賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法和基因的制作方法

專利名稱：賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法和基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及賦予或增強靶微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法、用于該方法 的DNA、由該DNA編碼的蛋白、通過該方法得到的微生物、以及該微生物的培養方法。
背景技術：
微生物具有基于優異的催化作用的物質轉化能力。因此，在釀造或發酵食品的生 產、廢水或廢氣處理等領域被廣泛使用。最近，人們在實施或研究利用基因重組微生物進行 的藥品生產、生物乙醇的發酵生產、以及利用微生物的化學品合成，微生物應用技術成為重 要的產業技術。但是，在生產反應中發揮重要作用的微生物細胞時，消耗培養基及能量等成 本。另外，微生物反應往往在水溶液中進行，生產物質后必需從反應液中分離微生物。作為 分離方法，以往離心或過濾是主要方法。
為了使分離容易進行、以及連續或反復利用貴重的微生物細胞，人們認為微生物 細胞的固定化或自身凝集是有效的。作為現有的固定化技術，有利用褐藻酸等凝膠的包埋 固定法和使微生物細胞吸附在多孔質載體表面的表面固定法。但是，包埋固定法存在以下 缺點向凝膠內部輸送氧或基質往往是限速性的；凝膠的機械強度弱，通過攪拌等容易被 破壞；微生物細胞從凝膠內部漏出等。此外，現有的表面固定法并不是使目標微生物聚積在 表面的方法，只不過是將多孔質載體等投入存在大量多種微生物的廢水處理或環境凈化的 現場，使容易黏附的微生物以生物膜的形式擔載在表面。即，并不存在使目標微生物自由黏 附在固體表面的技術。另一方面，至于凝集，利用高分子聚合物等凝集沉淀劑的方法在廢水 處理中廣泛應用，此外本來還采用將凝集性的微生物篩選后使用的方法，但并不存在使非 凝集性的微生物細胞、特別是細菌自發凝集的技術。發明內容
本發明的目的在于提供賦予或增強不具有或具有弱的非特異黏附性或凝集性的 微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法。
本發明人等成功地從具有非特異黏附性的微生物中分離出黏附相關基因，發現該 基因是自轉運黏附素基因，以及通過將該基因導入靶微生物中，可以賦予或增強該微生物 非特異黏附性和/或凝集性，從而完成了本發明。
S卩，本發明包含以下發明。
(1)賦予或增強靶微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法，該方法包括
將編碼自轉運黏附素的DNA導入該靶微生物中，所述自轉運黏附素來自具有非特 異黏附性的微生物。
(2) (1)所述的方法，其中，具有非特異黏附性的微生物為不動桿菌屬 (Acinetobacter)細菌。
(3)⑴或⑵所述的方法，其中，編碼自轉運黏附素的DNA為以下
(a)、(b)或(C)的 DNA
(a)包含SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、 且編碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；
(c)包含SEQ ID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且編碼具有賦予或增強微生物 非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
(4) (1) (3)中任一項所述的方法，其中，靶微生物為埃希氏菌屬Escherichia) 細菌。
(5) (4)所述的方法，其中，埃希氏菌屬Escherichia)細菌為大腸桿菌。
(6) (1) (5)中任一項所述的方法，其中，將編碼自轉運黏附素的DNA和以下(a) 或(b)的DNA同時導入
(a)包含SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含與SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的 DNA。
(7) (6)所述的方法，其中，將以下(a)或(b)的DNA導入靶微生物中
(a)包含SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含與SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、 且具有賦予或增強宿主微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的DNA。
(8)賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性的微生物，該微生物是通過(1) (7) 中任一項所述的方法得到的。
(9)以下(a)、(b)或(c)的 DNA
(a)包含SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的DNA ；
(b)包含與SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、 且編碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；
(c)包含SEQ ID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且編碼具有賦予或增強微生物 非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
(10)賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性的微生物，該微生物中導入有(9)所 述的DNA。
(11) (10)所述的微生物，該微生物為埃希氏菌屬Escherichia)細菌。
(12) (11)所述的微生物，該微生物為大腸桿菌。
(13)以下(a)、(b)或(c)的蛋白
(a)包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸被缺失、取代、插 入或添加而得到的氨基酸序列、且具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活 性的蛋白；
(c)包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸序列、且具有賦予或增強微生物非特 異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白。
(14)微生物的培養方法，該方法包括
通過使⑶、(10)、(11)或(12)所述的微生物黏附在載體上和/或凝集來回收該微生物。
根據本發明，可以賦予或增強不具有或具有弱的非特異黏附性或凝集性的微生物 非特異黏附性和/或凝集性。由此，在微生物反應中，微生物的分離變得容易，可以高效回 收貴重的微生物細胞并連續或反復利用。


圖1顯示實施例1得到的序列片段的位置關系。
圖2顯示實施例1中的克隆和測序的結果得到的全核苷酸序列。
圖3顯示AadA的氨基酸序列。
圖4顯示使用ClustalW制作自轉運黏附素的信號肽、頭域、頸域、膜錨定區的各結 構域的序列多重對比，并比較序列的結果。
圖5顯示比較Tol5-0mpA的序列和與其顯示出同源性的外膜蛋白的序列的結果。
圖6顯示在光學顯微鏡下觀察通過插入aadA基因和aadA-ompA操縱子引起的形 態變化的結果。
圖7顯示黏附在聚氨酯表面的DH5 α aadA的電子顯微鏡照片。
圖8顯示黏附在聚氨酯表面的DH5 α aadA-ompA的電子顯微鏡照片。
圖9顯示存在于聚氨酯表面上的DH5 α (WT)的電子顯微鏡照片。
圖 10 顯示 DH5 α aadA-ompA、DH5 α aadA 和 DH5 α WT 的培養液的照片。
圖11顯示DH5 α aadA和DH5 α WT的自身凝集試驗的結果。
圖12顯示匯總實施例1中使用的引物的表。
具體實施方式
本發明的方法，其特征在于將編碼自轉運黏附素的DNA(自轉運黏附素基因)導 入該靶微生物中，所述自轉運黏附素來自具有非特異黏附性的微生物。
在病原性微生物等中，存在黏附于特定的生物表面(例如特定的細胞、生物或其 組織的表面)而形成菌落的微生物，但本發明中的具有非特異黏附性的微生物，是指具有 黏附于并不限于特定的生物表面、還包括載體等非生物表面的、任意的生物表面和非生物 表面的能力的微生物。具有非特異黏附性的微生物能夠黏附在例如玻璃、塑料和金屬等載 體上。
具有非特異黏附性的微生物的例子有革蘭氏陰性細菌、例如不動桿菌屬 (Acinetobacter)細菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌、埃希氏菌屬(Escherichia) 細菌、柄桿菌屬(Caulobacter)細菌、黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌、嗜血桿菌屬 (Haemophilus)細菌、耶爾森氏菌屬(Yersinia)細菌、巴爾通氏體屬(Bartonella)細菌、奈 瑟氏菌屬(Neisseria)細菌、放線桿菌屬(Actinobacillus)細菌等。在本發明中，特別優 選不動桿菌屬(Acinetobacter)細菌。
具有非特異黏附性的微生物的具體例子有不動桿菌屬(AcinetcAacter sp.) Tol5株。該菌株具有分解從廢氣處理反應器中分離的甲苯的能力，其以保藏號FERM Ρ-17188保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心(日本國茨城縣筑波 市東1-1-1筑波中心中央第6)。
微生物的非特異黏附性可以使用結晶紫染色的黏附試驗(CV黏附試驗)來評價。 具體而言，將菌體培養液離心，除去培養上清，向菌體團塊中加入無機鹽培養基，通過超聲 波處理得到菌體懸浮液，用培養基進行調整，使菌體懸浮液的濁度OD66tl恒定(0. 5以下)，之 后向48孔塑料制板的各孔中分別添加Iml懸浮液，在微生物的最適溫度下培養2小時，使 用移液管完全除去孔中的懸浮液，用Iml無機鹽培養基清洗孔，之后風干，向孔中加入 的結晶紫水溶液，在室溫下培養15分鐘，使用移液管除去結晶紫，再用Iml無機鹽培養基清 洗孔2次，之后風干，加入Iml無機鹽培養基，剝離黏附于孔內壁上的染色菌體，通過超聲波 處理使之分散，測定吸光度A59tlt5于是，可以評價吸光度A59tl為0. 15以上、優選0. 18以上、 更優選0. 2以上的微生物是具有非特異黏附性的微生物。
自轉運黏附素是指作為革蘭氏陰性細菌所具有的粘著性納米纖維報道的蛋白，已 知其與宿主的組織或細胞表層分子、細胞外基質發生特異性相互作用，但未見其非特異性 地粘著在各種固體表面的報道。據說自轉運黏附素具有黏附、浸入、細胞毒性、血清抗性、細 胞間傳播的功能。自轉運黏附素具有N末端信號肽、內部過客結構域、C末端易位子結構域 這些共通的區編成。其中，C末端易位子結構域是定義該屬的結構域。自轉運黏附素的分 泌由信號肽介導開始，通過Sec系統穿過內膜而分泌。接著，將易位子結構域插入外膜中， 形成β桶狀結構。最終，過客結構域通過外膜，出現在菌體表面。自轉運黏附素分為單體 自轉運黏附素和三聚體自轉運黏附素(Shane Ε. Cotter,Neeraj K. Surana和Jos印h W. St GemeIII 2005. Trimericautotransporters :a distinct subfamily of Autotransporter proteins. TRENDS in Microbiology. 13 :199-205)。認為單體自轉運黏附素的易位子結構 域由1個亞單元形成β桶狀結構，該β桶狀結構是包含14個跨膜逆平行折疊和跨膜 α-螺旋的親水性路徑。但是，已知三聚體自轉運黏附素的易位子結構域在外膜中形成對熱 穩定且耐SDS的三聚體，具有4個β -折疊的亞單元發生寡聚化，由三個亞單元形成12條 鏈的β桶狀結構。另外，大多通用自轉運黏附素具有分子內陪伴區，但三聚體自轉運黏附 素亞家族中不存在分子內陪伴區。并且，事實上所有單體自轉運黏附素的過客結構域均與 易位子結構域形成非共價鍵而連接在細菌表面、或者被釋放到細胞外，相對于此，在所有三 聚體自轉運黏附素蛋白中，認為過客結構域與易位子結構域通過共價鍵連接。
三聚體自轉運黏附素簡稱為TAA(Trimeric autotransporteradhesin)，作為 形成共通寡聚物結構的卷曲螺旋型的新綱，還被稱作Oca家族(寡聚卷曲螺旋型黏附 素家方矣)(Andreas Roggenkamp, Nikolaus Ackermann, Christoph A. Jacobi, Konrad Truelzsch，HaraldHoffmann 禾口 Jurgen Heesemann 2003. Molecular analysis of transport andoligomerization of the Yersinia enterocolitica adhesin YadA. J Bacteriol. 185 :3735-3744)。
在本發明中，優選三聚體自轉運黏附素。作為三聚體自轉運黏附素，例如有作 為小腸結腸炎耶爾森菌(Yersina enterocolitica)的黏附素的YadA(Yersina adhesin A) (El Tahir Y，Skurnik Μ. 2001. YadA, themultifaceted Yersinia adhesin. Int J Med Microbiol. 291 :209-218)、引起髓膜炎的流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) 的 Hia(St Geme JW3rd, Cutter D. 2000.The Haemophilus influenzae Hia adhesin is anautotransporter protein that remains uncleaved at the C terminus and fullycell associated. J Bacteriol. 182 :6005-13)、引起牙周病的伴放線放線桿菌(Aggregatibacter(Actinobacillus)actinomycetemcomitans)的 EmaA (Mintz, K.P.2004. Identification of an extracellular matrix proteinadhesin, EmaA, which mediates the adhesion of Actinobacillusactinomycetemcomitans to collagen. Microbiο 1 ogy. 150，26774688)、作為呼吸系統感染癥的主要病原菌的粘膜炎莫拉氏菌 (Moraxellacatarrhalis)的 UpsA 1、A2 (Lafontaine ER, Cope LD, Aebi C, Latimer JL, McCracken GH Jr, Hansen EJ. 2000. The UspA lprotein and a secondtype of UspA2 protein mediate adherence of Moraxella catarrhal is tohuman epithelial cells in vitro. J Bacteriol. 182 :1364-73)、引起貓抓病的漢氏巴爾通氏體(Bartonellahenselae) 的 BadA(Riess Τ, Andersson SG, Lupas A, Schaller M,Schafer A, Kyme P, Martin J, Walzlein JH, Ehehalt
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優選的自轉運黏附素的例子有包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白、與 該蛋白功能同等的蛋白。功能同等的蛋白是指，該蛋白與包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列的蛋白具有同等的生物學功能、生化學功能。作為與包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列的蛋白功能同等的蛋白，例如有包含SEQ ID NO :2中1個或多個氨基酸被缺失、取代、 插入或添加而得到的氨基酸序列的蛋白，該蛋白具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/ 或凝集性的活性。并且，還可以列舉以下蛋白(c)包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸 序列、且具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白，換言之，包含從 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中刪除1處或多處數十 數百、有時千以上的連續的氨基 酸序列而得到的氨基酸序列、且不喪失賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活 性的缺失蛋白。
1個或多個氨基酸的缺失、取代、插入或添加可以利用常用技術、例如位點特異性 誘變法Goller等人、Nucleic Acids Res. 106478-6500，1982)，通過修飾編碼該蛋白的DNA 序列(例如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列)來實施。
其中，作為蛋白的構成要素的氨基酸的側鏈在疏水性、電荷、大小等方面各不相 同，但實質上在不影響蛋白整體的三維結構(也稱作立體結構)的意義上，保守性高的幾種 關系根據經驗或通過理化實測而獲悉。例如，作為不同氨基酸殘基間的保守取代的例子，已 知有甘氨酸(Gly)與脯氨酸(ftx))、甘氨酸與丙氨酸(Ala)或纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)與 異亮氨酸(He)、谷氨酸(Glu)與谷氨酰胺(Gin)、天冬氨酸(Asp)與天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)與蘇氨酸(Thr)、蘇氨酸與絲氨酸(kr)或丙氨酸、賴氨酸(Lys)與精氨酸(Arg) 等氨基酸間的取代。因此，氨基酸的取代優選為保守取代。
由于包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白是具有信號肽、頭域、頸域、莖部 區域(stalk domain)和膜錨定區的三聚體自轉運黏附素，所以氨基酸突變優選為維持該結 構域結構的突變。在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中，信號肽相當于1 57位的氨基酸， 頭域相當于108 269位和四97 3148位的氨基酸，頸域相當于296 319位和3149 3172位的氨基酸，莖部區域相當于406 四66位和3173 3537位的氨基酸，膜錨定區相 當于3538 3630位的氨基酸。
“多個”通常是指2 10個、優選2 5個、更優選2 3個。功能同等的蛋白通 常在氨基酸序列水平具有高同源性。高同源性是指，在氨基酸水平通常具有70%以上、優 選80%以上、更優選90%以上、進一步優選95%以上、最優選99%以上的同源性(或同一 性)。
在包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸序列的蛋白中，可以刪除的數十 數百 個連續的氨基酸序列優選為相當于單方或兩方的莖部區域、單方的頭域、單方的頸域的序 列部位，可以刪除其中的一個連續序列或多個連續序列。更優選刪除上述各結構域的部位 中接近氨基末端的頭域 莖部區域的全區(108 四66位)或接近羧基末端的頭域 莖部 區域的全區(四97 3537位)。進一步優選刪除莖部區域中多個可見的重復區，使其不再 重復，各出現1次。最優選刪除莖部區域中多個可見的重復區中的任一處。
作為優選的自轉運黏附素基因、即編碼自轉運黏附素的DNA的例子，例如有包含 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的DNA、以及與該DNA功能同等的DNA。作為與包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的DNA功能同等的DNA，可以列舉包含與SEQ ID NO :1所示的核苷 酸序列具有70%以上、優選80%以上、更優選90%以上、進一步優選95%以上、最優選98% 以上同源性(或同一性)的核苷酸序列、且編碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/ 或凝集性的活性的蛋白的DNA。或者，在嚴格條件下和包含與SEQ ID NO :1所示的核苷酸 序列互補的核苷酸序列的DNA雜交、且編碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝 集性的活性的蛋白的DNA。可以進一步列舉包含SEQ ID NO :1所示的一部分核苷酸序列、 且編碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA，換言之，包 含從SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中刪除1處或多處數十 數千個連續的核苷酸序列而 得到的核苷酸序列、且由其翻譯的蛋白不喪失賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性的活 性的缺損基因的DNA。
嚴格條件是指形成特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件，有低嚴格條件和 高嚴格條件，優選高嚴格條件。低嚴格條件是指，在雜交后的清洗中，例如在42°C下、在 5XSSC.0. 1% SDS中清洗的條件，優選為在50°C下、在5XSSC、0. SDS中清洗的條件。 高嚴格條件是指，在雜交后的清洗中，例如在65°C下、在0. 1 XSSC^nO. SDS中清洗的條 件。
核苷酸序列中的突變也優選為維持包含信號肽、頭域、頸域、莖部區域和膜錨定區 的該結構域結構的突變。在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中，信號肽相當于1 171位 的核苷酸，頭域相當于322 807位和8989 9444位的核苷酸，頸域相當于886 957位 和9445 9516位的核苷酸，莖部區域相當于1216 8898位和9517 10611位的核苷酸，膜錨定區相當于10612 10890位的核苷酸。
在包含SEQ ID NO=I所示的一部分核苷酸序列的DNA中，可以刪除的數十 數百 個連續的核苷酸序列優選為編碼單方或兩方的莖部區域、單方的頭域、單方的頸域的序列 部位，可以刪除其中的一個連續序列或多個連續序列。更優選刪除上述各結構域的部位中 編碼接近氨基末端的頭域 莖部區域的全區的區(322 8898位)或編碼接近羧基末端的 頭域 莖部區域的全區的區(8989 10611位)。進一步優選刪除莖部區域的編碼區中多 個可見的重復區，使其不再重復，各出現一次。最優選刪除莖部區域的編碼區中多個可見的 重復區中的任一處。
通過將編碼自轉運黏附素的DNA和包含SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA — 同導入靶微生物中，可以進一步提高靶微生物的非特異黏附性和/或凝集性。由于包含SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的DNA與不動桿菌屬(AcinetcAacter)細菌等所具有的外膜蛋 白OmpA基因具有同源性，所以該DNA是編碼外膜蛋白的DNA。可以導入與包含SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的DNA功能同等的基因。作為與包含SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列 的DNA功能同等的DNA，可以列舉包含與SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有90%以上、 優選95%以上、更優選98%以上同源性的核苷酸序列的DNA。或者，可以列舉在嚴格條件 下和包含與SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。
可以將含有編碼自轉運黏附素的DNA的操縱子導入靶微生物中，所述自轉運黏附 素來自具有非特異黏附性的微生物。例如，通過將包含SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列的 DNA導入靶微生物中，可以將編碼自轉運黏附素的DNA和上述編碼外膜蛋白的DNA同時導入 靶微生物中。可以導入與該操縱子功能同等的操縱子。作為功能同等的操縱子，可以列舉 包含下述DNA的操縱子包含與SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有70%以上、優選80% 以上、更優選90%以上、進一步優選95%以上、最優選98%以上同源性的核苷酸序列、且具 有賦予或增強宿主微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的DNA。
對導入編碼自轉運黏附素的DNA的靶微生物沒有特別限定，例如有不具有或具 有弱的非特異黏附性和/或凝集性的微生物。例如有埃希氏菌屬Escherichia)細菌、 例如大腸桿菌(Escherichia coli)；不動桿菌屬(Acinetobacter)細菌、例如乙酸鈣不 動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)；青枯菌屬(Ralstonia)細菌、例如真氧產堿桿菌 (Ralstoniaeutropha)；假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌、例如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)；氣單胞菌屬(Aeromonas)細菌、 例如豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)；產堿桿菌屬(Alcaligenes)細菌、例如廣泛產 堿桿菌(Alcaligenes latus)；黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌、例如野油菜黃單胞菌 (Xanthomonascampestris)等。
通過將編碼自轉運黏附素的DNA導入靶微生物中進行轉化，可以得到被賦予或增 強非特異黏附性和/或凝集性的微生物。典型的是，將編碼自轉運黏附素的DNA連接在適 當的載體上，利用該載體轉化靶微生物(宿主微生物)，從而可以得到被賦予或增強非特異 黏附性和/或凝集性的微生物。具體而言，通過多拷貝將該DNA導入宿主微生物中，或者在 以組成型表達的啟動子支配下連接該DNA、或者在誘導酶型啟動子支配下連接該DNA，可以 得到被賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性的微生物。將編碼自轉運黏附素的DNA和編 碼外膜蛋白的DNA —同導入的情形、以及導入含有編碼自轉運黏附素的DNA的操縱子的情形亦同。
首先，將目標DNA連接到載體中，制備重組載體。上述載體中，除了使用能夠在 宿主細胞中自主增殖的噬菌體、粘粒、人工染色體或質粒以外，例如在將質粒以表達盒 (expression cassette)的形式導入染色體中時，必需具有在該表達盒的構建所必需的宿 主(例如大腸桿菌)中自主復制的能力，但未必具有在導入該表達盒的宿主(例如酵母) 中自主復制的能力。這些重組載體例如還可以使用設計成在大腸桿菌和酵母兩者中能夠使 用的穿梭載體等。
作為質粒，例如有來自大腸桿菌的質粒(例如pET21a⑴、pET3h⑴、 pET39b (+)、pET40b (+)、ρΕΤ43· la(+)、pET44a(+)、pKK223_3、pGEX4T、pUC118、pUC119、 pUC18、pUC19 等)、來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的質粒(例如 pUB110、pTP5 等)、來 自酵母的質粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50等)、以及酵母中畢赤酵母(Pichiapastoris)用 的質粒(例如 pPICZ、pPICZa、pHIL_D2、pPIC3. 5、pHIL-Sl、pPIC9、pPIC6、pGAPZ、pPIC9K、 pPIC3. 5K、pA0815、pFLD)等，作為噬菌體DNA，有λ噬菌體(Xgtll、λ ZAP等)。并且，還 可以使用牛痘病毒等動物病毒、桿狀病毒等昆蟲病毒載體。此外，可以將PCR4-T0P0(注冊 商標)等市售的克隆用載體用于克隆及序列確認。
將DNA插入載體中可以采用以下方法首先，用適當的限制酶切斷已純化的DNA， 之后將其插入適當的載體DNA的限制酶切位點或多克隆位點，并與載體連接的方法等。例 如，目標DNA可以利用通常已知的方法進行合成，再將其插入載體中，使用引物通過PCR法 進行擴增，使兩末端含有適當的限制酶的切斷位點。PCR反應的條件可以由本領域技術人員 適當確定。
此外，在重組載體中，除了啟動子和本發明的DNA外，根據需要還可以連接有增強 子等順式元件、剪接信號、poly A添加信號、選擇標志物、核糖體結合序列(SD序列)等。選 擇標志物的例子有卡那霉素、氨芐青霉素、四環素、氯霉素等耐藥性標志物；亮氨酸、組氨 酸、賴氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、色氨酸、尿嘧啶等營養要求性標志物，但并不限于此。
對啟動子沒有特別限定，本領域技術人員可以根據宿主微生物來適當選擇。例如， 當宿主為大腸桿菌時，可以使用T7啟動子、Iac啟動子、trp啟動子、λ -PL啟動子等。還可 以適當使用包含SEQ ID NO 所示的核苷酸序列的啟動子、以及與其功能同等的啟動子、 例如包含與SEQ ID NO 28所示的核苷酸序列具有90%以上、優選95%以上、更優選98% 以上同源性的核苷酸序列的啟動子。
連接DNA片段和載體片段時，使用公知的DNA連接酶。之后，將DNA片段和載體片 段退火后連接，制作重組載體。優選通過使用市售的連接試劑盒、例如Ligation High(高 效率連接試劑盒)(東洋紡株式會社制)，按照規定的條件進行連接反應，可以得到重組載 體。
包含克隆、連接反應、PCR等的重組DNA技術例如可以利用Sambrook，J等人， Molecular Cloning 2nd ed. ,9. 47-9. 58, Cold SpringHarbor Lab. press(1989)禾口 Short Protocols In Molecular Biology, ThirdEdition, A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, Inc.中記載的技術。
所得載體根據需要可以通過煮沸法、堿性SDS法、磁珠法以及利用上述原理的市 售試劑盒等進行純化，再利用例如乙醇沉淀法、聚乙二醇沉淀法等濃縮方法進行濃縮。
對向靶微生物中導入重組載體的方法沒有特別限定，例如有使用鈣離子的方法、 電穿孔法、脂質轉染法等。
含有目標DNA的轉化微生物可以利用該重組載體所具有的標志物基因，通過在例 如含有氨芐青霉素、卡那霉素等抗生素的LB培養基瓊脂板上形成菌落來進行篩選，但為了 確認所克隆的宿主微生物是否是利用重組載體轉化的微生物，可以使用其中一部分，進行 通過PCR法插入的擴增確認、或使用序列分析儀進行的雙脫氧法的序列分析。除導入能夠 自主復制的質粒的形式外，還可以采用下述染色體插入型的導入方法將與染色體基因同 源的區配置在載體內，使之發生同源重組以導入目標基因。
用培養基培養所得的轉化微生物的方法可以按照用于培養靶微生物的常規方法 來進行。作為培養以大腸桿菌或酵母菌等微生物作為宿主得到的轉化微生物的培養基，只 要是含有微生物能夠利用的碳源、氮源、無機鹽類等、且可以有效進行轉化微生物的培養的 培養基即可，可以使用天然培養基，也可以使用合成培養基。具體例子有M9培養基、M9G培 養基、BS培養基、LB培養基、營養肉湯(NutrientBroth)培養基、肉膏培養基、SOB培養基、 SOC培養基、PDA培養基等。
作為碳源，只要是可以利用的碳化合物即可，例如可以使用葡萄糖等糖類；甘油 等多元醇類；甲醇等醇類；或丙酮酸、琥珀酸或枸櫞酸等有機酸類。作為氮源，只要是可以 利用的氮化合物即可，例如可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕堿性 提取物、甲基胺等烷基胺類、或氨或其鹽等。此外，根據需要，還可以使用磷酸鹽、碳酸鹽、硫 酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等鹽類、特定的氨基酸、特定的維生素、消泡劑等。另外，根據需 要，可以向培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等蛋白表達誘導劑。
培養通常在振蕩培養或通氣攪拌培養等需氧條件下、優選0 40°C、更優選10 37°C、特別優選15 37°C下進行。培養期間，培養基的pH可以在宿主能夠發育、且不損及 自轉運黏附素的活性的范圍內適當變更，但優選為PH4 8左右的范圍。pH的調整使用無 機或有機酸、堿溶液等來進行。培養中，根據需要，可以向培養基中添加氨芐青霉素或四環 素等抗生素。
如上操作，可以得到被賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性(自身凝集性)的 微生物。有關所得微生物的非特異黏附性，可以通過上述利用結晶紫染色進行的黏附試驗 (CV黏附試驗)來評價，有關凝集性，可以如下評價。將菌體培養液離心，除去培養上清，向 菌體團塊中加入無機鹽培養基，通過超聲波處理得到菌體懸浮液，用培養基進行調整，使菌 體懸浮液的濁度OD66tl恒定，以此時的OD66tl作為初期0D·，通過將玻璃離心管中的菌體懸浮 液在室溫下靜置，使形成的細胞自身凝集體沉淀，測定上清的OD66tl的時間變化。于是，可以 評價OD66tl的減少為初期OD66tl的10%以上、優選15%以上、更優選20%以上的微生物是具 有凝集性的微生物。
培養所得的微生物后，通過通常已知的方法、例如機械方法、使用溶菌酶等的酶方 法或使用表面活性劑等的化學處理破壞菌體或細胞，也可以分離自轉運黏附素蛋白。
本發明不僅可以直接用于傳統的發酵產業或廢物處理，對生物質能的生產或使用 微生物細胞的綠色生物技術也極為有效。特別是能量或化學品的生產要求低成本，通過賦 予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性使其固定化及自身凝集，這直接關系到生產過 程的效率化，能夠成為這些產業發展的基礎。12實施例
實施例1黏附相關基因的分析
1-1黏附件降低的突變株Tl和反向PCR用引物的制作
為了分析不動桿菌屬(AcinetcAacter sp. ) Tol5株的黏附相關基因，使用轉座子 隨機插入法制作黏附性降低的突變株。以Tol5 WT(Tol5野生株)作為受體細胞、以具有轉 座子載體的E. coli S17-1作為供體細胞，在下接合22 M小時。用含有甲苯和四環 素的培養基進行選擇培養，進行所得株的黏附試驗。其結果，成功地得到了若干黏附性降低 的株。采集它們的基因組DNA，以用限制酶HindIII處理的DNA作為模板，使用DIG-Iabeled tetA作為探針，進行DNA雜交。其結果，存在在約51Λ的位置明顯檢測到譜帶的株，以其作 為黏附性降低株Tl。在電子顯微鏡下觀察Tl株的表面結構時，觀察到缺失附器(細胞表層 的突起物)的形態。
接著，為了分析Tl株的轉座子插入位點，從瓊脂糖凝膠中切出通過DNA雜交檢測 到的約51Λ的DNA片段。以該片段作為Τ1-51Λ。將Τ1-51Λ插入pUC118載體中，之后克隆 到E. coli DH5 α中。測定所得質粒DNA的插入部分的兩端的序列，結果確認在Τ1-51Λ的 內部，除了存在Τη5的序列外，還存在來自Tol5WT株的68bp的核苷酸序列(SEQ ID NO :6)。
1-2黏附相關基因的克降
為了分析黏附性降低的突變株Tl的轉座子插入位點的核苷酸序列，根據通過分 析Tl而明確的插入位點68bp的序列，嘗試著進行WT株的染色體DNA的反向PCR。首先， 用BS培養基培養Tol5野生株，之后進行DNA提取、RNase處理。用存在于pUC118的多克 隆位點的 HindIII 以外的限制酶(Acc I、Hae III、Hinc II、Kpn I.Pst I、Pvu II,Sal I、 Sau3A I,Sma I,Xba I)處理所得的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳(以下記作Ε. P.)來確 認。分析Tl時使用限制酶HindiII，但由于在68bp內確認到Hindi11位點，所以判斷限制酶 HindIII不適合用于得到目標區，在此將其除去。E.P.的結果，在與基因組同等的高分子量 的位置殘留有譜帶的酶，其限制酶反應位點少、片段的長度太長，所以不適合。另外，出現低 分子量譜帶的酶，其片段太短，即使進行測序，所得的序列信息也少，所以不適合。因此，選 擇在1，50(^ 5，00(^ 出現信號的圯1^ II，對基因組DNA進行Hinc II處理(Tol5/Hinc II)。連接已進行DNA純化的Tol5/HinC II，使其進行自身連接(自身環化)(Tol5/HinC II/circular)0然后，以其為模板，進行反向PCR。為了連接在進行了 Hinc II處理的載體 上，使用帶有Hinc II接頭的引物。條件如下。以所得的51Λ的PCR產物作為Το15_51Λ。
反向PCR條件
聚合酶K0D-plus-
模板DNA :Tol5/Hinc 11/環
引物 F:Tl_5kbR3
引物 R:Tl_5kbRC
退火66°C
伸長5分鐘
純化所得的PCR產物，之后用限制酶Hinc II進行處理。該操作的目的在于縮短 片段以提高克隆的成功率、以及使接頭形成Hinc II切斷面。為了分離收集各樣品，從瓊脂糖凝膠中提取 DNA^jIAquickGel Extraction Kit，QIAquick 凝膠提取試劑盒)。將 2. 8kb 片段和 1. 8kb 片段分別作為 Tol5-2. 8kb 和 Το15_1· 8kb。將 Το15_2· 8kb 和 Το15_1· 8kb 與 載體連接。之后進行轉化(化學法；藍白菌落篩選法)。采集白菌落，用LB液體培養基進 行培養，之后提取少量的質粒DNA。用限制酶Hinc II處理質粒DNA，通過E. P.進行確認。 限制酶處理的結果，得到了載體+2. 81Λ和1.81Λ這樣的理想譜帶。另外，通過PCR確認片 段的大小和插入方向。條件如下所示。
PCR 條件
聚合酶Blend Taq
模板DNA :Tol5-l. 8kb、Το15_2· 8kb
引物 F :Tl_5kb R3、pUC118F
引物 R :Tl_5kb RC、pUC118R
退火62°C
伸長2分鐘
PCR 的結果，在！"015-2. 8kb 中，利用 pUC118RXTl-5kb R3 的引物對擴增了 2. 8kb 的片段；在Tol5-l. 8kb中，利用pUC118FXTl-5kb RC的引物對擴增了 1. 8kb的片段。根據 此結果，成功地確認了插入片段的大小，同時確定了片段插入的方向。對這兩株進行測序。 測序采用引物步移法。但是，出現了以下問題序列分析儀的信號混亂；而且在利用計算機 進行裝配(assembly)時，即使在認為是重疊區的位點也出現了不一致的核苷酸等。由分析 結果可知序列中存在多個長的重復序列。因此，還出現了以下等的困難裝配后的長度也 不滿足目標插入片段的長度、即2. 81Λ或1. Skb0于是，重復進行引物的設計和測序，終于確 定了插入片段的長度分的核苷酸序列。但是，由于是這種重復序列，所以結果的可靠性低。 于是，為了提高測序的確實性，決定直接克隆Το15-51Λ，并再次進行測序。為了進行TA克 隆，使用在Taq系統中正確性高的DNA聚合酶來進行PCR，擴增I\)15-51ib。PCR條件 如下所示。
PCR 條件
聚合酶Easy-AHigh-Fidelity PCR 克隆酶
模板DNA :Tol5/Hinc 11/環
引物 F :Tl_5kb R3-2
引物 R :Tl_5kb RC-2
退火67.9°C
伸長5分鐘
使用所得的PCR產物進行TA克隆。轉化按照化學法來進行，涂布在LB/Km瓊脂培 養基上。將菌落在LB/Km液體培養基中培養，培養后提取質粒DNA。為了確認插入，用限制 酶EcoR I處理DNA。其結果，可以確認載體和5kb的片段的存在。并且，通過PCR確認了插 入片段的大小。條件如下所示。
PCR 條件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :Tol5-5kb 質粒 No. 5
引物 F:pUC118F
引物 R:pUC118R
退火65 71 °C
伸長5分鐘
PCR的結果，可以確認到插入的51Λ譜帶。對其進行序列分析。測序再次通過引物 步移法來進行，但由于是重復結構，所以再次測序極為困難。根據之前的1. Skb和2. Skb的 序列信息，慎重地重復進行引物設計和測序，花費了精力和時間，最終成功地得到了具有巨 大的重復結構的4907bp的序列。由于該Tol5-5kb的序列與Tol5_2. 8kb和Το15_1· 8kb的 序列完全一致，所以測序的確實性提高。所得的Το15-51Λ的序列見SEQ ID NO :7。根據該 序列，利用BLAST對翻譯蛋白進行同源性檢索時，發現了與在其他細菌中報道的自轉運黏 附素顯示出20 30%的同源性的4(^6bp的0RF，轉座子也被插入該ORF內。由此可以明 確與iTol 5株的高黏附性和附器的生產有關的ORF的存在。但是，該ORF在Το15_51Λ的 3’末端被中途切斷，為了明確全0RF，必需重新克隆與Το15-51Λ接續的下游域。另外，可以 說與細菌的粘著有關的自轉運粘附素通過同源性檢索而顯示出來，由于同源性低、作為特 定該組的決定者的羧基末端的膜錨定區也未出現，所以充分考慮到可能是部分序列類似的 其他蛋白。
為了根據所得序列的結果進一步得到下游的序列信息，嘗試著獲取由DNA雜交產 生的特定片段。為了制作DIG標記的探針，避開重復部分來制作引物。使用該引物，以Tol 5株的染色體DNA為模板，擴增160bp的目標譜帶。PCR條件如下所示。
PCR 條件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :1^)15基因組
引物F :Tol5-ad-探針 2F
引物R To 15-ad-探針跗
退火66 72°C
伸長1秒
由于有多個譜帶被擴增，所以在已分析的部分中，推定不存在反復的探針的序列 部分也在未分析的下游區進一步出現重復，為了推進測序的進行，使用QIAquick凝膠提取 試劑盒只切出160bp的目標譜帶。以其為模板，利用PCR來制作探針。PCR條件如下所示。
PCR 條件
PCR DIG探針合成試劑盒
模板DNA :Tol5160bp探針凝膠提取
引物F To 15-ad-探針 2F
引物R To 15-ad-探針跗
退火67.9°C
伸長2分鐘
使用所得的探針，對用各種限制酶處理Tol 5株的染色體DNA而得到的消化物進 行DNA雜交。其結果，在限制酶I^st I的消化物中，在31Λ和2. 31Λ的位置檢測到探針雜交 的信號。于是，將這兩個DNA片段從瓊脂糖凝膠中切出并進行提取OHAquick凝膠提取試劑 盒)。將它們作為Tol5-3kb和Tol5-2. 3kb。連接所切出的DNA和經PstI消化的pUC118。通過所得的重組載體轉化大腸桿菌DH5 α (化學法；藍白菌落篩選法)。進一步通過菌落雜 交，選擇導入有這些片段的轉化體。其結果，產生信號的菌落只有導入有Το15-31Λ的菌落。 采集產生信號的部分菌落(Tol5-CC、-Cl、-C2、-O)，用LB/Amp液體培養基培養后，提取少 量的質粒DNA。分別用限制酶I3St I進行處理。對其進行DNA雜交時，在I\)15-CC、-C2、-C3 中產生信號。對它們進行測序。插入的兩端的測序結果，不存在與已知序列一致的片段。 另外，這些序列各自不同。即，與之前確定了核苷酸序列的51Λ區(Το15-51Λ)接續的下游 域的克隆失敗。此時還無法確定其原因。但本發明人認為問題在于從以Tol 5株的染色 體DNA為模板進行的DNA雜交中出現的多個信號中勉強選擇一個并切出片段，由此制作了 探針。于是，暫時保留這些克隆株，以獲取與Το15-51Λ連續的片段。
將模板由 \)15染色體變更為pUC118: :Tol5-5kb質粒DNA，利用PCR法制作新的 DIG標記探針。由于該質粒只含有一處探針區，所以認為只產生1種(1本)DIG標記的擴增 片段。PCR條件如下所示。
PCR 條件
PCR DIG探針合成試劑盒
模板DNA :pUC 118: :Tol5-5kb 質粒 DNA
引物F To 15-ad-探針 2F
引物R To 15-ad-探針 2R
退火68°C
伸長2分鐘
不出所料，被擴增的片段只有目標大小(160bp)，成功地制作了高純度的新探針。 使用該探針，與使用上述含有Το15-31Λ和Tol5-2. 3kb的載體進行轉化操作后得到的板進 行菌落雜交。采集認為發出信號的菌落，在板中培養，再次進行菌落雜交以進行確認。采 集產生信號的部分菌落(3kb的No. 3和2. 3kb的No. 6、12、13、21、22)，用LB/Amp液體培養 基培養后，提取少量的質粒DNA。所得質粒DNA用限制酶I^st I進行處理。其結果，各質粒 含有目標的3kb(No. 3)或2. 3kb(No.6、12、13、21、22)，這些插入片段均與160bp的探針雜 交。如果這些片段如期待的那樣含有與Το15-51Λ接續的下游域，則應該含有夾在I^stI位點 與HincII位點之間的約1. 5kb的核苷酸序列作為與Το15-51Λ重復的區。因此，用限制酶 Hinc II處理在多克隆位點的I3StI位點插入有這些片段的上述質粒時，應該得到在1. 5kb 的重復片段中添加有多克隆位點的一小部分的約1. 5kb的DNA片段。于是，用HincII消 化No. 3、6、22的質粒時，從它們中均可得到約1. 5kb的DNA片段。但是，其大小各自略有不 同。其中，首先對No. 6的質粒進行測序，所述No. 6的質粒除了被切成1.51Λ片段外、還被 切成認為含有3. Ikb的載體片段的3. 3kb片段和600bp的片段。但是，根據以前進行的測 序或DNA雜交的結果，由于該質粒的重復序列部分多，在多個部分發生退火，所以認為通過 目前確定作為高通量的方法的引物步移法無法正確測序。另外，想定在計算機裝配中也會 出現故障。即，在Το15-51Λ時經歷的困難有可能重復出現。于是，這次不采用引物步移法， 而是決定制作缺失突變體的系列，盡管這要花費精力和時間。為了制作從之前的1. 5kb的 重復片段側依次刪除插入到No. 6中的2. 3kb的Tol 5的DNA片段的突變體，用3’突出的 SacI和5’突出的^CbaI處理該質粒后，用核酸外切酶III進行消化。通過制作錯開核酸外 切酶III作用的時間的一系列試樣，得到被刪除的長度不同的缺失產物。之后，再利用綠豆、核酸酶(Mimg Bean Nuclease)進行末端平滑化以及利用Klenow片段進行末端修復，最后 通過實施平端連接，得到缺失質粒系列。通過乙醇沉淀進行純化后，通過用經核酸外切酶 III消化應該消除的)CbaI進行處理，排除了未反應的質粒的影響，通過用該DNA轉化大腸桿 菌DH5ci，得到了缺失突變體的系列。采集多個轉化體菌落進行培養，用限制酶HincII處 理已提取的質粒。考慮到1通徑(path)的序列的大小(800bp )，以適當的間隔選擇缺 失突變體，分別進行測序。綜合各測序結果，確定了 2280bp的核苷酸序列。該序列見SEQ IDNO :8(Tol5-No. 6)。Το15_Νο· 6含有與Tol5-5kb重復的約1. 5kb的序列，由此可以確定 與Το15-51Λ接續的約750bp的核苷酸序列。由此，編碼與上述自轉運黏附素顯示出低同源 性的蛋白的ORF與4707bp接續，由此編碼的蛋白的氨基酸序列也具有1569個殘基。但是， ORF尚未終結，其在3’末端中斷。因此，必須進一步克隆與Tol5-No.6連接的下游域。另 夕卜，雖然該序列與伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetem comitans)的EmaA顯 示出最高的同源性，但其在氨基酸水平的同源性也低至26%，達不到膜錨定區的編碼區，所 以不能定論其是屬于TAA家族的蛋白。總之，推定通過轉座子的插入而被破壞的黏附相關 基因所編碼的蛋白是非常巨大的、而且以復雜方式混入了長的重復序列的新型粘附蛋白。
為了得到與Tol5-No. 6接續的下游域的序列信息，根據重新明確的序列，再次避 開重復，以含有Tol5_No. 6的質粒為模板，利用PCR法制作158bp的探針。PCR條件如下所不。
PCR 條件
PCR DIG探針合成試劑盒
模板DNA :pUC118: Ιο δ-Νο. 6
引物F To 15-ad-探針 5F
引物R To 15-ad-探針 6R
退火65°C
伸長2分鐘
由于在離合成的探針區近的上游存在限制酶HindIII位點，所以用HindIII消化 Tol 5的染色體DNA后進行E. P.，再利用158bp探針進行DNA雜交。其結果，又確認到3 個信號，所以從瓊脂糖凝膠中切出所有信號部分，提取DNA(使用DEAE紙)。按照分子量從 大到小，依次為 Tol5-B(2500bp), Tol5_M(1200bp)、Tol5_S (600bp)。連接切出的 DNA 和用 HindIII處理的pUC118。純化連接后的DNA，接著進行轉化(電穿孔；藍白菌落篩選法)。使 用之前的158bp的探針，對形成有菌落的板進行菌落雜交。采集產生信號的部分的菌落，用 LB/Amp液體培養基培養。提取少量的質粒DNA，用限制酶HindIII處理，確認插入片段的長 度時，確認插入了 2500bp、1200bp、600bp的長度的Tol 5株DNA片段，所以對這些質粒進行 測序。由于M片段和S片段短，所以利用1通徑序列可以分別確定1185bp和6(X3bp的核苷 酸序列。另外，為了 B片段的測序，制作缺失突變體。用3’突出的Mel和5’突出的^CbaI 處理含有B片段的質粒后，用核酸外切酶III進行消化。通過制作錯開核酸外切酶III的作 用時間的一系列試樣，得到被刪除的長度不同的缺失產物。之后，進一步利用綠豆核酸酶進 行末端平滑化以及利用Klenow片段進行末端修復，最后進行平端連接，從而得到缺失質粒 的系列。通過乙醇沉淀進行純化后，用通過核酸外切酶III消化應該消除的)(bal進行處理， 從而排除未反應的質粒的影響，通過用所得的DNA試樣轉化大腸桿菌DH5 α，得到缺失突變、體的系列。采集多個轉化體菌落進行培養，用限制酶HindIII和EcoR I雙重消化已提取的 質粒。考慮到1通徑的序列的大小(800bp )，以適當的間隔選擇缺失突變體，分別進行測 序。連接各序列結果，確定了 2540bp的B片段的核苷酸序列。已確定的Tol5-B、Tol5_M、 iTolS-S 的序列分別見 SEQ ID NO :9 SEQ ID NO :11。其中，Tol5_M 片段作為與 ^ο δ-Νο. 6 的序列100%—致的重復區，含有53!3bp的核苷酸序列。但是，作為相同的HindIII片段的 Tol5-B.-M.-S的各片段彼此不含有重復區，僅憑推定-M片段與Tol5-No. 6接續，還不能明 確其他兩個片段的位置關系。這些片段彼此含有幾乎相同的核苷酸序列區，158bp的探針區 也位于此。即，推定這些片段也是形成重復序列的巨大片段的一部分。通過Tol5-M片段的 重復，ORF與5358bp延續，由此編碼的蛋白的氨基酸序列也含有1785個殘基。但是，ORF尚 未終結，其在3’末端中斷。因此，與Tol5-M片段連接的下游域的核苷酸序列也必須進一步 得到明確。顯示出最高同源性的仍然是伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetem comitans)的EmaA，但在氨基酸水平只顯示出25%的同源性，尚未達到膜錨定區的編碼區， 所以依然不能判定其是否是屬于同家族的蛋白。
在此，對1Tol 5的DNA片段、如Tol5_CC和Tol5_C2進行了重新測序，該Tol 5的 DNA片段最初是通過DNA雜交嘗試克隆與Το15-51Λ接續的下游域而得到的片段，但所得片 段無法與Το15-51Λ連接。由于想定都含有重復序列，所以分別制作缺失突變體。用3’突 出的McI和5’突出的^CbaI處理質粒后，按照與上述相同的程序制作缺失突變體的系列， 進行測序并連接起來，確定了 Tol5-CC和Tol5-C2的核苷酸序列。所得的Tol5-C2、Tol5-CC 的序列見 SEQ ID N0:12 禾口 SEQ IDNO :13。
通過重復分析Tol5_B、M、S片段和Tol5_CC、C2片段的序列，確定了位置關系。只 將序列100%—致的情形作為重復序列。利用158bp探針進行DNA雜交而檢測到的信號 有3個，但根據重復分析和Tol5-C2的分析結果，判明實際上有4個片段。由于第4個片 段與Tol5-S在大小和序列方面幾乎相同，所以其與約600bp的信號重復存在。將該區作 為 iTolS-S'。整理上述片段時，發現以！"olS-MJolS-S^TolS-SJolS-CZJolS-BJolS-CC 片段的順序重復排列。其結果，ORF與10798bp接續，由此編碼的蛋白的氨基酸序列也含有 3598個殘基。但ORF尚未終結，其在3’末端中斷。因此，還必須進一步克隆與Tol5_CC連 接的下游域。顯示出最高的同源性的是Burldiolderia phymatum的TAA，但其在氨基酸水平 只顯示出25 %的同源性。雖然含有一部分膜錨定區的序列，但并不含有全部序列，也不可能 預測該部分的高級結構，所以即使在此時也無法定論其屬于TAA家族。另外，還明確其大小 也遠遠大于已經報道的TAA中最大的漢氏巴爾通氏體(Bartonellahenselae)的BadA(3036 個氨基酸)。
根據以前的測序結果，Tol5_CC的C末端區沒有確認到重復序列。因此，在C末端 區制作507bp的探針，以通過限制酶HindIII處理的Tol 5株的DNA為模板進行DNA雜交。 其結果，在51Λ的位置檢測到信號，將該片段作為Tol5-C51A。從瓊脂糖凝膠中切出該DNA并 進行提取(DEAE紙)，將其與用HindIII消化的pUC118載體連接，進行轉化(電穿孔；藍白 菌落篩選法)。采集白菌落，用LB/Amp液體培養基進行培養。從液培養基中的菌體中提取 質粒DNA，用限制酶HindIII進行處理，確認插入。推測Tol5-C51A內沒有重復結構，通過引 物步移法確定序列。所得的！"015-05 的序列見SEQ ID N0:14。Tol5_C51ib與Tol5_CC的 序列重復，判明其是與Tol5_CC連接的下游域。之后通過連接所述片段，大到10，893bp(SEQID NO 1)的巨大ORF完成，明確了其是包含由其編碼的3，630個氨基酸(SEQ ID NO 2)的 巨大蛋白。其是通過轉座子的插入而被破壞的、與黏附有關的基因的本體。之前顯示的序 列片段的位置關系見圖1。如此操作，確定了包含編碼與粘著有關的蛋白的巨大ORF的Tol 5株的15011 bp基因片段的核苷酸序列。
1-3黏附相關基因的序列
連接對各種克隆株進行測序的結果得到的序列片段的操作使用GENEITX來進行。 為了判明是具有多個復雜的重復結構的基因，連接序列和序列時只將序列100% —致的情 形視為重復部分。本實施例中的克隆和測序的結果得到的全核苷酸序列見圖2和SEQ ID NO :15ο
1-4牛物信息學解析
必須檢索在核苷酸序列中是哪個區編碼蛋白。使用ORF finder和GeneMark預測 編碼蛋白的區。其結果，推測在取得的基因中存在4個0RF。插入有轉座子的ORF是上述巨 大的0RF，可以說該ORF所編碼的蛋白是黏附因子。另外，由于5’末端和3’末端的ORF未 確認到終止密碼子，所以認為其在中途中斷。編碼蛋白時，在起始密碼子的上游存在核糖體 結合位點和啟動子位點。由于這些序列往往被保留，所以檢索黏附相關基因的巨大ORF中 啟動子位點的存在。其結果，確認到啟動子位點的存在。以下顯示該區。由此預測起始密 碼子并不在第925位，第949位的密碼子才是正確的密碼子。
-35 區-10 區
—TATCTCATTTTTTTGATTGCTTTAATTGTATGTAAATTGTTAAATAAAAAAAATTGTACATTTTATA TGCATTGCTA
AAGCAGAACCTACTGCCCAAAATGCATCTCCTAAGGAAAAGCGATATGAATAAAATCTACAAAGTGA—
925SD序列949起始密碼子
使用NCBI-BLAST檢索各ORF的同源性。其結果，黏附關聯的巨大ORF所編碼的巨 大蛋白整體不存在顯示出同源性的蛋白。但是，部分含有與屬于TAA家族的蛋白顯示出同 源性的區。
屬于TAA家族的蛋白具有信號肽、頭域、頸域、莖部區域、膜錨定區這樣的結構域。 于是，使用ClustalW分別制作各結構域的序列多重對比并比較序列。其結果見圖4。使用 I^edictProtein預測膜錨定的二次結構的結果也一并顯示。比較對象為TAA家族的成員。 其結果，在信號肽、頭域、頸域中，與伴放線放線桿菌(Aggregatibacter(Actinobacillus) actinomycetemcomitans)的EmaA的各結構域的同源性最高，分別顯示出；34%、44%、52% 的同源性。另外，在TAA家族中，與研究最多的、也可稱作是該蛋白家族的原型的小腸結腸 炎耶爾森菌(Yersina enterocolitica)的YadA分別顯示出11 %、23 %、40 %的同源性。 至于膜錨定，其與睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)的自轉運黏附素顯示出48%的同 源性、與^dA顯示出25%的同源性。另一方面，有關包含2591個氨基酸的莖部區域，通過 BLAST分析顯示其中一部分與TAA家族成員顯示出同源性，但其同源性低。例如顯示出最 高的同源性的是琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)的^dA樣蛋白，但2591 個氨基酸中的800個氨基酸的部分與該蛋白只不過顯示出33%的同源性。以上，在各結構 域中，作為具有同源性的蛋白，TAA家族的蛋白通過BLAST分析而顯示出來，但它們的同源 性水平并不高。但是，TAA家族最具特征的是膜錨定區的立體結構。TAA為同源三聚體，各多肽鏈具有1個α螺旋和4個β鏈，三根多肽鏈集合起來具有12根β鏈，在革蘭氏陰 性細菌的外膜中形成β桶狀結構，成為蛋白分泌用的隧道。于是，由Tol 5的黏附關聯蛋 白的膜錨定對應區的氨基酸序列預測二次結構時，推定具有1個α螺旋和4個β鏈。綜 合考慮上述情況和各結構域的排列等，推定Tol 5株的黏附蛋白是屬于TAA家族的新型蛋 白，將其命名為意味著不動桿菌屬(AcinetcAacter)細菌的粘附素的AadA。AadA基因的核 苷酸序列見SEQID NO =UAadA的氨基酸序列見圖3和SEQ ID NO :2。AadA由10，893bp的 基因編碼的3，630個氨基酸構成。AadA遠遠大于已經報道的TAA家族的蛋白，多個長的重 復結構復雜配置的莖部區域與其他蛋白的同源性低，而且頭域和頸域不僅存在于氨基末端 側、還存在于靠近膜錨定區所具有的羧基末端等，與已經報道的成員相比是特異性的TAA。 關于該特異性是否帶來hi 5株的高黏附性或非特異黏附能，目前還不清楚。但是，迄今為 止報道的TAA全部都是在病原性細菌感染時用于特異性黏附在宿主的細胞或細胞外基質 上的TAA，顯示出高粘著力的TAA等還未見報道。
orf的同源性檢索結果，在aada基因的鄰近下游，發現了與其他不動桿菌屬 (acinetobacter)細菌等所具有的外膜蛋白ompa顯示出同源性的蛋白的0rf。將其命名 為tol5-0mpa。tol5_0mpa的核苷酸序列見seq id no :3、氨基酸序列見seq id no :4。 tol5-0mpa包含由7%bp的基因編碼的264個氨基酸。使用clustalw制作序列多重對比， 并和與tol5-0mpa的序列顯示出同源性的外膜蛋白的序列進行比較。其結果見圖5。與大 腸桿菌e. coli的ompa比較時，在c末端區同源性高、但在n末端區同源性低。另一方面， 與不動桿菌屬(acinetcaacter)細菌所具有的外膜蛋白整體的同源性都高。但它們的功能 未見報道。但是，由于與aada的orf接近，所以aada和tol5-ompa很有可能位于同一操縱 子上。此外，由于是外膜蛋白，所以tol5-ompa有可能也參與黏附或粘著性的附器生產。
存在于已確定核苷酸序列的Tol 5株的15011bp基因片段的5’末端的ORF與不 動桿菌屬(AcinetcAacter sp. )ADP1等所具有的甲硫氨酰tRNA轉甲酰基酶顯示出高同源 性。另外，存在于3’末端的ORF與不動桿菌屬(AcinetcAacter Sp.)ADPl等所具有的二羥 基酸脫水酶顯示出高同源性。由于每一種蛋白都未見具有與黏附有關的功能的報道，所以 推定不動桿菌屬(Acinetobacter sp.) !"ο δ也與黏附無關。
1-5全長AadA基因的克隆
為了確認上述測序是正確的，通過PCR擴增含有推定啟動子位點的aadA全長，確 認其長度。所用引物Tol5-TKD-F和Tol5-TKD-R的區如下所示。
引物 jtois-tkd-f
5' -AATATAGCTTAATTTCAAAAAAATTAAACCAATTGGTTTAAAAGTTAAAAAAAGTGAAATATATCT CATTTTTTTGATTGCTTT
AATTGTATGTAAATTGTTAAATAAAAAAAATTGTACATTTTATATGCATTGCTAAAGCAGAACCTACTG CCCAAAATGCATCTCCTA
AGGAAAAGCGATATGAATAAAATCTACAAAGTGATTTGGAATGCGACTTTGTTGGCATGGG-3’
引物 jtois-tkd-r (補體)
5’ —GGCGGTGTAGCTGCAGCGTCTCAAGGCGATGCAAGTGTTCGTATCGGTATCAGCGGTGTGATTGA CTAATTCACTCGACAGGG
AAGATCTTCGGGTCTTCCTTTTTCTTCGAAAATTTTTTAAGAGAGAAAAAATGAAAGCATTTAACAAAA20AAATTATGTTTGGTGTAT
TCAGCGGTCTTGTGATGTCATTGAGCCATGCTGCTGAAGTCGAAAGTGCAAATACGCAAGAA—3’
PCR的條件如下。
PCR 條件
聚合酶Easy-AHigh-Fidelity PCR 克隆酶
模板DNA :1^)15基因組
引物 F :Tol5-TKD_F
引物 R :Tol5-TKD_R
退火55 64.5 °C
伸長11分鐘
PCR的結果，得到了與上述克隆和測序得到的ll，145bp(約111Λ)的序列相當的譜 帶，將其作為Το15-111Λ。接著，使用所得產物進行TA克隆。轉化通過電穿孔來進行，涂布 在LB/Km瓊脂培養基上。所形成的菌落在LB/Km液體培養基中培養，培養后提取質粒DNA。 為了確認插入，用限制酶EcoR I處理DNA。進一步通過PCR來確認。條件如下所示。
PCR 條件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :pCR-XL-T0P0: :Tol5-llkb 質粒
引物 F:pUC118F
引物 R:pUC118R
退火56 68 °C
伸長11分鐘
限制酶處理的結果，可以清楚地確認到載體和AadA的理想譜帶。另外，由PCR的 結果還可以確認具有AadA的大小的譜帶。并且，對質粒DNA進行測序的結果，插入片段的 兩端的序列與之前確定的核苷酸序列完全一致。因此，在確認上述測序精度的同時，成功地 克隆了約111Λ的含有推定啟動子序列的aadA基因。
進一步嘗試著克隆包括含有推定啟動子的aadA和Tol5-ompA的約12，505bp (約 13kb)的基因。通過PCR擴增片段。條件如下。
PCR 條件
聚合酶Easy-AHigh-Fidelity PCR 克隆酶
模板DNA :1^)15基因組
引物 F :Tol5-TKD_F
引物 R To 15-ad-op-R3
退火50 60
伸長14分鐘
所用引物Tol5-ad_op-R3的區如下所示。
5 ’ —TATGATGTGTACATATTTCGACTGATTTATTGCTATATCAGTTTTATTTAGCCAGAGTGAATCTG ATTCATTTCAA
GCTCAAACAATGTNGGAAATACAAATGCCNGACTATCGTTCAAAAACATCGACACATGGAAGAAATATG GCTGGTGCACG
TGGCTTATGGCGTGCAAC-3，
將所得的約131Λ的片段作為Το15-131Λ，使用其進行TA克隆。轉化通過電穿孔來 進行，涂布在LB/Km瓊脂培養基上。在LB/Km液體培養基中培養菌落，培養后提取質粒DNA。 為了確認插入，用限制酶EcoR I處理DNA。進一步通過PCR來確認。條件如下所示。
PCR 條件
聚合酶BlendTaq
模板DNA :pCR-XL-T0P0: :Tol5-13kb 質粒
引物 F:pUC118F
引物 R:pUC118R
退火50 60 °C
伸長14分鐘
由限制酶處理和PCR的結果，確認到具有理論長度的插入譜帶。對該質粒DNA進行 測序的結果，插入片段的兩端的序列與已知序列完全一致。因此，成功地克隆了包括含有推 定啟動子的aadA和Tol5_ompA的基因、即含有11，858bp的aadA-ompA操縱子(SEQ IDNO 5)的約131Λ的基因。在SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列中，1 106位是啟動子/核糖體 結合位點(SEQ ID NO :29)，107 10999 位是 aadA 基因，11064 11858 位是 ^οΙδ-οπιρΑ 基 因。
t施例2插入有不動桿菌屬(Acinetobacter SD. ) Tol5株的黏附相關某因的大腸 桿菌的件狀評價
比較通過插入有aadA基因和aadA-ompA操縱子的載體轉化的大腸桿菌(E. coli) DH5 α (分別命名為 DH5 α :aadA 和 DH5 α aadA-ompA)、以及作為對照的 E. coli DH5 α 野生株(WT)的性狀。通過插入有aadA-ompA操縱子的載體轉化的Ε. coli DH5 α作為 "DH5 α -XLT0P0 :aadA_ompA”，以接收號 NITE ABP_490(接收日 2008 年(平成 20 年)2 月 19日)被獨立行政法人制品評價技術基礎機構生物技術本部特許微生物寄托中心(日本國 千葉縣木更津市Af 鎌足2-5-8)接收。
2-1利用光學顯微鏡觀察形態
為了觀察通過插入aadA基因和aadA-ompA操縱子而引起的形態變化，對 DH5 α :aadA、DH5 α aadA-ompA,DH5 α WT這3種株進行革蘭氏染色，并在光學顯微鏡下觀 察。結果見圖6。
在插入有aadA-ompA操縱子的株DH5 α aadA-ompA中，除了觀察到菌體外，還可 以觀察到連接菌體間的線狀結構物。認為這種看起來象EPS(菌體外聚合物)的物質與黏 附力的添加有關。在插入有aadA的株DH5 α aadA中，觀察到菌體細長、極端連結的形態。 這些株的形態均與野生株明顯不同，由此可知通過導入黏附相關基因，形態發生了變化。
2-2利用電子顯微鏡觀察形態
為了更仔細地觀察通過導入基因而引起的形態變化，對DH5 α :aadA, DH5 α aadA-ompA、DH5 α WT這3種株，使用掃描型電子顯微鏡FE-SEM和透過型電子顯微 鏡TEM來觀察形態。FE-SEM的觀察結果見圖7 9。
在DH5ci :aadA中，觀察到有菌體黏附的聚氨酯載體表面和沒有菌體黏附的聚氨 酯載體表面明顯區分開來。即，觀察到形成了凝集體這樣的形態，在該凝集體單位內發生黏附。觀察到在凝集體內產生大量的EPS樣結構物，在多層中菌體彼此堆積、黏附。另外，在 DH5ci ::aadA的菌體中觀察到較多的形狀變得細長的物質。這與光學顯微鏡觀察的結果所 得到的圖像一致。若放大來看，則在細長的形狀中可以確認到部分連接的形狀(節目O J ^ ^ ^ )，觀察到菌體極端連結的形態。另外，從變得細長的菌體中也觀察到附器這樣的 結構物(圖7)。
在DH5 α aadA-ompA中，觀察到非常多的菌體黏附在聚氨酯載體上的情況。這種 情況看起來象是菌體一個一個地黏附在載體上，在載體表面均勻地形成單層膜。另外，在 DH5a :aadA-ompA中也觀察到產生EPS樣結構物的情況。這與光學顯微鏡下觀察到的結果 一致。并且，在DH5 α :aadA-ompA中觀察到許多連接菌體和載體的附器樣的物質圖8)。
與兩個重組株相比，E. coli DH5 α WT中幾乎沒有黏附在聚氨酯載體上的菌體，說 是“黏附”，但看起來更象是“偶然搭載”。另外，生產附器這樣的結構物的菌體少(圖9)。
這樣，通過在Ε. coli DH5a 中插入不動桿菌屬(Acinetobacter sp. )Tol5 的aadA 基因和aadA-ompA操縱子，成功地使其黏附形態發生了變化。
并且，在DH5 α aadA-ompA禾Π DH5 α :aadA之間也觀察到了不同。在 DH5a aadA-ompA中，各個菌體細胞零散地黏附在載體上，形成均勻的層，但菌體彼此間并 沒有凝集形成多層。相對于此，在DH5ci ::aadA中，菌體細胞形成巨大的凝集體，黏附在載 體上形成多層，但沒有觀察到各個細胞零散地黏附在載體上的情況。
2-3黏附試驗和凝集試驗
為了確認由于插入aadA和aadA-ompA操縱子而引起的黏附性變化，通過結晶紫染 色進行黏附試驗(CV黏附試驗)。黏附試驗通過以下試驗方法來評價。
<黏附試驗>
1.將菌體培養液以3，400rpm的轉速在室溫下離心10分鐘。
2.通過傾析除去培養基，加入適量的MATS實驗用BS培養基。
3.按照OUTPUT = 5、TIME = 20秒進行超聲波處理(UD-200 ；Τ0ΜΥ)，使菌體懸浮， 之后進行調整使OD66tl達到約0. 2。
4.在48孔微量培養板(IWAKI)的各孔中分別添加Iml懸浮液，在37°C下培養2 小時。
5.吸取孔中的所有懸浮液。此時，注意Chip的頂端不要擦到板。
6.用Iml的MATS實驗用BS培養基清洗孔。之后將板風干。
7.向孔中加入結晶紫，在室溫下培養15分鐘。
8.吸取所有的結晶紫，用Iml的MATS實驗用BS培養基清洗孔2次。之后將 板風干。
9.加入Iml的MATS實驗用BS培養基，按照OUTPUT = 4、TIME = 20秒進行超聲 波處理，使染色菌體分散在BS培養基中。
10.測定 A590。
用M9培養基培養的菌體的黏附試驗結果如下所示。
權利要求
1.賦予或增強靶微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法，該方法包括將編碼自轉運黏附素的DNA導入該靶微生物中，所述自轉運黏附素來自具有非特異黏 附性的微生物。
2.權利要求1所述的方法，其中，具有非特異黏附性的微生物為不動桿菌屬 (Acinetobacter)細菌。
3.權利要求1或2所述的方法，其中，編碼自轉運黏附素的DNA為以下(a)、(b)或(c) 的 DNA (a)包含SEQID NO 1所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、且編 碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；(c)包含SEQID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且編碼具有賦予或增強微生物非特 異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
4.權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，靶微生物為埃希氏菌屬Escherichia) 細菌。
5.權利要求4所述的方法，其中，埃希氏菌屬Escherichia)細菌為大腸桿菌。
6.權利要求1 5中任一項所述的方法，其中，將編碼自轉運黏附素的DNA和以下(a) 或(b)的DNA同時導入(a)包含SEQID NO 3所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含與SEQID NO :3所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列的DNA。
7.權利要求6所述的方法，其中，將以下(a)或(b)的DNA導入靶微生物中(a)包含SEQID NO 5所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含與SEQID NO :5所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、且具 有賦予或增強宿主微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的DNA。
8.賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性的微生物，該微生物是通過權利要求1 7 中任一項所述的方法得到的。
9.以下(a)、(b)或(c)的DNA (a)包含SEQID NO 1所示的核苷酸序列的DNA ；(b)包含與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有70%以上同源性的核苷酸序列、且編 碼具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA ；(c)包含SEQID NO :1所示的一部分核苷酸序列、且編碼具有賦予或增強微生物非特 異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白的DNA。
10.賦予或增強非特異黏附性和/或凝集性的微生物，該微生物中導入有權利要求9所 述的DNA。
11.權利要求10所述的微生物，該微生物為埃希氏菌屬Escherichia)細菌。
12.權利要求11所述的微生物，該微生物為大腸桿菌。
13.以下(a)、(b)或(c)的蛋白(a)包含SEQID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白；(b)包含SEQID NO :2所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸被缺失、取代、插入或 添加而得到的氨基酸序列、且具有賦予或增強微生物非特異黏附性和/或凝集性的活性的蛋白；(c)包含SEQ ID NO :2所示的一部分氨基酸序列、且具有賦予或增強微生物非特異黏 附性和/或凝集性的活性的蛋白。
14.微生物的培養方法，該方法包括通過使權利要求8、10、11或12所述的微生物黏附在載體上和/或凝集來回收該微生物。
全文摘要
本發明提供賦予或增強不具有或具有弱的非特異黏附性或凝集性的微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法。本發明涉及賦予或增強靶微生物非特異黏附性和/或凝集性的方法，該方法包括將編碼自轉運黏附素的DNA導入該靶微生物中，所述自轉運黏附素來自具有非特異黏附性的微生物。
文檔編號C12N5/10GK102037126SQ20088012888
公開日2011年4月27日 申請日期2008年2月22日 優先權日2008年2月22日
發明者堀克敏 申請人:國立大學法人名古屋工業大學