AtMAPKKK18基因提高植物干旱抗性的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和生物技術領域，具體涉及AtMAPKKK18基因提高植物干 旱抗性的應用。
【背景技術】
[0002] 植物體在其生長發育過程中，會受到各種外界環境的影響，包括生物脅迫或者非 生物脅迫，而干旱脅迫是其中最重要的非生物脅迫之一。近年來，隨著全球氣候的劇烈變 化，干旱已經成為了一個全球性問題，干旱脅迫對植物體的影響主要表現在三個方面：一是 破壞植物膜系統，破壞內膜系統的區室化，同時使得一些膜結合的酶喪失活性，從而使細胞 的正常代謝發生紊亂；二是影響植物的光合作用，干旱缺水會造成氣孔關閉，使得C02的吸 收量降低，光合速率下降；三是抑制植物的生長發育，因為植物細胞的含水量高達80%，而 水分又是一切酶促反應的介質，因此水分減少必然會降低植物的代謝活動，同時水分減少 還會增強植物的呼吸作用，加速體內物質分解，從而導致作物減產。因此，研究植物的抗旱 機理，發掘植物體內的抗旱相關基因對于提高植物的抗旱性、提高作物產量以及培育抗旱 作物新品種等均具有重要的理論和應用價值。
[0003] 本發明人從擬南芥中分離到絲裂原活化蛋白激酶基因AtMAPKKK18的CDNA序列。 進一步構建CaMV35S啟動子驅動的AtMAPKKK18的植物表達載體，轉化擬南芥。獲得的超表 達轉基因擬南芥與野生型擬南芥相比抗旱能力明顯提升；而突變體的抗旱能力與野生型相 比是減弱的。對轉基因擬南芥、野生型和突變體的失水率進行檢測發現轉基因擬南芥的失 水率是最小的，而突變體的失水率是最大的。脫落酸（ΑΒΑ)處理后轉基因擬南芥的氣孔開 度也是最小的。因此AtMAPKKK18基因可用于植物抗逆基因工程，改善植物的抗旱能力。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種擬南芥基因AtMAPKKK18,將其連接到CaMV35S啟動子 驅動的植物表達載體上，利用膿桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥，獲得的轉基因植株抗 旱能力得到了大大提升。
[0005] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0006] 本發明從擬南芥中通過PCR的方法克隆得到AtMAPKKK18基因，插入到植物表達載 體PBI121中CaMV35S啟動子的下游，轉化植株，獲得超表達轉基因植株。
[0007] 上述所述的PCR引物為：
[0008] 5'：TCTAGAGTATCATTCTCCAAATGAATTGG
[0009] 3,：GAGCTCCTAATTCCGTCGAACCGTG
[0010] 反應體系為：
[0011] PCR擴增體系為25μL，具體成分如下。
[0012]
[0014] 反應步驟為：預變性：94°C5min;
[0015] 循環條件：94°C30s，55°C30s，72°Clmin;
[0016] 循環35次；
[0017] 后延伸：72°ClOmin。
[0018] 所述的AtMAPKKK18基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0019] 所述的AtMAPKKK18基因的編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0020] 一種含有AtMAPKKK18基因的重組載體為將所述的AtMAPKKK18基因插入植物表達 載體PBI121中CaMV35S啟動子的下游所得到的表達載體。
[0021] 本發明所述的AtMAPKKK18基因通過所述的含有AtMAPKKK18基因的重組載體導入 目的植物中。
[0022] 本發明提供了AtMAPKKK18基因在轉基因植株抗旱上的應用，所得到的轉基因株 系抗旱能力明顯增強。
[0023] 本發明還提供了含有AtMAPKKKlS基因的重組載體在轉基因植株抗旱上的應用。
[0024] 本發明所述擬南芥蛋白AtMAPKKK18基因的轉基因實驗證明，該基因參與調控植 物的生長發育和脅迫應答等過程，從而為植物品種的改良提供了一個優質基因。表達擬南 芥中的AtMAPKKK18基因能夠提高植物的抗旱能力。
【附圖說明】
[0025] 圖1是AtMAPKKK18基因的擴增產物電泳圖；
[0026] 圖2是AtMAPKKK18基因克隆載體電泳圖；1、2、3號泳道菌斑均為陽性克隆，4號泳 道為PCR陽性對照；
[0027] 圖3是AtMAPKKK18基因克隆載體和pBI121載體的酶切電泳；
[0028] 圖4是轉化有AtMAPKKK18的陽性菌斑的表達載體；1、3號泳道為陽性克隆，4號泳 道為陽性對照；
[0029] 圖5是雙酶切表達載體質粒電泳；
[0030] 圖6是4丨獻?1?1(18表達載體轉化農桿菌6￥3101菌液？〇?檢測電泳；2、7、8號泳 道為陽性克隆，9號泳道為陽性對照；
[0031] 圖7是六七獻?1?1(18超表達轉基因陽性苗鑒定；1、2、4、5、6、7、8、9為陽性苗 ；
[0032] 圖8是AtMAPKKK18超表達轉基因純合體株系表達量的鑒定；
[0033] 圖9是T-DNA插入示意圖；
[0034] 圖10是AtMAPKKK18T-DNA插入突變體的鑒定；
[0035] 圖11是突變體表達量的鑒定；
[0036] 圖12是野生型、超表達株系和突變體的存活率統計圖；
[0037] 圖13是AtMAPKKK18超表達株系和突變體的失水率統計折線圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0039] 實施例lAtMAPKKK18基因的分離鑒定
[0040] 1、TRIZ0L法提取擬南芥總RNA，方法如下：
[0041] (1)在1. 5mL離心管中加入lmLTrizol提取液；
[0042](2)加入0·lg液氮研磨的材料，混勻，室溫放置5min后，4°C，12000g離心lOmin;
[0043] (3)取上清，加0.2mL氯仿，劇烈搖動15s，室溫放置2-311^11，4°(：，1200(^離心 15min；
[0044](4)取水相，加0· 5mL異丙醇，室溫放置lOmin，4°C，12000g離心lOmin，取沉淀；
[0045] (5)用75%冷乙醇洗滌沉淀，4°(：，750(^離心51^11 ;
[0046] (6)去上清，沉淀干燥后用50μLDEPC-H20溶解，電泳或者測定吸光度檢測RNA質 量，-80°C保存。
[0047]2、總RNA中基因組DNA的去除
[0048]
[0049] 42°C反應 2min。
[0050] 3、RNA的反轉錄
[0051]
[0052] 37°C反應 15min，85°C反應 5sec，得反轉錄cDNA。
[0053] 基因組去除及RNA反轉錄試劑均購自TAKARA公司。
[0054] 4、AtMAPKKK18基因的擴增
[0055] (1)擴增引物為：
[0056] 3K18-5? ：TCTAGAATGAATTGGACTAGAGGAAAAACTTTAG
[0057] 3K18-3, ：GAGCTCCTAATTCCGTCGAACCGTG
[0058] 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0059] (2)擴增體系為：
[0060]
[0061] r-Taq酶，dNTP購自TAKARA公司。
[0062] (3)擴增條件為：
[0063] 預變性：94°C5min;
[0064] 循環條件：94°C30s，55°C30s，72°Clmin;循環 35 次；
[0065] 后延伸：72°ClOmin。
[0066] (4)反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的條帶，并切膠回收擴增得到的 1020bp的AtMAPKKK18全長序列（圖1)，用于后續實驗。
[0067] 實施例2轉基因株系的獲得
[0068] 1、AtMAPKKK18克隆載體的構建
[0069] (1)將回收的AtMAPKKK18序列片段連接pMD19-Tsimple載體，插入片段與載體的 摩爾數比為3:1。連接反應體系為：
[0070]
[0071] 將反應體系混勻，16