Xvsap1基因的植物啟動子的制作方法

專利名稱：Xvsap1基因的植物啟動子的制作方法
XVSAP1基因的植物啟動子
背景技術：
本發明描述有效用于，例如，農業生物技術中的植物啟動子。具體地，所述啟動子 在非生物脅迫條件下是可誘導的，且可以用于開發可以表達用于改善非生物脅迫的一些有 害作用的基因的轉基因植物。為了表達轉化載體中或DNA構建體中包括的給定基因的編碼區，需要將啟動子改 造到編碼序列的上游。現在可以選擇啟動子，以容許組成型基因表達或僅將基因表達限制 于特定細胞類型中或響應特定環境刺激。存在對生成僅在脅迫條件下表達轉基因的耐旱轉 基因植物的需要，因為該蛋白在組成型表達時的過量產生可能妨礙植物的正常生長。這將 在有經濟價值的農作物諸如玉米和煙草中特別有價值。在組成型基因表達的過程中，存在始終高水平的基因表達。組成型啟動子的實例 包括35S RNA的花椰菜花葉病毒啟動子和玉米泛蛋白啟動子。已經報告了在正常生長條件 下組成型表達蛋白有時妨礙轉基因植物的正常生長，從而導致與野生型植物相比較小的表 現型。轉化植物的這種有害的矮化病可以歸因于以高于正常的量和在不需要的階段表達蛋 白質。一些基因編碼僅在與植物發育階段、環境脅迫或病原體攻擊有關的特殊條件下所 需要的產物。這些基因包含“誘導型啟動子”，其可以由誘導劑迅速開啟并在被再關閉以前 活躍一段有限長的時間。在缺乏誘導劑的條件下，DNA序列或基因不會轉錄。誘導劑可以 是化學試劑，或直接強加于植物的生理脅迫諸如冷、熱、鹽、毒素，或通過病原體或疾病媒介 的作用強加于植物的生理脅迫。已經記述了許多可由缺氧脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫和鹽脅 迫誘導的啟動子。然而，已經發現大多數脅迫誘導型啟動子在與組成型啟動子相比較時，具 有弱表達強度。由于可誘導型啟動子在與組成型啟動子相比較時的弱表達強度，存在對開發脅迫 響應啟動子的需要，所述脅迫響應啟動子容許增加表達，但對其誘導模式不具有任何負面 作用。本申請人已經確定了對提供能夠表達用于改善非生物脅迫的有害作用的基因的 轉基因植物的需要，并且為了該目的已經分離了在非生物脅迫條件過程中誘導植物中蛋白 表達的啟動子。非生物脅迫是對植物的有害作用，其由非生物因素，諸如干旱、鹽度、寒冷和 極端溫度導致，而生物約束通常歸因于有生命的系統，如引起疾病的細菌、真菌、病毒和以 植物為食的昆蟲。發明概述本發明提供分離的核酸，其包括與以下各項至少80%相同的核苷酸序列(a) SEQ ID NOs :1_3 中的任一種；(b)SEQ ID NOs :1_3中的任一種的片段且起脅迫誘導型啟動子的作用；(c)在標準或嚴格條件下與SEQ ID NOs :1_3中的任一種的核苷酸序列雜交且起 脅迫誘導型啟動子的作用的序列；(d)SEQ ID NOs :1_3 中的任一種的互補序列(complement) (SEQ IDNOs :4_6)；
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(e)在標準或嚴格條件下與SEQ ID NOs :1_3中的任一種的互補序列雜交且起脅 迫誘導型啟動子的作用的序列；(f)SEQ ID NOs :1_3 中的任一種的反向互補序列(SEQ ID NOs 7~9)；或(g)SEQ ID NOs :1_3中的任一種的簡并或等位基因變體。更優選地，所述核苷酸序列可以與以上(a)-(g)任一項具有至少90%的同一性。更優選地，所述核苷酸序列可以與以上(a)-(g)任一項具有至少95%的同一性。甚至更優選地，所述核苷酸序列可以包括SEQ ID NO 1的核苷酸序列或其截短序 列，諸如 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。所述核酸可以是脅迫誘導型植物啟動子，且所述脅迫可以是非生物脅迫諸如滲透 壓脅迫、脫水脅迫、干旱、鹽度、冷、熱、干燥或極端溫度。所述核酸可以源自維柯薩(Xerophyta viscosa)。雜交可以發生在嚴格條件下，所述嚴格條件包括在約60-約65°C，在0. ISSC中洗滌。本發明延伸到包含該啟動子的植物載體。所述載體可以在該啟動子下游包含基 因。重組載體可以是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-來源的質粒 構建體。本發明還延伸到向其中轉化了所述載體的宿主細胞。所述宿主細胞可以是植物細胞。本發明還延伸到用所述啟動子轉化的轉基因植物或植物部分。所述轉基因植物或 植物部分也可以在該啟動子的控制下用基因轉化。所述基因可以是任何適合的基因，諸如 XvSap1，XvPrx2 或 XvPerl。所述植物可以是能夠在脅迫條件下表達該基因。所述轉基因植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，諸如玉米、煙草、高粱、小麥、木 薯、大麥、燕麥、黑麥、甘薯、大豆、苜蓿、煙草、向日葵、棉花、或油菜。所述轉基因植物部分可以選自由以下各項組成的組細胞、原生質體、細胞組織培 養物、胼胝體、細胞團、胚芽、花粉、胚珠、種子、花、籽粒(kernel)、耳穗、穗軸、葉、外殼、莖、 根、根尖、花藥、種子和穗絲。本發明還提供用于增加植物脅迫耐受性的方法，所述方法通過向該植物中引入包 含權利要求1的核酸的啟動子和任選地也在該啟動子控制下引入基因來完成。附圖簡述

圖1 啟動子 XvPsapl 的核苷酸序列(2083bp, SEQ ID NO :1)。圖2 啟動子 XvPsap2 的核苷酸序列(1577bp，SEQ ID NO 2)。圖3 啟動子 XvPsap3 的核苷酸序列(1127bp，SEQ ID NO 3)。圖 4 啟動子 XvPsapl 的互補序列(2083bp, SEQ ID NO 4)。圖 5 啟動子 XvPsap2 的互補序列(1577bp, SEQ ID NO 5)。圖 6 啟動子 XvPsap3 的互補序列(1127bp, SEQ ID NO 6)。圖7 啟動子 XvPsapl 的反向互補序列(2083bp, SEQ ID NO 7)。圖8 啟動子 XvPsap2 的反向互補序列(1577bp，SEQ ID NO 8)。
圖9 啟動子 XvPsap3 的反向互補序列(1127bp，SEQ ID NO 9)。圖10 利用qRT-PCR分析的Iuc轉錄物表達概況曲線。A 用200mMNaCl處理72 小時后在轉基因BMS細胞中的表達概況。B 脫水處理轉基因煙草植物8天后的表達概況。 C:脫水處理轉基因玉米后的表達概況。僅使用XWsapl構建體轉化玉米。方差分析以P < 0. 05進行。發明詳述驅動用于生成抗非生物脅迫的轉基因植物的基因表達的非生物脅迫誘導型啟動 子記述在本文中。還記述了包含該啟動子和與該啟動子可操作連接的基因的載體，和用所 述啟動子和基因轉化的植物或植物部分。考慮到陸生植物中水利用的復雜性，尤其是在產生水不足的條件過程中的復雜 性，本申請人意識到只有兩種啟動子與該植物生理學方面特別有關且可以通過商購獲得。 這些啟動子源自大米和擬南芥。啟動子具有中心和調節區。所述調節區是區分啟動子的區域。這些調節區一般由 負調節元件、轉錄增強子、翻譯增強子和其他調節元件組成。已經合成了三種長度的本發明 的DNA啟動子(SEQ ID N0s:l_3)。這些應該在調節區內不同。由此，它們的活性和效力在 不同植物和在不同脅迫條件下可以不同。因此，各種所述的啟動子可以被推薦用于經歷不 同脅迫的不同植物。本發明的DNA啟動子源自“復活植物”，即維柯薩，其可以經受住極端的干燥，在僅 5%相對水含量的條件下存活數月。當向其澆水時，它可以在80小時內再水化。維柯薩基因組尚未測序。因此，本發明的DNA啟動子的堿基序列如果不被分離和 克隆，則將不可確定。此外，本發明的DNA啟動子是天然存在的啟動子的截短形式。本發明的DNA啟動子不編碼任何已知的功能蛋白。它們的生物學功能與蛋白的表 達有關，其增加維柯薩的脅迫耐受性。所述啟動子缺乏與這兩種可商購獲得的啟動子或與 任何其他已知啟動子序列的任何顯著同一性。盡管本文中記述了具有SEQ ID NOs :1-3核苷酸序列的啟動子，但是預期具有 80%以上同一性且起啟動子作用的序列也可以用于本發明中。還可以使用互補序列(SEQ ID NOs :4-6)、反向互補序列(SEQ ID NOs :7_9)和在標準或嚴格條件下與這些序列雜交的 序列，條件是它們具有啟動子活性(圖4-9)。例如，雜交可以以65°C，輕輕搖動條件下進行18h，以65°C在洗滌緩沖液A(0. 5% SDS ；2X SSC)中進行第一次洗滌12min，且以65°C在洗滌緩沖液B (0. 1% SDS ；0. 5X SSC)中 進行第二次洗滌lOmin。所述DNA啟動子可以在不施用化學制劑的條件下，由環境脅迫，諸如干旱來誘導。 它們容許所需的蛋白或mRNA在施加所述刺激的短期內表達。所述啟動子可以插入到植物載體中。能夠生成耐受非生物脅迫的轉基因植物的基 因，諸如XvSapl、XVft~X2或XvPerl，可以被克隆到所述啟動子的下游。當將所述組合構建 體引入轉基因植物中時，該基因僅在植物經歷非生物脅迫時表達。因此，可以生成易受非生 物脅迫影響的植物，如玉米、煙草、高粱、小麥、木薯和甘薯，它們在非脅迫條件下生理正常。 方法學本發明通過以下方法學更加詳細地描述，其不意欲以任何方式解釋為對本發明精神或范圍的限制。使用splinkerette方案來獲得XvSapl的上游基因組序列(AY100455)。該方案是 由Devon等(19%)改良的。啟動子的截短形式通過選擇性擴增全長啟動子區域來產生。從維柯薩分離的干旱誘導型啟動子XWsapl (SEQ ID NO. 1 ；圖1)及其截短片段 XvPsap2 (SEQ ID NO. 2 ；圖2)和XvPsap3 (SEQ ID NO. 3 ；圖3)的基因表達性能通過使用表 達盒，土壤桿菌(Agrobacterium)介導的煙草(Nicotiana tabacum)轉化和黑墨西哥甜玉 米(BMS)細胞的轉化來確定，所述表達盒包含單獨驅動Iuc報告基因表達的截短啟動子，所 述Iuc報告基因后面是nos終止子。另外，將包含驅動Iuc報告基因表達的XWsapl及隨 后的nos終止子的表達盒轉化到玉米中。為了確定這些啟動子是否是脅迫誘導型，利用定量實時PCR(qPCR)對轉基因細胞 和植物進行響應鹽和脫水脅迫的Iuc轉錄分析。轉基因BMS細胞經歷200mM NaCl鹽脅迫。 轉基因煙草和玉米暴露于脫水處理。BMS細胞的 qPCR分析說明 Iuc mRNA對于XvPsapl (5倍；P < 0. 05)和XvPsap2(l. 9 倍；P < 0. 05)，在鹽脅迫M小時內上調，而在使用XvI3SapS (1. 9倍；P < 0. 05)時，上調作 用發生在48小時后(圖10A)。對脫水煙草觀察到類似的趨勢，其中在開始脫水后72小時 記錄到最佳表達水平。Xvl^sapl活性在轉基因煙草中很顯著(7倍；P < 0. 05)，而XVI^ap2 和XvPsap3分別表現出2. 2和1. 6倍的增加(圖10B)。在脫水的玉米中，XvPsapl在第三 天也表現出顯著的活性峰，其具有4倍的Iuc表達(圖10C)。總之，這些結果提示XWsapl 啟動子最具活性且應該參與針對干旱的早期響應，因為其在轉基因植物經歷缺水后不久達 到峰值。這些發現由Garwe等(2003,2006)驗證，他們分離XvSapl基因，其XvI3Sapl啟動 子在維柯薩中天然調節。他們發現XvSapl基因在模式植物中賦予針對脫水、高溫和鹽度的 耐受性。更近期，Iyer等Q007)報告了關于脫水的維柯薩中XvSapl基因表達的類似趨勢。 他們注意到XvSaplmRNA在60%相對水含量時上調。隨后，表達減少但在15% RffC時再次 增加。該觀察致使他們斷定XvSapl可以參與針對脫水的保護響應的最初階段和晚期階段。預期該脅迫耐受性玉米品系的基因表達可以在不需要施用化學制劑的條件下，由 環境脅迫諸如干旱誘導，從而使得脅迫耐受性玉米維持其細胞膜完整性并幸免于干旱脅迫 過程中經歷的活性氧類別(ROS)的有害作用。參考文獻Devon RS Porteous DJ & Brokkes AJ (1995) ‘Splinkerettes-improvedvectore ttes or greater efficiency in PCR walking(Splinkerettes-PCR 步行中的改良的小載 體或較高功效)，Nucleic Acids Research (核酸研究)23 :1644-1645.Galun E & Breiman A(1996) 'Transgenic plants ( S @ 物)，ImpericalCollege Press (Imperical 學院出版社)，美國.Garwe D Thomson JA & Mundree SG(2003) 'Molecular characterization οfXVSAP1,a stress-responsive gene from the resurrection plant Xerophytaviscosa Baker (XVSAP1，來自復活植物維柯薩的脅迫響應基因的分子特征)’ Journal of Experimental Botany (實驗植物學雜志)54 191-201. Garwe D Thomson JA & Mundree SG (2006) iXvSAPl from Xerophytaviscosa improves osmotic-, salinity—and
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權利要求
1.分離的核酸，其包括與以下各項至少80%相同的核苷酸序列(a)SEQ ID NOs :1_3 中的任一種；(b)SEQID NOs :1_3中的任一種的片段，所述片段起脅迫誘導型啟動子的作用；(c)(a)中的任一種的互補序列(SEQ ID NOs :4_6)；(d)(a)中的任一種的反向互補序列(SEQ ID NOs :7_9)；(e)在標準條件下與(a)中的任一種的核苷酸序列雜交并起脅迫誘導型啟動子的作用 的序列；(f)在標準條件下與(a)中的任一種的互補序列(SEQID NOs :4-6)雜交并起脅迫誘 導型啟動子的作用的序列；或(g)SEQID NOs :1-3中的任一種的簡并或等位基因變體，所述變體起脅迫誘導型啟動 子的作用。
2.按照權利要求1的核酸，其與序列(a)-(g)中的任一種至少90%相同。
3.按照權利要求1的核酸，其與序列(a)-(g)中的任一種至少95%相同。
4.按照權利要求1的核酸，其包括SEQID NO 1的核苷酸序列。
5.按照權利要求1的核酸，其包括SEQID NO 2的核苷酸序列。
6.按照權利要求1的核酸，其包括SEQID NO 3的核苷酸序列。
7.按照權利要求1-6中任一項的核酸，其是脅迫誘導型植物啟動子。
8.按照權利要求7的核酸，其中所述脅迫是非生物脅迫。
9.按照權利要求8的核酸，其中所述非生物脅迫歸因于寒冷條件。
10.按照權利要求8的核酸，其中所述非生物脅迫歸因于滲透脅迫條件。
11.按照權利要求10的核酸，其中所述滲透脅迫選自由熱、干旱、干燥、冷凍和高鹽組 成的組。
12.按照權利要求1-11中任一項的核酸，其源自維柯薩(Xerophytaviscosa)。
13.按照權利要求1-12中任一項的核酸，其中雜交發生在嚴格條件下，所述嚴格條件 包括在約60-約65°C，在0. ISSC中洗滌。
14.包含按照權利要求1-13中任一項的第一核酸的載體。
15.按照權利要求14的載體，其包括與所述第一核酸可操作連接的第二核酸，其中所 述第一核酸能夠起始連接的核酸在用所述載體轉化的植物中的轉錄。
16.按照權利要求15的載體，其中所述第二核酸是能夠增強所述植物脅迫耐受性的基因。
17.按照權利要求16的載體，其中所述基因選自由XvSapl、XvPrx2或XvPerl組成的組。
18.按照權利要求14-17中任一項的載體，其是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-來源的質粒構建體。
19.宿主細胞，其中已轉化有按照權利要求14-18中任一項的載體。
20.按照權利要求19的宿主細胞，其是植物細胞。
21.轉基因植物或植物部分，其由權利要求14-18中任一項的載體穩定轉化。
22.按照權利要求21的轉基因植物或植物部分，其中所述植物部分選自由以下各項 組成的組細胞、原生質體、細胞組織培養物、胼胝體、細胞團、胚芽、花粉、胚珠、種子、花、籽粒、耳穗、穗軸、葉、外殼、莖、根、根尖、花藥和穗絲。
23.按照權利要求21或22的轉基因植物或植物部分，其是單子葉植物或雙子葉植物或 植物部分。
24.按照權利要求21-23中任一項的轉基因植物或植物部分，其選自由下列各項組成 的組玉米、大麥、燕麥、黑麥、煙草、高粱、小麥、木薯、大米、甘薯、大豆、苜蓿、煙草、向日葵、 棉花、和油菜。
25.權利要求21-24中任一項的轉基因植物的種子。
26.用于增強植物脅迫耐受性的方法，其通過將包含權利要求1-13中任一項的核酸的 啟動子引入到所述植物中來完成。
27.按照權利要求沈的方法，其中還向所述植物中引入在所述啟動子的控制下的基因。
28.按照權利要求27的方法，其中所述基因增強所述植物的脅迫耐受性。
全文摘要
本文記述來自維柯薩(Xerophyta viscosa)的非生物脅迫誘導型啟動子(SEQ ID NOs1-3)，及其變體。還記述包含該啟動子和與該啟動子可操作連接的基因的載體，用該啟動子和基因轉化的植物或植物部分。
文檔編號C12N1/21GK102124113SQ200880120550
公開日2011年7月13日 申請日期2008年11月6日 優先權日2007年11月6日
發明者杰西·馬丘卡, 珍妮弗·安·湯姆森, 理查德·奧科斯, 雷維爾·耶爾 申請人:開普敦大學, 玉米信托基金會