專利名稱：西方伊薩酵母、熱帶假絲酵母配合使用的脫毒發酵方法，及產品制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及東方伊薩酵母、熱帶假絲酵母配合使用的先脫毒 后發酵方法、脫毒發酵同步方法，以及用該方法制備木糖醇、乙醇、阿拉伯糖的工藝。
背景技術：
半纖維素是植物細胞壁中除纖維素之外的聚糖類，含量隨不同植物而有所差別， 大致占植物體重量的20-35%，是地球上除纖維素之外最豐富的多糖。纖維素是完全由葡萄糖單元聚合成的均一性聚糖，而半纖維素則主要是由木糖以 β-(1-4)糖苷鍵構成主鏈，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支鏈結構的非均一性聚糖。半纖維 素的木聚糖主鏈一般含有50-150個木糖單位，無結晶結構，結合在纖維素微纖維的表面。半纖維素比纖維素容易水解得多，用稀酸在100_13(TC條件下，就很容易將半纖維 素，水解生成以五碳糖為主要成分的半纖維素水解物。發酵半纖維素水解物生產市場容量 大的木糖醇、乙醇等各類化工產品，是能夠大規模利用半纖維素資源的有效途徑。雖然用稀酸將半纖維素水解生成以單糖為主要成分的水解物的過程并不困難，但 是，稀酸水解過程會伴隨產生一系列微生物代謝抑制物，要改善半纖維水解物的發酵性能， 必須除去其中的微生物代謝抑制物，即脫毒過程是必不可少的。目前在半纖維素水解物中已鑒定的毒物成分已經有幾十種，其中代表性毒物包括 三大類，即糠醛類化合物，如糠醛，5-羥甲基糠醛；脂肪酸類化合物，如甲酸，乙酸，丙酸； 木質素降解生成的一系列含有苯環的化合物，如愈創木酚，苯甲醛，阿魏酸等。已經報道真空蒸發，溶劑抽提，活性炭吸附，大孔樹脂吸附，離子交換樹脂處理，都 可以脫去某些毒物，改善水解物的發酵性能。然而，一種物理或化學方法只能除去某一類有 毒物質，通常需要聯合采用多種理化措施處理，半纖維水解物才能達到比較好的脫毒效果。 但是，脫毒是一個耗費成本的過程，同時使用多種理化措施對半纖維素水解物進行脫毒處 理，必須大幅度提高產物發酵的成本。事實上，自然界的一些微生物對半纖維素水解物中的某些毒物具有降解活性。例 如，例如降解木質素及由木質素降解生成的一系列酚類化合物的白腐菌(林海陸鋼張 慶娜，降解造紙廢水木質素菌種的篩選鑒定及應用，北京科技大學學報。2007，29(6) 569-573;陶楊廖俊和羅學剛，生物制漿技術最新應用研究進展。纖維素科學與技術。 2007，15(1) :70-74，降解糠醛，5-羥甲基糠醛細菌，酵母(代書玲，張魯嘉，糠醛及其衍生 物微生物降解(轉化)研究進展。氨基酸和生物資源2007，29 (4) :41-45;劉愛平許學 書樊行雪，利用酵母生物轉化植物纖維為乙醇的研究進展。生物技術通訊，2004，15(2) 193-196)，降解短鏈脂肪酸的子囊菌(何剛強堵國成劉立明，嗜熱子囊菌利用短鏈有機 酸生產角質酶。生物工程學報，2008，24 (5) 821-828)近年有人開始嘗試以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶與過氧 化物酶聯合處理木材酸水解物，能除去了大部分的單環酚性物(monoaromatic phenoliccopounds) 0處理后的水解物用于乙醇發酵，結果葡萄糖消耗速率與乙醇生成速率提高 了近 5 倍(Jonsson J L, Palmqvist E, Nilvebrant N 0. , Detoxification of wood hydrolysates with laccase andperoxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl. Microbiol Biotechnol. 1998，(49) :691_697))。但復雜的毒物成分需要 復雜的酶系的聯合降解，這無疑大大增加了脫毒的成本。Lopez等人以微生物Conichaeta ligniaria NRRL 30616發酵處理木質纖維稀酸 水解物，不僅去除糠醛、5-羥甲基糠醛的效果顯著，同時也明顯減少了水解物中的酚類物 質。經過這一菌株處理的水解物再用產乙醇酵母發酵，80h產生1. 66% 0乙醇，而未處理的 去口沒有乙酉享產生(Lopez J Μ,Nichols N N,Dien B Set al. Isolation of microorganisms for biological detoxification oflignocellulosec hydrolysates. Appl Microbiol Biotechnol. 2004,64(1) :125_131)。上述研究表明，利用微生物降解木質纖維水解物中復雜有毒物質是可能實現的。 尤其是，如果能夠獲得一種同時具備降解半纖維水解物中的三大代表性毒物的代謝系統， 即可以同時降解糠醛、脂肪酸及含有苯環結構化合物的微生物，并且這種微生物又不能利 用木糖的話，那么直接利用這種微生物發酵半纖維水解物進行脫毒物質處理，就能有效克 服現有理化脫毒方法工藝繁瑣、成本高的缺點，并具有環境友好的優勢。此外，半纖維素容易水解，用稀酸或酶處理植物纖維材料，很容易生成以木糖、阿 拉伯糖為主要糖類，還包括其它雜糖的水解物。只有將半纖維素水解物中的木糖、阿拉伯糖 分別純化出來之后，它們才能實現各自的商業應用價值。純凈的木糖主要用途是制備木糖醇。木糖醇由木糖還原生成，具有甜度與蔗糖相 當，無致齲性，在體內代謝不需胰島素參與，也不會造成血糖的急劇變化等重要特性，在防 齲齒食品，糖尿病人食品具有重要的應用價值。純凈的阿拉伯糖不僅風味與蔗糖極為相近，它的許多特殊的功能也引起了人們的 廣泛關注。例如阿拉伯糖能夠抑制蔗糖酶的活性，從而抑制人體對蔗糖的吸收，可用于控制 因食用蔗糖引起的血糖升高；阿拉伯糖具有抑制脂肪合成酶的活性，可用于預防肥胖。此 外，阿拉伯糖還可用作合成核苷類藥物的中間體，在醫藥工業中有應用范圍。然而，無論木糖或阿拉伯糖，只有達到很高的純度之后才可能體現出較高的商業 價值。木糖、阿拉伯糖的分離純化，就成為其制造過程中極為重要的環節。美國專利6，086, 681，(從溶液中回收木糖的方法，Method for recovery ofxylose from solutions, United States Patent (2000) 6，086，681)提供了一種以結晶 工藝從植物纖維的稀硫酸水解物中分離木糖的方法，該法將純度為30-60% (對總糖)的木 糖溶液濃縮到木糖過飽和，然后冷卻析出晶體木糖。不過這一發明沒有涉及如何分離殘余 在母液中的木糖，也沒有涉及如何分離已知存在于水解物中的阿拉伯糖。美國專利6，872，316(木糖的回收，Recovery of xylose, United StatesPatent (2005) 6, 872, 316)提供了一種納濾(nanof iltration)工藝提高植物纖維水 解液中的木糖純度的方法。因為木糖能夠較容易地透過納濾膜，其它雜質如低聚糖、二價 鹽，己糖，色素等則較多地被截留濾膜內側。因而植物纖維水解液的納濾透過液的木糖純 度，可比原始水解液提高1倍以上，其后續的離子交換，脫色等工藝負擔也隨之減輕。在這 一發明中，阿拉伯糖與木糖一樣容易透過納濾膜，因此它不能實現木糖與阿拉伯糖之間的分離。另外，納濾對于單糖的分離效果也是十分有限的。陽離子對單糖(或糖醇)有吸附作用，利用攜帶有陽離子材料作色譜填料分離不 同的單糖或糖醇，是人們從多種單糖的混合溶液中分離目標單糖(或糖醇)的手段之一。美國專利6，506，89用甜菜根制備阿拉伯糖，Method of pr印aringl-arabinose from sugar beet pulp. United States Patent (2003)，6，506，897提供的一種制備阿拉伯 糖的方法，包括了下幾個步驟a)用強堿溶液提取已經榨過糖的甜菜根。b)用強酸水解前 一步驟所獲得的粗阿拉伯聚糖。c)酸水解液中和，過濾。d)用單價陽子樹脂(選用鈉，或 鉀型)作為分離樹脂，色譜分離出阿拉伯糖組分。e)經陽、陰離子交換樹脂及吸附樹脂進 一步純化所獲得的阿拉伯糖溶液。f)結晶回收晶體阿拉伯糖，純度98%以上。這一專利先 用堿提取物料，再用酸水解的工藝顯然比較繁瑣，另外，專利中有介紹水解液中是否存在木 糖，也沒有介紹如何分離木糖的問題。中國專利01816511. 7(專利名稱弱酸陽離子交換樹脂色譜分離法從溶液中回收 單糖；國際申請PCT/FI2001/000848 2001. 9. 28 ；專利權人芬蘭，達尼斯科甜味劑股份有 限公司；發明人H海基萊，J云帕伊寧等)介紹了利用結合了 Na+、Mg2+、H+或Ca2+型的弱酸 性陽離子交換樹脂用于色譜分離，使用包括至少一個步驟的色譜分離的多步驟工藝，從含 鼠李糖、阿糖、木糖和其混合物的單糖的溶液中回收選自鼠李糖、阿拉伯糖(阿戊糖)、木糖 和其混合物的單糖的方法。這一專利的正文及附圖描述均顯示，它所提供的色譜分離方法 中，其木糖組分與阿拉伯糖的組分并未完全分離。此外，它也未述及選擇性轉化糖為糖醇， 以及如何進行糖醇與糖之間的分離問題。除了將陽離子交換樹脂上作為糖的色譜分離填料之外，一些結合了陽離子的無機 材料也被用于糖類的分離純化。美國專利4，664，718從戊糖/己糖混合物中分離阿拉伯糖的方法；Chang ； Chin-Hsiung, Process for separating arabinose from a pentose/hexose mixture()。 United States Patent (1987)，4，664，718介紹了以鈣Y-型沸石，或鈣X-型沸石作吸附 劑，從戊糖/己糖混合物中分離阿拉伯糖的方法，但這一專利沒有涉及分離回收木糖，或木糖醇。美國專利4，857，從其它醛糖混合物中分離阿拉伯糖的工藝； Kulprathipanja,Process for separating arabinose from a mixture of otheraldoses, United States Patent (1989)，4，857，642介紹用銨X-型沸石作吸附劑，從其它醛糖混合 物中分離阿拉伯糖的方法。美國專利4，880，919從醛糖混合物中分離阿拉伯糖的工藝； Kulprathipanja,Process for separatingarabinose from a mixture of aldoses,United States Patent (1989), 4, 880，919介紹用鈣-銨型混合的陽離子交換樹脂作吸附劑分離阿 拉伯糖。這兩個專利也均未涉如何回收木糖或木糖醇的問題。以水為洗脫劑，單糖、糖醇在陽離子樹脂(或沸石)上的色譜分離效果，取決于它 們分子結構的親/疏水性能。具有相同碳原子數的同一類糖(例如，屬于五碳醛糖的木糖 與阿拉伯糖)，或具有相同碳原子數的糖醇(如五碳的木糖醇與阿拉伯糖醇)之間，彼此互 為同分異構體，而其化學性質十分相近，同一種陽離子樹脂對它們之間吸附能力的差異也 就很小。所以，無論用陽離子樹脂(包括Na+、Mg2+、H+或Ca2+)直接分離半纖維素水解物中 的五碳糖(木糖與阿拉伯糖)，或者是分離水解物經化學氫化后所生成的醇液(糖生成相應
6的醇)，都存在設備分離效率不高，產品的收率與純度偏低等難于解決的困難。為了提高分離效率，許多學者采用了生物發酵輔助純化的手段，即利用只能同化 特定單糖的微生物選擇性除去不需要的糖類，使水解液中目標單糖的純度相對提高，以提 高后續分離工序的效率。Nyun 等人Nyun Ho Park, Shigeki Yoshida, Akira Takakashi, et al. Anew method for the preparation of crystalline L-arabinose fromarabinoxylan by enzymatic hydrolysis and selective fermentation withyeast. Biotechnology Letters 2001，23 :411_416用來源于繩狀青霉(Penicillium funiculosum)培養物的粗 酶液水解富含阿拉伯木聚糖仏1^1^110巧1皿，含28.1%阿拉伯糖，32.8%木糖)的玉米皮， 結果有21. 3% (w/w)阿拉伯糖，18. 7% (w/w)木糖被水解出來。此外，水解物中還含有一 些其它單糖及低聚糖。水解物用能夠代謝木糖，但不能代謝阿拉伯糖的土星擬威爾遜酵母 (ffilliopsis saturnus)通氣培養96小時，結果95% %的阿拉伯糖在發酵液中保存下來， 而木糖僅殘留量只相當于原始阿拉伯木聚糖重量的0. 002%。這種發酵液經活性碳脫色，離 子效換樹脂脫鹽，濃縮后結晶，所獲得的晶體中未檢測出木糖。用生物發酵選擇性地除去木 糖的方法，雖然可以解決阿拉伯糖與木糖難于分離的困難，但卻浪費了寶貴的木糖資源。李道義等人李道義，閆巧娟，江正強等(中國農業大學)，酵母菌發酵玉米皮酸 水解液制備結晶L-阿拉伯糖。食品科學，2007，28 (4) 125-127，用自己篩選的酵母菌株 WYS15-3發酵玉米皮的稀酸水解物7天，結果選擇性地除去了水解液中的葡萄糖與木糖。發 酵液經脫色，脫離子、濃縮結晶等步驟，獲得含量為97%的阿拉伯糖，得率為玉米皮干基的 9. 6%。按這一實驗所用的菌株與方法純化玉米皮水解液制備阿拉伯糖，不僅沒有利用木糖 資源，而且生產過程太長(7天)。此外，由于所用酵母菌株不能同化水解液中的半乳糖，存 在于阿拉伯糖過飽和溶液中的半乳糖，直接影響了阿拉伯糖的結晶收率。中國專利200510040433. 0專利名稱一種從木糖母液或木糖水解液提取木糖 和木糖醇的方法；發明人彭奇均提供了一種從木糖水解液或木糖母液中分離制備高純度 木糖或木糖醇的技術。具體方法是以木糖水解液或木糖母液為原料，以釀酒酵母發酵除去 其中的葡萄糖，以合成的專用鈣型陽離子樹脂作為色譜分離樹脂，以水為洗脫劑，通過模擬 移動床使木糖與阿拉伯糖等雜質分離，得到富含木糖的組分。或者將富含木糖，阿拉伯糖的 糖液直接氫化，使它們生成為相應的醇之后，再通過模擬移動床色譜分離，獲得不同的糖醇 組分。但是，在本發明的舉例中，分離水解液(糖液)的過程未能將木糖與其它雜糖(主要 是阿拉伯糖)徹底分離，將水解液中的糖加氫還原為糖醇之后再進行的色譜分離，也未能 將不同的糖醇(主要是木糖醇與阿拉伯糖醇)徹底分離。此外，這一專利雖然已經使用了 微生物除葡萄糖的技術，也介紹了糖液氫化后木糖醇的分離，但并沒有涉及如何選擇性地 將木糖轉化為木糖醇，然后再將木糖醇與其它的糖分離的問題。由于以水為洗脫劑的離子色譜法在分離糖類方面的固有缺陷，人們也嘗試用其它 的方法解決這一問題。美國專利2006010042從單糖混合物中分離與制備阿拉伯糖及木糖的工藝 Hollingsworth ；Rawle I，Process for the preparation and separation ofarabinose and xylose from a mixture of saccharides ；United States PatentAppIication, 20060100423]利用單糖與酮或醛試劑反應，生成糖乙縮醛(acetals of the
7saccharides)，根據不同的糖乙縮醛對極性、非極性有機溶劑溶解性能的差異，可以使不同 的糖乙縮醛彼此分離，最后再分別將其水解為相應的單糖。不過，大量使用有機溶劑在工業 生產中的缺點是顯而易見的。馮亞青等人介紹馮亞青，劉燕同，張曉東等，從L-阿拉伯樹膠提取L-阿拉伯糖， 精細化工，2003，20 (5) :288-290，以微晶纖維素，或硅膠為固定相，以正丁醇、乙酸乙酯、異 丙醇與水的混合物為流動相，連續進行二次色譜分離，最后可獲得含量99%的阿拉伯糖晶 體。但是，本文并沒有使來源于植物細胞壁的半纖維素作原料，它所介紹利用有機溶劑作為 流動相的色譜分離方法，在大規模工業性生產中也存在諸多的安全隱患。綜上所述可見，當前工業化生產木糖醇的化學工藝、或直接從半纖維水解物中分 離阿拉伯糖，都無法解決木糖與阿拉伯糖之間難于分離的問題。此外，由于化學還原過程的 非選擇性，以現有的化學工藝也無法直接利用半纖維素水解物同時制備出木糖醇與阿拉伯 糖。微生物也能夠催化木糖生成木糖醇。利用微生物直接發酵半纖維素水解物生產木 糖醇，由于具有節能，無需化學工藝所必不可少的木糖純化過程等優勢，已經引起人們的極 大關注。但目前發酵法生產木糖醇的效率還很低，盡管相關的研究報道甚多，但大多數仍局 限于半纖維素水解物的制備方法，木糖醇發酵工藝優化方面。從木糖發酵液制備結晶木糖 醇方面的研究甚少，也沒有人研究發酵工藝木糖醇與阿拉伯糖制備相結合的問題。本發明人蔡愛華，張厚瑞，何成新等從蔗渣半纖維素水解物發酵液中分離純化 木糖醇。食品科學。2006，27(7) :136-139曾經介紹，蔗渣半纖維素水解物發酵液經超濾 處理，超濾透過液經離子交換柱層析脫鹽之后，再經活性炭脫色，這種木糖醇液濃縮至可溶 性固形物含量為80%，即可結晶得到含量>98. 5%的木糖醇產品。本發明人在該報道中還 注意到，結晶母液的阿拉伯糖濃度超過木糖醇濃度的45.0%，木糖濃度超過木糖醇濃度的 12. 6%時，它們都容易隨木糖醇一起結晶析出。如果發酵液中的木糖或阿拉伯糖超過這一 濃度比例范圍，將難于通過結晶的方法有效純化出木糖醇。這一由發酵液制備結晶木糖醇 工藝的特點是，將發酵液凈化處理之后直接濃縮結晶，得出木糖醇晶體產品，剩下難以進一 步結晶純化，含有木糖醇，阿拉伯糖，木糖等成分的結晶母液。發明人當時顯然沒有意識到 木糖醇發酵與阿拉伯糖提取結合的問題。丁興紅等人丁興紅夏黎明影響半纖維素發酵液中分離純化木糖醇關鍵因子 的研究。中國食品學報。2006，6(6) :87-90以木糖醇溶液與半纖維素發酵液為研究對象， 考察了木糖醇初始濃度、殘糖(阿拉伯糖)、晶種和結晶溫度對木糖醇結晶動力學的影響， 并確定了木糖醇初始質量濃度為750g/L，結晶溫度為-4°C。在木糖醇溶液中添加1%。木糖 醇晶種，能縮短結晶誘導期的延續時間，提高結晶速度。木糖醇溶液中少量的阿拉伯糖能提 高木糖醇結晶速度，但當阿拉伯糖質量濃度高于120g/L時，木糖醇晶體的純度會降低。這 篇報告所述工藝路線，也是將凈化后的發酵液直接濃縮，濃縮液直接結晶制出木糖醇產品。 雖然它提到了發酵液中阿拉伯糖的存在將影響木糖醇晶體的純度，但并沒有論述木糖醇與 阿拉伯糖之間的分離問題。應國清等人應國清，王普，張峰，虞炳鈞發酵法生產木糖醇的分離純化工藝。中 國醫藥工業雜志。2002，33(3) :117—123則在含有殘余木糖的發酵液(轉化液)中加入 一定濃度的NaOH，沸水回流約2h，將殘留在發酵液中的木糖降解為相應的酸和并生成相應
8的鹽類，再用陰、陽離子交換樹脂除去鹽，最后濃縮結晶得到木糖醇晶體。這一工藝顯然不 考慮回收發酵液中的其它糖類。我們用鈣型陽離子樹脂對木糖、阿拉伯糖及木糖醇進行色譜分離的過程中發現， 木糖與阿拉伯糖的色譜峰大部分相互重疊，但是，這兩種糖與木糖醇的色譜峰卻基本不重 疊(
圖1)。顯然，木糖醇-阿拉伯糖(糖-醇)之間的色譜分離效率，要比木糖-阿拉伯糖 (糖-糖)之間的分離效率高得多。如果我們能夠選擇性地將半纖維素水解物中的木糖轉 化為木糖醇，并使阿拉伯糖不參與反應，那么就可以實現將對原料木糖-阿拉伯糖的分離， 轉變成為對產品木糖醇_阿拉伯糖的分離，木糖與阿拉伯糖之間的分離難題也就迎刃而解 了。某些酵母菌具有代謝消耗葡萄糖，轉化木糖生成木糖醇，但不能利用阿拉伯糖的 特性。原來以木糖_阿拉伯糖_葡萄糖為主要成分為半纖維素水解物，經這種微生物發酵 之后就會轉變為以木糖醇-阿拉伯糖為主要成分的發酵液。于是，用這種酵母對半纖維素 水解物進行一次發酵，不僅能達到生物轉化(木糖轉化為木糖醇)與生物純化(細胞代謝 消耗除去葡萄糖，木糖醇與阿拉伯糖的純度相對提高)的雙重效果，而且后續的產物色譜 分離的效果也將得到有效改善。此外，對發酵液的一次色譜分離過程，事實上同時純化了木 糖醇與阿拉伯糖兩個產品，從而避免了單純生產木糖醇或阿拉伯糖時對原料選擇的嚴格限 制，并提高原料的綜合利用水平，節約了生產成本。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有的半纖維素水解物理化脫毒工藝所存在的過程煩 瑣，成本高的問題。本發明的內容包括發明人自造紙廠，木糖廠，糠醛廠周圍土壤污泥樣富含培養、 分離、篩選，獲得能有效改善木質纖維水解物發酵性能的兩個分離物S_7和Lj-3。發明人 鑒定分離物S-7屬于東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)，它在2006年9月18日被保 存到中國武漢 武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO :M206098, 不能利用木糖；分離物Lj-3屬于西方伊薩酵母(Issatchenkia occidentalis)，它在2006 年9月18日被保存到中國武漢 武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為 CCTCCNO :M206097，利用木糖的能力極微弱。發明人用這種脫毒活性新菌株建立了半纖維水 解物的生物脫毒法；將脫毒活性菌株與發酵木糖生成木糖醇微生物混合接種，實現半纖維 素水解物同步脫毒發酵生產木糖醇；將脫毒活性菌株與發酵木糖生成乙醇的微生物混合接 種，實現半纖維素水解物同步脫毒發酵生產乙醇。上述兩種酵母的保藏信息參見本專利申 請所附的兩份保藏受理通知書。屬于本發明的兩個生物脫毒活性菌株S-7(CCTCC NO :M206098)和Lj_3(CCTCC NO :M206097)，其分離篩選、及分類鑒定的過程如下用蔗渣半纖維素水解物為分離培養基的基本成分，適當真空后用堿調節pH5-6。如 果制成平板，外加瓊脂20g/L作為固形劑。從紙漿廠廢水污染的環境采集的土壤、淤泥作分離樣品。250ml三角瓶裝量25ml， 接入廢水或淤泥分離樣品約lg，30°C，200rpm搖瓶富集培養72h。取有菌體生長的培養液在 同一培養基平板上劃線分離，選擇能夠快速生長的類型，轉到斜面保存。
斜面培養物轉移到半纖維稀酸水解物中并在搖瓶條件下培養24小時，離心除去 菌體，然后接入能夠同化木糖的酵母菌株進行發酵，選留那些能夠有效改善半纖維素稀酸 水解物發酵性能的脫毒活性菌株。如此經過十余個批次的樣品分離，獲得改善半纖維素水 解物發酵性能活性最強的兩個分離物，編號分別為S-7和Lj-3。高效液相色譜的檢測結果表明，S-7和Lj-3對半纖維素稀酸水解物中的代表性毒 物醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。上述方法分離得到的兩個菌株于4°C冷藏或凍干法保藏。按照《酵母菌鑒定手冊》(青島海洋大學出版社)一書提供的方法，鑒定了 S-7和 Lj-3的細胞、菌落與生理生化特征(表1，表2)。分離物S-7的生理、生化特征與《酵母菌鑒 定手冊》中所描述的東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)完全相同；分離物Lj_3的生 理、生化特征與同一書中所述的西方伊薩酵母(Issatchenkia occidentalis)完全相同。用引物5，-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3，和 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，聚合 酶鏈式反應(PCR)擴增S-7和Lj-3的26S rDNA D1/D2區域核酸序列(方法參照Kurtzman C P, Four new Candida species from geographically diverselocations. Antonie van Leeuwenhoek,2001,79 353-361) 0測定擴增產物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在 GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotide BLAST)。搜索結果 表明，S-7 的 26S rDNA D1/D2 區域的核酸序列，與 GenBank 現有 Issatchenkia orientalis 同一區域核酸序列同源性均達100% ；Lj-3與其中與Issatchenkia occidentalis同一區 域核酸序列的同源性達到100%。根據上述的細胞、菌落形態、生理生化與分子生物學特征的可以確定，S-7的分類 地位屬于東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis) ；Lj-3的分類地位屬于的西方伊薩酵 母(Issatchenkia occidentalis)。東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis) S-7在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)的保藏號為CCTCC NO :M206098，它的26S rDNA D1/D2區域的核苷酸序列在 GenBank的登記號為EF030708http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db = nucleotide & val =116834296 ；西方伊薩酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3 在 CCTCC 的保藏號為 CCTCC NO :M206097，它的26S rDNA D1/D2區域的核苷酸序列的GenBank登記號為EF030710http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db = nucleotide & val =116834298。表1分離物S-7、Lj-3的細胞與菌落形態特征
菌落形態細胞特征S-7表面干燥，邊緣輻射狀。多端出芽，細胞平均長度為10 20um之間。Lj-3有光澤，表面粘稠，邊緣整齊平滑。多端出芽，細胞平均長度為5 15um。 表2分離物S-7、Lj-3的生理生化特征(+，利用；_，不利用)
10 東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis) S-7 (CCTCC NO :M206098) 26SrDNA Dl/ D2區域的核酸序列(GenBank登記號EF030708)1taagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaaga
61gctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctgtgt
121ggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagccccgtggga
181tgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaa
241gcgggtggtaaattccatctaaggctaaatactggcgagagaccgatagcgaacaagtac
301tgtgaaggaaagatgaaaagcactttgaaaagagagtgaaacagcacgtgaaattgttga
361aagggaagggtattgcgcccgacatggggattgcgcaccgctgcctctcgtgggcggcgc
421tctgggctttccctgggccagcatcggttcttgctgcaggagaaggggttctggaacgtg
481gctcttcggagtgttatagccagggccagatgctgcgtgcggggaccgaggactgcggcc
541gtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaacacgga
西方伊薩酵母(Issatchenkia occidentalis) Lj-3 (CCTCC NO :M206097)的 26SrDNA Dl7/D2區域核酸序列(GenBmk登記號EF030710)
1tatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcg
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本發明按下述方法制備所需要的半纖維素水解物
將甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸稈粉碎至適當粒度，按固液比1 6 7加入
0.3 3% (w/w)的稀硫酸或稀鹽酸溶液，攪拌均勻，在耐酸的壓力容器內加熱至100 130°C，維持0.5 3小時。水解結束后濾除殘渣，濾液即為半纖維素水解物。用固體碳酸 鈣或氫氧化鈣將半纖維素稀酸水解液調至PH值3 8，可直接或濃縮后再進行生物脫毒。 一般地，較高酸濃度的條件可以使用較低的水解溫度，或相應縮短水解時間，較低的酸濃度 則必須提高水解溫度或延長水解時間。本發明按下述方法培養用于半纖維水解物生物脫毒，木糖醇發酵，乙醇發酵的微 生物菌種脫毒菌株種子液的培養將CCTCC NO :M206098或CCTCC NO :M206097的斜面培 養物接入液體種子培養基，裝液量為搖瓶容量的20%，在27--30°C，轉速200rmp條件下 搖床培養12 18小時，即可獲得可用于脫毒的種液。種子培養基組成為葡萄糖50g/L， MgSO4. 7H20 2g/L, K2HPO4 4g/L，KH2PO4 6g/L，酵母膏 5g/L。發酵木糖生成木糖醇的菌株種子液培養所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，它在2005年6月15日被保存到中國武漢·武漢大學中國典型培養物保 藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO :M205067，分類命名為熱帶假絲酵母1-18 Candida tropicalis 1-18,(見發明專利“熱帶假絲酵母菌株的分離及其用于木糖醇生產的方法”， 發明專利申請號200510037580. 2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分與培養條件同脫 毒菌株種子培養。發酵木糖生成乙醇的菌株種子液培養所用的菌株為保藏于中國工業微生物菌種 保藏管理中心(CICC)的嗜單寧管囊酵母(Pachysolen tannophilus) CICC 1770，培養基成 分及培養條件同發酵木糖生成木糖醇的菌種培養。本發明按下述方法進行半纖維素水解物生物脫毒半纖維素水解物總糖含量為4 20% (w/w)，其中還原性單糖占總糖含量> 90% 以上，以木糖為主成分。用堿液(氫氧化鈣，氨水等)調節至PH3-7，按10% (ν/ν)接種量 接入培養好的CCTCC NO :Μ206098或CCTCC NO :Μ206097種子液，在25 35°C，通氣條件下 發酵脫毒5 20小時，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集離心沉淀的 菌體重復用于下一批新鮮的半纖維素水解物脫毒，離心上清液可直接或者濃縮后用于木糖 醇發酵，或乙醇發酵。本發明按下述方法發酵脫毒后的半纖維素水解物生產木糖醇已經過CCTCC NO :M206098，或CCTCC NO :M206097發酵脫毒過的半纖維素水解物， 真空濃縮至木糖約150g/L，氨水調節至pH = 6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇發酵的
12半纖維素水解物培養基。木糖醇發酵用搖瓶進行，搖瓶裝量10%，按5% (ν/ν)接種量接入 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) CCTCCNO :M205067 種子液，200rmp，33°C進行發酵至 木糖消耗完。收集離心沉淀的菌體，投入到新鮮的半纖維素水解物培養基中繼續新一輪的 木糖醇發酵，離心上清液用于制備木糖醇。本發明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發酵生產木糖醇真空濃縮半纖維素水解物至木糖含量約100-150g/L，用堿(氫氧化鈣，或氨水) 調至pH3--pH7，，離心或過濾除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纖維素水解物培養基，分裝 于三角瓶；取培養好的株CCTCC NO :M206098種子液，或者CCTCC NO :M206097的種子液，并 與等體積的CCTCC NO :M205067種子液混合，然后按5% (ν/ν)和用種量接入半纖維素水解 物中，搖瓶培養至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞并用于新鮮的培養基中，繼續同步 脫毒發酵。如此不斷地循環，直至酵母細胞不能利用。對預先進行脫毒處理后獲得的半纖維素水解物后續進行木糖醇發酵和制備阿拉 伯糖的方法包括如下步驟Si.對經過CCTCC NO :Μ206098發酵脫毒的半纖維素水解物真空濃縮至木糖約 150g/L，氨水調節至ρΗ = 6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇發酵的半纖維素水解物培
養基；S2.木糖醇發酵用搖瓶進行，搖瓶裝量10%，按5% (ν/ν)接種量接入CCTCCNO M205067種子液，200rmp，33°C進行發酵至木糖消耗完；S3.收集離心沉淀的菌體，投入到新鮮的半纖維素水解物培養基中繼續新一輪的 木糖醇發酵，離心上清液制備木糖醇；S4.對木糖醇發酵液除去細胞后，經離子交換凈化，再用鈣型陽離子樹脂進行色譜 分離，獲得純凈的木糖醇分流，所述分流的木糖醇發酵液經濃縮、結晶，獲得結晶木糖醇；S5.分流木糖醇發酵液后，獲得阿拉伯糖分流發酵液，對阿拉伯糖分流發酵液用銨 型陽離子樹脂進行色譜分離，提高阿拉伯糖純度，再通過濃縮、結晶，獲得結晶阿拉伯糖。利用半纖維素水解物進行同步脫毒發酵生產木糖醇和阿拉伯糖的方法包括如下 步驟Si.真空濃縮半纖維素水解物至木糖含量約100-150g/L，用堿(氫氧化鈣，或氨 水)調至pH3--pH7，，離心或過濾除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纖維素水解物培養基；S2.取培養好的CCTCC NO :M206098種子液，并與等體積的CCTCC NO :M205067種 子液混合，然后按5% (ν/ν)和用種量接入半纖維素水解物中，搖瓶培養至木糖消耗完；S3.離心收集沉淀的酵母細胞并用于新鮮的培養基中，繼續同步脫毒發酵；如此 不斷地循環，直至酵母細胞不能利用；S4.對木糖醇發酵液除去細胞后，經離子交換凈化，再用鈣型陽離子樹脂進行色譜 分離，獲得純凈的木糖醇分流，所述分流的木糖醇發酵液經濃縮、結晶，獲得結晶木糖醇；S5.分流木糖醇發酵液后，獲得阿拉伯糖分流發酵液，對阿拉伯糖分流發酵液用銨 型陽離子樹脂進行色譜分離，提高阿拉伯糖純度，再通過濃縮、結晶，獲得結晶阿拉伯糖。本發明按下述方法利用半纖維素水解物進行同步脫毒發酵生產乙醇同步脫毒發酵生產乙醇所用的半纖維素水解物的培養基，與同步脫毒發酵生產木 糖醇的培養基相同。取培養好的株CCTCC NO :Μ206098種子液，或者CCTCCNO :M206097的種子液，與等體積的CICC 1770種子液混合，然后按5% (ν/ν)和用種量接入半纖維素水解物 培養基搖瓶中，培養至木糖消耗完。離心收集沉淀的酵母細胞循環用于發酵新鮮的培養基， 繼續同步脫毒發酵，如此不斷地循環，直至酵母細胞不能利用。蒸餾回收離心上清液中的乙本發明用高效液相色譜法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物中的代表性毒物 質，及主要酚類物質降解活性。選擇乙酸、糠醛及愈創木酚作為半纖維素水解物中不同類型抑制物的代表，將這 三種化合物一起加入到普通酵母培養基中，并接入脫毒活性菌株(CCTCCNO :Μ206097,或 CCTCC NO :Μ206098)進行發酵。利用這三種化合物均在198nm處均有較強的紫外吸收的特 點，在如下色譜條件WaterS486高效液相色譜儀，ZORBAX XDB-C18色譜柱，流動相甲醇 磷酸(0.2%，w/w) =75 25(v/v)，對比檢測這三種化合物在發酵前后的含量變化，判斷 這兩個菌株對這三種代表性有毒成分均具有降解活性(圖1)。由于酚類化合物在270nm附近均有強的紫外吸收，故以270nm為檢測波長，以高效 液相對比檢測操作1的蔗渣半纖維素水解物、操作3的經東方伊薩酵母CCTCC NO :M206098 生物脫毒，經西方伊薩酵母CCTCC NO :M206097生物脫毒的蔗渣半纖維素水解物(圖2)。并 分析這一檢測波長條件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纖維素水解物經生物脫毒處 理之后，其中的糠醛及許多有毒的酚類物質已被降解。本發明用對比生物發酵的方法檢測生物脫毒菌株對半纖維素水解物的脫毒效 果用CCTCC NO :M205067 對比發酵經 CCTCC NO :M206097,或經 CCTCCNO :M206098 脫 毒處理前后半纖維素水解物，檢測發酵產物木糖醇；或用CICC1770對比發酵經CCTCCNO M206097，或經CCTCC NO :M206098脫毒處理前后半纖維素水解物，檢測發酵產物乙醇。可以 發現，經過本發明所提供的生物菌株及脫毒方法處理后的半纖維水解物，無論用于木糖醇 發酵或乙醇發酵，發酵物的產量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本發明提供的 生物脫毒菌株及生物脫毒方法能有效地提高半纖維素水解物的發酵性能。本發明突出的實質性特點和顯著進步是1.本發明發現并提供的東方伊薩酵母CCTCC NO :M206097，西方伊薩酵母CCTCC NO :M206098這兩個菌株，對半纖維水解物中三大代表性微生物代謝抑制物以醋酸為代表 的有機酸，以糠醛為代表的糖類降解產物，及以愈創木酚為代表的酚類化合物，均同時具有 降解活性，它們對半纖維水解物均具有突出的生物脫毒活性。2.本發明利用東方伊薩酵母CCTCC NO :M206097，或西方伊薩酵母CCTCCNO M206098生物降解半纖維素水解物中的多種有毒成分，事實減少了基質中的雜質。與傳統的 理化脫毒工藝相比，用本發明對半纖維素水解物進行脫毒，顯然具有簡捷、低成本、及環境 友好的突出優勢。3.本發明提供的兩個脫毒活性菌株，其中CCTCC NO :M206097完全不能同化木糖、 CCTCC NO :M206098對木糖的代謝能力也十分微弱，利用它們對半纖維素水解物脫毒，并并 不會造成其中的木糖損失。由于這一特點，將它們與發酵木糖生成木糖醇，或發酵木糖生成 乙醇的微生物置于同一發酵系統中，可實現半纖維水解物脫毒過程與木糖醇發酵，或與乙 醇發酵相偶聯，極大地簡化發酵半纖維素水解物生產木糖醇發酵，或生產乙醇的工藝。
具體而言，本發明還提供了一套通過發酵半纖維素水解物生產木糖醇，與從半纖 維素水解物提取阿拉伯糖相結合的新方法，有效解決了化學工藝生產木糖醇的過程中，以 及由半纖維素水解物提取阿拉伯糖的過程中，由于木糖與阿拉伯糖之間化學性質相近帶來 的分離效率低，產品收率低，或使用有機溶劑帶來的安全隱患。與現有從發酵液制備木糖醇 的工藝相比，本發明多收獲了阿拉伯糖；與現有的阿拉伯糖的生產工藝相比，本發明多收獲 了木糖醇。本發明對于提高資源利用率，降低木糖醇及阿拉伯糖生產成本方面的優勢十分 明顯。本發明的整個過程包括用酸或酶水解富含木聚糖的原料，獲得以木糖，阿拉伯糖 為主成分，同時含有葡萄糖，甘露糖，半乳糖等雜糖的水解物。這種水解物經除去微生物生 長抑制物的脫毒處理之后，接入能夠同化利用葡萄糖，專一性地轉化木糖為木糖醇，但不能 利用阿拉伯糖的酵母菌株。當發酵液木糖濃度低至一定限度之后停止發酵，得到以木糖醇 與阿拉伯糖為主成分的發酵液。發酵液經細胞分離，離子交換脫鹽，脫色之后適當濃縮，直 接用鈣型陽離子樹脂為吸附劑，以純水為洗脫劑進行色譜分離，分別得到純度99%以上的 高純度木糖醇液，及以阿拉伯糖一雜糖溶液。高純度木糖醇液減壓濃縮，降溫結晶獲得晶 體木糖醇。阿拉伯糖一雜糖溶液改用銨型陽離子交換樹脂為吸附劑，仍以純水為洗脫劑 進行色譜分離，獲得純度1較高的阿拉伯糖液。最后將阿拉伯糖濃縮結晶，獲得晶體阿拉伯 糖。雖然上述色譜分離過程可以在填充了陽離子樹脂的固定色譜柱上完成，但工業化 的模擬移動床色譜裝置能有效提高分離效率。圖4顯示了本發明的整個工藝過程。用于本發明的半纖維素水解物是按如下方法制備的。將富含半纖維素的材料如 玉米皮(corn fiber)、玉米芯(corn cob),蔴· (sugar cane bagasse)等，以質量分數為 0. 5-2. 5% (w/w)的稀硫酸，或鹽酸，以酸液能夠浸泡過物料為宜，在110-140°C條件下水解 0. 5-2. 5h。水解后收集液體部分，用Ca (OH) 2或CaCO3調節至pH3_pH4，除去沉淀，上清液再 用相當于原料重量1一3%的活性碳吸附處理。濾去活性碳的溶液再依次通過陽離子，陰離 子交換樹脂凈化，濃縮后即得到可用于發酵的半纖維素水解物。本發明按如下的方法，在發酵罐內利用酵母細胞選擇性地催化將半纖維素水解物 中的木糖經生物催化轉化為木糖醇，而阿拉伯糖不參與生物催化反應。本發明所指的微生物主要是熱帶假絲酵母。這種酵母能夠利用半纖維素水解物 中的葡萄糖，半乳糖，甘露糖等六碳糖作為碳源生長，而不會生成相應的糖醇；對于五碳醛 糖，熱帶假絲酵母能夠轉化木糖為木糖醇，卻不能利用同屬五碳醛糖的阿拉伯糖。本發明實 際使用的菌株由本發明人篩選的，并保存于中國典型培養物保藏中心的熱帶假絲酵母菌株 Candida tropicalis CCTCC M20506專利申請號200510037580. 2，
發明者周玉恒, 張厚瑞, 蔡愛華, 覃香香, 陳海珊 申請人:唐傳生物科技(廈門)有限公司