一種胞苷高產微生物菌株的高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種胞巧高產微生物菌株的高通量篩選方法，屬于微生物育種和發酵 工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 胞巧（cytidine)又名胞嚼巧核巧、胞巧、1-目-D-巧喃核巧胞嚼巧。胞巧作為 嚼巧核巧主要用于生產抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，是制造阿糖胞巧（Ara-CR)、環胞巧 (切clo C)、H磯酸胞巧（CTP)、胞二磯膽堿（CDP-化oline)等藥物的主要原料。目前胞巧 的生產方法有RNA水解法、發酵法和合成法相結合、W尿嚼巧為前體的發酵法、直接發酵法 等(張克旭，杜連祥，譯.核酸發酵[M].北京：中國輕工業出版社，1987)。隨著對抗病毒、 抗腫瘤、治療艾滋病藥物研究的深入，對天然胞巧的需求量也日益增加，人們期望得到廉價 的、能大規模生產胞巧的工藝方法。利用微生物的變異菌株直接發酵大量生產核巧是現代 微生物學的杰出成果。相對于其他方法，此類方法具有條件簡單、周期短、易控制、產率高、 產量大和成本低等突出優點。國外在20世紀90年代中期才有關于胞巧可W經發酵法大 規模生產的報道，而我國有關發酵法生產胞巧的研究尚屬空白。隨著對胞巧需求量的不斷 增加，發酵法生產胞巧的研究也日益得到更廣泛的重視（喬賓福.微生物產生核巧和核酸 [J].工業微生物，1998, 28(1):2)。
[0003] 在微生物發酵代謝過程中，胞巧作為產物會被釋放到培養基中，為了驗證微生物 生產胞巧的能力，需要測定培養基中胞巧的含量。目前胞巧測定的常用方法主要包括紙層 析法和高效液相色譜法。紙層析法檢測胞巧精度不高，而且所用的有機溶劑如丙麗等，一般 有揮發性、并有一定毒性。高效液相色譜法能堅持微量胞巧，精密度和準確性很高，但儀器 昂貴、操作和維護繁瑣。因此，尋求簡便、快速、準確和應用廣泛的胞巧分析法倍受重視。
[0004] 采用高通量方法篩選胞巧高產菌株，即可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地 提高篩選速度。開發一種簡便、快速、準確的方法檢測發酵液中的胞巧含量，對于高通量篩 選生產胞巧的菌株進行胞巧生產具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 為了克服篩選胞巧高產菌株的常規方法存在的工作量大、周期長和成本高等問 題，本發明提供了一種基于深孔板的微型化培養與基于酶標儀微量化檢測的高通量篩選方 法。高通量篩選胞巧高產菌株的方法如下： (1) 挑取胞巧生產菌的單菌落，接種于裝有液體種子培養基的深孔板I中，蓋上深孔板 蓋子，于30-40°C、300-800巧m搖床培養8-14 h; (2) 將深孔板I孔中的種子液對應接種到裝有發酵培養基的深孔板II中，30-4(TC、 300-800 ;rpm 搖床培養 8-48 h ; (3) 將深孔板II放置于孔板離必機，5000-10000 Xg離必5-30 min, W微量化梯度稀釋 法將發酵液上清稀釋； (4) 在酶標板的微孔中加入稀釋的發酵液上清、緩沖液和適量的胞巧脫氨酶，W不加胞 巧脫氨酶的實驗為空白對照，于30-4(TC溫浴反應10-40 min ; (5) 反應結束后立即加入反應液A和反應液B，且反應液A和B的加入順序為反應液A 在前，B在后，然后于30-4(TC溫浴反應20-50 min ; (6) 步驟（5)反應結束后，采用酶標儀測定反應液的吸光度，根據胞巧標準曲線和發酵 液上清的稀釋倍數計算胞巧產量； (7) 根據胞巧檢測結果，選擇對應的菌株進行搖瓶復篩，獲得胞巧高產菌株， 其中，所述反應液A包含氨氧化鋼20-30 g/L、水楊酸45-75 g/L和亞硝基鐵氯化鋼1-3 邑/1，反應液B包含次氯酸鋼40-60 ml/l，步驟（5)反應結束后產生的藍色物質的檢測波長 為 695-700 nm。
[0006] 在另一優選例中，所述反應液A包含苯酪15-30 ml/L和亞硝基鐵氯化鋼0.8-3 g/ L反應液B為包含氨氧化鋼10-15 g/L和次氯酸鋼20-40 ml/l，步驟（5)反應結束后產生 的藍色物質的檢測波長為625-630皿。
[0007] 在另一優選例中，所述胞巧生產菌的單菌落為自然界含菌樣品或通過物理化學等 誘變方法獲得的突變株。
[0008] 在另一優選例中，所述的深孔培養板為96孔深孔板，每個孔的體積是3 mU但是 每孔中加入0. 5-2. 5血的培養基。
[0009] 在另一優選例中，所述溶液種子培養基為；酵母粉2-10 g/l，蛋白腺5-15旨/1，氯 化鋼 5-15 g/L，pH7. 0、12rC滅菌 20 min。
[0010] 在另一優選例中，所述發酵培養基為；葡萄糖10 g/L化2冊〇4· 12&0 8. 96 g/l， KH2PO4I.5 g/L，化Cl 2. 5 g/L，尿素 2 g/L，k 色氨酸 0. 05 g/L，1000X 微量元素 1 血， Μ拆〇4 · 7&0 0. 49 g/L，CaClz 0. 011 g/L， 其中，所述 lOOOX 微量元素組分為；MnClz 1 g/l，aiCl2 1. 7 g/l，CuCl2 ·2Η20 0. 43 g/ L C0CI2 · 6Η2Ο 0. 6 g/l，化(：13 8. 125 g/l，NazMcA · 2&0 0. 6 g/l， 所述各組分滅菌條件為；葡萄糖11(TC滅菌20 min,尿素和色氨酸過濾除菌，其它組分 12TC滅菌 20 min。
[0011] 在另一優選例中，所述的上清液中不能含有菌體，稀釋后的上清液與所述緩沖液 混合均勻，稀釋后的上清液中胞巧的濃度為0. 01-10 ml。
[0012] 在另一優選例中，所述酶反應所用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、磯酸二氨鐘緩 沖液、磯酸鋼緩沖液和肥陽S緩沖液之中的一種，所述緩沖液的抑為7. 0-8. 0,濃度為 0. 01-0. 1 Mo
[0013] 在另一優選例中，所述胞巧脫氨酶來源于枯草芽抱桿菌或大腸桿菌，反應時加入 1-20 U胞巧脫氨酶。
[0014] 在另一優選例中，所述步驟（4)發酵上清液與緩沖液的體積比為1:1-4,和/或 所述步驟（5)反應液A與B的體積比為1:1-4。
[0015] 在另一優選例中，所述檢測樣本中胞巧含量與所述發酵培養基中的胞巧標準曲線 的建立同時進行。
[0016] 胞巧脫氨酶酶活的定義；在指定的溫度和抑條件下，每分鐘轉化1 μ mol胞巧釋放 產生氨所需的酶量，為一個酶活單位（U)。
[0017] 本發明的檢測方法，可W簡單、快速、準確地檢測發酵液中胞巧含量，克服現有技 術中設備昂貴，操作繁瑣，測量耗時等不足。
[0018] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可W互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
[0019] 本發明提供的高通量篩選胞巧高產菌株的方法如下： (1) 挑取胞巧生產菌的單菌落，接種于裝有液體種子培養基的深孔板I中，蓋上深孔板 蓋子，于30-40°C、300-800巧m搖床培養8-14 h; (2) 將深孔板I孔中的種子液對應接種到裝有發酵培養基的深孔板II中，30-4(TC、 300-800巧m搖床培養8-48 h ; (3) 將深孔板II放置于孔板離必機，5000-10000 X g離必5-30 min, W微量化梯度稀釋 法將發酵液上清稀釋； (4) 在酶標板的微孔中加入稀釋的發酵液上清、緩沖液和適量的胞巧脫氨酶，W不加胞 巧脫氨酶的實驗為空白對照，于30-4(TC溫浴反應10-40 min ; (5) 反應結束后立即加入反應液A和反應液B，且反應液A和B的加入順序為反應液A 在前，B在后，然后于30-4(TC溫浴反應20-50 min ; (6) 步驟（5)反應結束后，采用酶標儀測定反應液的吸光度，根據胞巧標準曲線和發酵 液上清的稀釋倍數計算胞巧產量； (7) 根據胞巧檢測結果，選擇對應的菌株進行搖瓶復篩，獲得胞巧高產菌株， 其中，所述反應液A包含氨氧化鋼20-30 g/L、水楊酸45-75 g/L和亞硝基鐵氯化鋼1-3 邑/1，反應液B包含次氯酸鋼40-60 ml/l，步驟（5)反應結束后產生的藍色物質的檢測波長 為 695-700 nm。
[0020] 在另一優選例中，所述反應液A包含苯酪15-30 ml/L和亞硝基鐵氯化鋼0.8-3 g/ L反應液B為包含氨氧化鋼10-15 g/L和次氯酸鋼20-40 ml/l，步驟（5)反應結束后產生 的藍色物質的檢測波長為625-630皿。
[0021] 在另一優選例中，所述胞巧生產菌的單菌落為自然界含菌樣品或通過物理化學等 誘變方法獲得的突變株。
[0022] 在另一優選例中，所述的深孔培養板為96孔深孔板，每個孔的體積是3 mU但是 每孔中加入0. 5-2. 5血的培養基。
[0023] 在另一優選例中，所述溶液種子培養基為；酵母粉2-10 g/l，蛋白腺5-15旨/1，氯 化鋼 5-15 g/L，pH7. 0、12rC滅菌 20 min。
[0024] 在另一優選例中，所述發酵培養基為；葡萄糖10 g/l，化2冊〇4· 12&0 8. 96 g/l， KH2PO4I.5 g/L，化Cl 2. 5 g/L，尿素 2 g/L，k 色氨酸 0. 05 g/L，1000X 微量元素 1 血， Μ拆〇4 · 7&0 0. 49 g/L，CaClz 0. 011 g/L， 其中，所述 lOOOX 微量元素組分為；MnClz 1 g/l，aiCl2 1. 7 g/l，CuCl2 ·2Η20 0. 43 g/ L C0CI2 · 6Η2Ο 0. 6 g/l，化(：13 8. 125 g/l，NazMcA · 2&0 0. 6 g/l， 所述各組分滅菌條件為；葡萄糖11(TC滅菌2