaucum)、黃米(Panicummiliaceum)>小米(Setariaitalica)、禾參子(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense、Gossypiumhirsutum)、舌甘馬鈴薯(Ipomoeabatatus)、cassaya(Manihotesculenta)、助P口非(CofeaMft)>#(Cocosnucifera)>(Ananascomosus)、柑橘樹(Citrus屬些某禾中)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa屬某些種)、鍔梨(Perseaultilane)、無花果(Ficuscasica)、(Psidiumguajava)>τ^(Mangiferaindica)>(Oleaeuropaea)>(Caricapapaya)>^(Anacardiumoccidentale)>(Macadamiaintegrifolia)>樹(Prunusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔴(Saccharum屬某些種)、燕麥、浮萍(Lemna)、大麥、西紅棉(Lycopersiconesculentum)、萵苣(例如，Lactucasativa)、綠J3.(Phaseolusvulgaris)、禾U馬豆(Phaseoluslimensis)>i^SL(Lathyrus屬某些禾中)，禾口Cucumis屬的成員例如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)，禾口甜瓜(C.melo)。觀賞植物，例如杜鵑(Rhododendron屬某些種)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、木槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosa屬某些種)、郁金香(Tulipa屬某些種)、水仙花(NarcissusMIiS禾中),Μ^Ψ(Petuniahybirda)(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)和菊花也包括在內。用于實踐本發明方法的另外的觀賞植物包括鳳仙花、海棠、天竺葵、堇菜、仙客來、馬鞭草、長春花、萬壽菊、報春花、非洲堇英、藿香薊、莧菜、金魚草、耬斗菜、瓜葉菊、苜蓿、Cosmo、豇豆、大麗花、曼陀羅、飛燕草、非洲菊、劍蘭、孤挺花、松葉菊、Salpiglossos和百日菊。可以應用于實踐本發明的針葉類包括例如，松樹，例如火炬松(Pinustaeda)、沼澤松(Pinuselliotii)、西黃松(Pinusponderosa)、黑豐公(Pinuscontorta)禾口寸公(Pinusradiata)豐公(Pseudotsugamenziesii)；Westernhemlock(Tsugaultilane)；Sitkaspruce(Piceaglauca)；^X^·(Sequoiasempervirens)；真冷杉例如銀揪(Abiesamabilis)和膠揪(Abiesbalsamea)；以及雪松例如西紅雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。用于實踐本發明方法的豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜爾豆、刺槐豆、胡蘆巴、大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等等。豆科植物包括但不限于落花生(Arachis)，例如花生、蠶豆(Vicia)，例如冠野豌豆、巢菜、赤豆、綠豆和鷹嘴豆、羽扇豆(Lupinus)，例如扁豆、三葉草、菜豆(Phaseolus)，例如、菜豆和利馬豆，Pisum例如田野豆，草木樨(Melilotus)例如三葉草，苜蓿(Medicago)例如紫花苜蓿，蓮花(Lotus)例如三葉草，lens例如小扁豆和紫穗槐。本發明方法中使用的優選飼料和草坪草包括紫花苜蓿、果園草、高羊茅、多年生黑麥草、剪股穎和糠草。用于本發明的其它植物包括金合歡(Acaci)、蒔蘿、朝鮮薊、芝麻、黑莓、油菜、香菜、小柑橘、萵苣菜、桉樹、茴香、葡萄柚、蜜露、豆薯、獼猴桃、檸檬、酸橙、蘑菇、堅果、黃秋葵、柑橘、歐芹、柿子、車前草、石榴、楊樹、輻射松、菊苣、南方松、楓香樹、橘子、黑小麥、葡萄、甘薯、蘋果、梨、榲梓、櫻桃、杏、甜瓜、麻、蕎麥、葡萄、山莓、藜、藍莓、油桃、桃、李、草莓、西瓜、茄子、胡椒、花椰菜、蕓苔(Brassica)、例如椰菜、卷心菜、ultilansprouts、洋蔥、胡蘿卜、韭菜、甜菜、蠶豆、芹菜、蘿卜、南瓜、菊苣、葫蘆、大蒜、食莢菜豆、菠菜、南瓜、蕪箐、ultilane、菊苣、落花生和西葫蘆。因此，本文考慮的組合物包括宿主生物，其包括上述任何核酸。宿主生物可以是任何含有葉綠體的生物。在本文中廣泛使用的術語“植物”是指含有質體，特別是葉綠體的真核生物，并包括在任何發育階段的任何這種生物或植物的部分，包括植物切塊、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物種子和小植株。植物細胞是植物的結構和生理單位，其包括原生質體和細胞壁。植物細胞可以是分離的單個細胞或培養的細胞的形式，或可以是較高組織單位的部分，例如，植物組織、植物器官或植物。因此，植物細胞可以是原生質體、產生細胞的配子或可再生為整個植物的細胞或細胞集合。同樣，種子——其包括多植物細胞并能夠再生為整個植物，被認為是用于本公開目的的植物細胞。植物組織或植物器官可以是種子、原生質體、愈傷組織或植物細胞的任何其它組群，其可被組織成結構或功能單位。特別有用的植物部分包括可收獲的部分和用于繁殖后代植物的部分。植物可收獲的部分可以是植物任何有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、塊莖、葉、莖、果實、種子、根等等。植物用于繁殖的部分包括例如，種子、果實、切塊、幼苗、塊莖、根狀莖等等。本發明的方法可產生植物，其含有被遺傳修飾的葉綠體以含有穩定整合的多核苷酸(Hager和Bock，Appl.Microbiol.Biotechnol.54:302_310，2000)。因此，本發明進一步提供轉基因(轉質體，transplastomic)植物，例如萊茵衣藻，其包括一個或多個含有編碼一種或多種異源多肽的多核苷酸的葉綠體，所述多肽包括可特異地結合以形成功能蛋白復合體的多肽。在一些情況下，包括編碼具體生物降解途徑(例如，纖維素途徑)單個酶的重組多核苷酸的轉化子和/或轉質體植物可與包括編碼生物降解途徑的其它酶的重組多核苷酸的轉化子組合。例如，如果生物化學途徑利用四個酶以從底物產生產物，可將四個轉化系組合以提供那個途徑的酶。這些組合可含有必要的多個轉化系以包括產生整個酶途徑或其部分的細胞混合物。另外，這些組合可包括不同比例的不同轉化子的細胞。例如，如果降解途徑的一個酶是該途徑的限速步驟，細胞的組合可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更大數量的產生限速酶的細胞。本領域普通技術人員應認識到轉化子比例的多種組合可以通過簡單方法獲得(例如，稱重干燥的轉化子并組合)。可選地，單個酶可以從轉化子分離(例如，“裂解”藻類轉化子以分離被隔離的酶)并在分離后組合。這些方法可將酶濃度適應于不同生物質或其它底物原料，其可含有底物或其它成分的不同的相對比例。在一些情況下，由本發明轉基因生物產生的蛋白在它產生后被分離。因此，本發明還考慮在葉綠體或轉基因植物中產生異源多肽或蛋白復合體的方法，其可包括從植物細胞葉綠體分離表達的多肽或蛋白復合體的步驟。如本文所用，術語“分離的”或“基本上純化”意思是所指的多肽或多核苷酸以相對不含與其天然結合的蛋白、核酸、脂類、碳水化合物或其它物質的形式。分離的多肽(或多核苷酸)可構成樣品的至少百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100。可從葉綠體分離多肽或蛋白復合體，其使用任何適合于具體多肽或蛋白復合體的方法，包括例如，鹽分餾方法和層析方法例如親和層析方法，使用特異結合多肽或蛋白復合體的配體或受體。根據本發明的方法測定產生的多肽或蛋白復合體是以分離的形式，其可使用熟知的方法進行，例如進行電泳和鑒定具體分子作為相對不連續的條帶或鑒定具體復合物為一系列條帶之一。因此，本發明還提供通過本發明的方法產生的分離的多肽或蛋白復合體。在一些情況下，可產生本發明的酶但被隔離在葉綠體中。在這些實施方式中，可以在“裂解”含有酶的細胞(例如，使用機械、化學和/或生物方法以破壞細胞壁)后到達有活性的酶。這些裂解的時機可計劃為在由細胞產生的酶用于發揮它們的酶學能力時發生。在其它情況下，酶可以是由宿主細胞分泌。在這些情況下，酶可以直接地從生物體的培養基收集。這些培養基中存在的酶可不經純化直接使用，可干燥(例如，空氣干燥、凍干)和/或可以進行通過本領域已知的任何方法(例如，親和層析、高效液相層析)純化。生物質降解酶和編碼那些酶的核酸的例子顯示于表I。生物質降解酶的非限制性例子包括分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶、分解果膠的酶、木聚糖酶、分解木質素的酶、纖維素酶、纖維二糖酶、軟化酶(例如，內切多聚半乳糖醛酸酶)、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、RNAse,DNAse、菊粉酶、裂解酶、磷酸脂肪酶、果膠酶、支鏈淀粉酶、葡萄糖異構酶、內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶。編碼這些酶的基因的例子包括但不限于淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶(例如，葡糖苷酶、內切纖維素酶、外切纖維素酶)、外切葡聚糖酶、內切-β-葡聚糖酶和木聚糖酶(內切木聚糖酶和外切木聚糖酶)。分解木質素的酶的例子包括但不限于來自黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechryososporium)的木質素過氧化酶和錳過氧化酶。本領域普通技術人員應認識到，這些酶僅是可用于本發明的酶的部分列舉。表1.生物質降解酶的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>生物質-產生調節劑包括如在光合生物的生物中增加生物質產生的試劑。宿主細胞/生物本發明還考慮用本文的一種或多種核酸轉化的宿主細胞。在優選的實施方式中，宿主細胞是光合成的。在某些情況下，宿主細胞是光合的和非維管的。在其它情況下，宿主細胞是光合和有維管的。宿主細胞可以是真核或原核的。用本文所述的載體轉染宿主細胞(例如，包括一種或多種生物質降解酶和/或一種或多種生物質-產生調節劑的載體)。載體可含有質體啟動子或核啟動子，用于轉染宿主細胞葉綠體或其它質體。載體還可編碼選擇性地將載體產物靶向至葉綠體或其它質體的融合蛋白或試劑。宿主細胞的轉染可使用本領域已知的任何方法發生。宿主生物是包括宿主細胞的生物。在優選的實施方式中，宿主生物是光合成的。光合生物是一種天然地光合成(具有質體)的生物或被遺傳工程化的或另外被修飾成光合成的生物。在一些情況下，光合生物可以是用本發明的構建體轉化，其補償了不能操作的全部或部分光合裝置。在一些情況下，它是非維管和光合成的。宿主細胞可以是原核的。本發明的一些原核生物的例子包括但不限于藍細菌(例如，聚球菌(Synechococcus)、集胞藻(Synechocystis)、螺旋藻(Athrospira))。宿主生物可以是單細胞或多細胞的。在大部分實施方式中，宿主生物是真核的(例如綠色藻類)。本文考慮的生物的例子包括但不限于紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、類眼蟲、鞭藻、隱滴蟲、雙鞭藻和浮游植物。宿主生物可以在允許進行光合成的條件下生長，但是，這不是必需的(例如，宿主生物可以在缺乏光照下生長)。在一些情況下，宿主生物可以是遺傳修飾的，以降低和/或破壞光合能力的方式進行遺傳修飾(參見以下例子)。在宿主生物不能進行光合成的生長條件下(例如，由于缺乏光和/或遺傳修飾)，通常地，應給生物提供必要的營養物以支持其在缺乏光合成條件下的生長。例如，向生物生長其中(或其上)的培養基中可添加任何所需的營養物，包括有機碳源、氮源、磷源、維生素、金屬、脂質、核酸、微營養物或生物特異性需要。有機碳源包括宿主生物能夠代謝的任何碳源，包括但不限于醋酸鹽、簡單的碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖)、復雜的碳水化合物(例如，淀粉、糖原)、蛋白和脂質。本領域普通技術人員應認識到，不是所有的生物都能夠充分代謝特定的營養物，以及從一種生物到另一種生物可能需要修飾營養物混合物以提供合適的營養物混合物。宿主生物可生長在陸地上，例如，水池、溝渠、堆填池或封閉或部分封閉的生物反應器系統。本文的宿主生物也可直接生長在水中，例如，在海洋、海水、湖泊、河流、水庫等等。在藻類大量培養的實施方式中，藻類可在高密度光生物反應器中生長。大量培養藻類的方法是已知的。例如，藻類可以在高密度光生物反應器(參見，例如，Lee等，Biotech.Bioengineering44:1161_1167，1994)和其它生物反應器(例如用于污水和廢水處理的反應器)(例如，Sawayama等，Appl.Micro.Biotech.,41:729_731，1994)中生長。另外，藻類可以被大量-培養以去除重金屬(例如，Wilkinson，Biotech.Letters,11:861_864，1989)、氫(例如，美國專利申請發明者B·奧奈爾,K·米克爾森,M·門德斯,S·梅菲爾德,Y·潘申請人:藍寶石能源公司;斯克里普斯研究學院