專利名稱：自身活化淋巴細胞培養用培養基組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于惡性腫瘤治療的培養自身活化淋巴細胞的 培養基組合物。更具體地說，本發明涉及一種培養基組合物，所述培
養基內除了含有白細胞介素2 (IL-2)以外還含有抗CD3、抗CD16 以及抗CD56抗體，可以均勻地增值和活化NK細胞、T細胞和NKT 細胞，從而可以培養在多種多樣的惡性腫瘤治療中具有顯著功能的免 疫細胞。
背景技術：
最近在癌治療中，可以替代現有的手術、放射治療以及化學療 法的所謂過繼免疫療法(adaptive immunotherapy)的新療法正引起 人們的注目。
過繼免疫療法是一種將從患者的血液中分離而獲得自然殺傷細 胞(natural killer cell; NK細胞)、樹突狀細胞(De) 、 B細胞、T 細胞等在治癌過程中最重要的免疫細胞，利用多種刺激劑，擴增出具 有高度抗腫瘤活性的免疫細胞，并回輸患者體內的方法，該方法由于 使用患者自己的血液，與傳統的化學療法等治療方法相比副作用少、 給藥簡便，因此，最近被廣泛研究。
在過繼免疫療法中進行活化的免疫細胞當中，特別是屬于淋巴 細胞一種的NK細胞具有可以有效地殺傷感染病毒和腫瘤細胞、但不 殺傷大部分正常細胞的特征。眾所周知，這種NK細胞在初期機體防 御機構和人體的腫瘤免疫中起重要的作用。即，即使無由MHC(Major Histocompatibility Complex)表達而獲得的免疫過程，NK細胞也可 以殺傷特異性自身細胞、同種細胞以及異種癌細胞，特別是優先殺傷 很少表達或不表達Class 1 MHC的靶細胞。為此，NK細胞不僅可以 有效的殺傷不表達MHC的大部分癌細胞，還可以殺傷某些病毒感染細胞和如傷寒沙門菌(salmonella typhi)等細菌。
但是，這種具有高度殺傷癌細胞功能的NK細胞只占正常外周 血淋巴細胞的5% 15%，特別是在癌患者的情況下，該比例下降到 不足1%，因此，如果沒有通過過繼免疫療法的另外擴增過程，就無 法有效地攻擊癌細胞。
因此，為了適用于以癌治療為目的的過繼免疫療法，需要進行 針對癌進展程度大量培養和活化以NK細胞為首的免疫細胞的培養 基的研究，但是，用于培養適用于過繼免疫療法的免疫細胞的現有的 培養基主要是針對大量擴增免疫細胞中的T細胞。
韓國專利第0735081號(發明名稱活化CD4 T細胞的方法) 公開了這種現有的免疫細胞培養用培養基。根據上述的活化CD4 T 細胞的方法，從血液等生物試樣分離CD4 T細胞之后，在含有 GM-CSF、 IFN-gamma、 TNF-alpha、 Lectin以及IL-4等細胞因子的 培養基中進行培養，并在試管中活化CD4 T細胞，從而獲得預防或 治療細菌感染的組合物。
但是，在上述活化CD4 T細胞的方法中所使用的培養基組合物 具有以下技術問題；因為該培養基組合物只能選擇性地激活免疫細胞 中參與獲得免疫的T細胞，所以當使用該方法治療腫瘤時，雖然通 過大量被激活的T細胞可以有效地攻擊或殺傷己被記憶的癌細胞， 但是在攻擊未被記憶的各種癌細胞而治療惡性腫瘤方面，受到了限 制。
發明內容
本發明的目的是解決上述現有技術中存在的問題。即，本發明 目的是提供一種培養基組合物，該培養基中除了含有白細胞介素2 之外，還含有抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗體，能均勻地增殖 和活化NK細胞、T細胞以及NKT (Natural Killer T)細胞，從而可
以培養在多種多樣的惡性腫瘤治療中具有顯著功能的免疫細胞。
作為為了達到上述目的的技術思想的本發明提供自身活化淋巴 細胞培養用培養基組合物，該培養基組合物由細胞培養用培養基和添加于所述細胞培養用培養基的添加劑構成，用于大量培養自身活化淋 巴細胞，其特征在于，所述添加劑包含白細胞介素-2、抗CD3抗體、
抗CD16抗體以及抗CD56抗體。
根據本發明的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合物，可以大 量激活對不表達MHC的大部分癌細胞具有較強殺傷活性的NK細 胞，適用于副作用少、給藥簡便的過繼免疫療法，為此，具有極大地 改善因各種惡性腫瘤而受痛苦的癌患者的預后的效果。
圖1為表示根據本發明的培養基組合物培養的結果免疫細胞數 變化的示意圖。
圖2為表示根據本發明的培養基組合物培養的活化淋巴細胞表 型變化的示意圖。
圖3為表示根據本發明的培養基組合物培養的活化淋巴細胞細 胞毒性分析結果的示意圖。
圖4為分別利用本發明的培養基組合物和現有的T細胞培養用 培養基組合物進行培養的活化淋巴細胞的癌細胞殺傷能力比較圖。
具體實施例方式
本發明涉及一種培養基組合物，為了培養來源于人外周血的淋 巴細胞而產生在多種多樣的惡性腫瘤治療中具有顯著效果的免疫細 胞組成比的自身活化淋巴細胞，向培養基內添加白細胞介素2(IL-2)、 抗CD3 (anti-CD3)、抗CD16 (anti陽CD16)以及抗CD56 (anti-CD56) 抗體。在詳細說明本發明之前，先探討各種免疫細胞的特征以及在免 疫細胞的擴增以及活化中所使用的上述各種添加物的作用機制。
NK細胞是淋巴細胞中的一類細胞，是具有特征性形態的大顆粒 淋巴細胞(LGL， Large granular lymphocytes)，其抗腫瘤效果是由 細胞壞死(necrosis)或細胞凋亡(apoptosis)或這兩種作用機制同 時發生而產生。NK細胞在IL-2、 IL-12、干擾素(interferon)等細胞 因子的存在下，能提高細胞溶解(cytolytic)、分泌(secretory)以及增值(proliferative)等功能。人的NK細胞的表型(phenotype) 為CD16 (FcrRIII)與CD56,其細胞表面無TRC (T細胞受體復合 體，T-cell receptor complex)，為此CD16與CD56作為NK細胞的標志。
一般認為NK細胞對癌細胞的作用機制是抗體依賴性細胞介導 的細胞毒性(Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity; ADCC)。 NK細胞表達免疫球蛋白G (IgG)的Fc受體CD16，通過此受體可 以進行MHC非限制性殺傷。即，NK細胞的ADCC依賴于識別耙細 胞的抗體，當抗體和抗原相結合時會暴露其抗體的Fc區，并且，該 暴露出的Fc區與NK細胞上的Fc受體結合形成一個橋， 一旦此橋形 成，根據受體接合時發生的信號傳遞，NK細胞就產生細胞損傷物質， 引起耙細胞的損傷。
若在抗CD16抗體或抗原抗體復合體的存在下，培養淋巴細胞， 則CD16抗原被添加到NK細胞中而引起信號傳遞，NK細胞受到它 們的刺激之后，表達IL-2受體的a鏈等轉鐵蛋白(transferrin)受體 或產生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor; tnf)或干擾素(IFN-y)。
CD56抗原(Leul9/NKH1)是一種分子量為180 200kDa的糖 蛋白，表達于所有NK細胞以及某些T細胞。CD56抗原與廣泛分布 在人體神經組織中的NCAM-1 (神經細胞黏附分子-l， Neural Cell Adhesion Molecule-1)是同一種分子。眾所周知，NCAM-1是一種在 神經和肌組織中參與細胞之間黏附的分子。由此推測，在NK細胞中 表達的CD56也可以起到細胞之間黏附作用。
另一方面，T細胞是指細胞表面具有抗原受體(T cell antigen receptor; TCR)的細胞。TCR與a鏈和卩鏈的二聚體CD3抗原形成 異二聚體。 一部分T細胞(外周血T細胞的5%左右)是由y鏈和S 鏈的二聚體形成，而不是ap鏈。TCR與CD3抗原(Y、 5、 s、；、； 或n)形成復合體，若TCR識別抗原，則CD3抗原向細胞內傳遞其 信號。
一般地，促進癌細胞免疫反應的輔助性T細胞分泌多種細胞因 子，并活化殺傷T細胞、B細胞以及巨噬細胞等。細胞因子的種類繁多，如細胞和細胞之間的信息傳遞物質即白細胞介素1、 2、 3， TNF-a 以及干擾素-y等。根據本發明，在培養液中添加IL-2，活化殺傷T 細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞。
IL-2是當T細胞識別抗原而被活化時產生的、分子量為14 17kDa的糖蛋白(glycoprotein) 。 IL-2被分泌到T細胞外之后，與 產生IL-2的T細胞自身進行反應，促進該T細胞的增殖。IL-2還可 以促進NK細胞的增殖并增強NK細胞的殺傷活性，亦可促進B細胞 的增殖。
NKT細胞是固有免疫的成員，是T細胞的一種，其功能近年來 逐漸被闡明。從名稱可知，它表達T細胞的受體和NK細胞的特異性 細胞表面標志(surface marker) 。 NKT細胞的一種驚人的特征是， 它被活化之后，能在短時間內分泌IL-4、 IL-IO、 IL-13、 IFN-y、 TNF-a
等多種細胞因子。這種特征暗示著NKT細胞對適應性免疫應答產生 重大影響。
因此，在本發明中，為了均勻活化從人外周血分離出的NK細 胞、T細胞以及NKT細胞，將IL-2和抗CD3、抗CD16以及抗CD-56 單克隆抗體作為培養基的添加劑使用。其中，IL-2對T細胞和NK 細胞的增殖起作用；各單克隆抗體使免疫細胞表達CD3、 CD16、以 及CD56而起到抗原的功能。
以下，具體地說明本發明中的自身活化淋巴細胞培養用培養基 組合物。
在實施本發明的過程中，首先應該從治療對象的患者外周血液 中分離培養對象的免疫細胞，為此，可以使用以下方法利用人淋巴 細胞或單核球等單核細胞的比重低于1.077的特性，將患者的血液與 比重為1.077的Ficoll-Paque Plus溶液(淋巴細胞分離液)相混合， 并以一定的離心力進行離心，使之沉淀。根據比重的差異，獲得包含 淋巴細胞的單核細胞層，并從該單核細胞層單離出淋巴細胞。
根據本發明的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合物(以下稱為 第一培養基組合物)由細胞培養用培養基和添加在細胞培養用培養基 中的各種添加劑構成。當以39ml細胞培養用培養基為基準時，該培養基組合物含有作為免疫細胞培養用營養成分的20 500ul 190 210mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine)和2 5ml來源于自身的血漿 (plasma)、用于活化免疫細胞的20 300ul 17X 106 19X 106 IU/ml 的IL-2以及用于調節最終培養完成的免疫細胞(NK細胞，NKT細 胞，T細胞)的相對組成比的各2-30ul0.9 l.lmg/ml的抗CD3抗體、 抗CD16抗體以及抗CD56抗體。
在使用如上所述培養基組合物培養淋巴細胞的過程中，為了提 高培養效率優選使用繼代培養方法，首先使用如上所述培養基組合物
培養3 4天，然后將此培養3 4天的淋巴細胞的培養基組合物混入 到具有下述組成的培養基組合物中，繼續培養2 3天。
當以67ml細胞培養用培養基為基準時，在細胞培養用培養基中 添加下述的物質而形成繼代培養用的另一個培養基組合物(以下稱為 第二培養基組合物)作為免疫細胞培養用營養成分的20 500ul 190 210mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)禾B 2 5ml來源于自身的血 漿(plasma)、用于活化免疫細胞的20 300ul 17X 106 19X 106 IU/ml 的IL-2以及用于調節最終培養完成的免疫細胞(NK細胞，NKT細 胞，T細胞)的相對組成比的各2-30ul 0.9 l.lmg/ml的抗CD3抗 體、抗CD16抗體以及抗CD56抗體。
在上述第一和第二培養基組合物中所使用的細胞培養用培養基 是在含有氨基酸、維生素、有機化合物和無機化合物以及蛋白質等細 胞生長和生存所必需的營養成分的通常培養基內添加800 1200 IU/ml IL-2的培養基，可以列舉NKB6040 (NKBIO， KOREA)。
以下，通過具體的實施例進一步詳細說明本發明。但是，下述 實施例僅用于例示本發明，本發明的范圍不受這些實施例的限定。
實施例l:淋巴細胞的細胞增殖培養
圖1為表示根據本發明的培養基組合物進行培養之后的免疫細 胞數變化的示意圖。
將從正常人、實體腫瘤(solid tumor)患者以及白血病(leukemia) 患者的外周血60cc中分離出的各淋巴細胞作為實驗對象組，將各淋 巴細胞在39ml第一培養基組合物中培養4天，然后把包括培養細胞的第一培養基組合物混入在67ml第二培養基組合物中，繼續培養2 天。另外，為了誘導細胞的大量增殖，向追加培養的細胞和第二培養 基組合物中添加7ml來源于自身的血漿，并注入到含有1L包含10 20 IU (International Unit) /ml的IL-2的細胞培養用培養基的透氣性 培養袋中，培養8天。在這里，各培養過程是在37'C條件下利用C02 培養箱而進行的。
經過上述的培養過程，如圖1所示，可以確認包含NK細胞、T 細胞以及NKT細胞的淋巴細胞總數，在三種對象淋巴細胞中全部由 培養前的2.0X 106 4.0X 107增殖到2.0X 109以上。
實施例2:培養前后表型的觀察
圖2為根據本發明培養基組合物培養的活化淋巴細胞的表型變 化示意圖，Hl區域表示NK細胞、H4區域表示T細胞、H2區域表 示NKT細胞、H3區域表示其它免疫細胞的分布。
從60cc正常人外周血中分離淋巴細胞，經過實施例1的培養過 程之后，利用流式細胞儀(floweytometry)分析培養的活化淋巴細胞 表面抗原，用圖2進行說明其結果，如圖(a)所示，培養前表面抗 原的分布主要在H4區域，而如圖(b)所示，培養后表面抗原的分 布主要在Hl區域，實際計算CD3陽性(Positive) T細胞和 CD16+CD56陽性(positive) NK細胞的比率的結果，由培養前的 53.60% : 12.74%變成培養后的39.74% : 69.03%。
從上述結果可以確認，在利用本發明的培養基組合物培養的淋 巴細胞中NK細胞的比率明顯上升，為了評價像這樣的最終培養物的 組成變化對癌細胞的殺傷能力的提高的影響，進行了下述的細胞毒性 分析。
實施例3:對各種癌細胞的毒性(cytotoxicity)
從60cc淋巴肉瘤(lymphosarcoma)患者的外周血中分離淋巴細 胞，經過前述的實施例1的培養過程培養活化淋巴細胞，以各種比率 混合作為靶細胞(target cell)的癌細胞和作為效應細胞(effector cell) 的活化淋巴細胞之后，經過6小時之后，使之與乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase; LDH)進行反應，通過酶聯免疫吸附試驗(Elisa)分析細胞毒性，其結果如圖3所示，特別是在白血病細胞株(leukemia cell line; K562)、人淋巴瘤細胞株(human lymphoma cell line; U937) 以及人宮頸癌細胞株(human cervical epidermoid cell line; ME 180)
中，被活化的自身活化淋巴細胞的癌細胞殺傷能力與外周血單核細胞 (PBMC)相比顯著提高。
比較例1:與T細胞培養用培養基組合物的癌細胞殺傷能力比較
從60cc淋巴瘤(lymphoma)患者的外周血中分離淋巴細胞，經 過實施例1的培養過程，培養出NK/NKT細胞禾B T細胞的比率為6:4 的活化淋巴細胞(NKM)，此外，利用現有的T細胞培養用培養基 組合物培養出T細胞的比率為90%以上的活化淋巴細胞(CAT)， 對于上述兩種活化淋巴細胞，根據calcein-Am dying方法，對多種靶 細胞的各細胞毒性進行比較分析。在這里，T細胞培養用培養基組合 物是根據在日本被廣泛利用的現有的CAT ( anti CD3 Antibody-activity T cells)法而制備的，使用了添加有抗CD3抗體和 IL-2等的培養液，并將胃癌細胞株(AGS, NCI-N87)、乳腺癌細胞 株(MCF-7, MDA-MB-231)、肝癌細胞株(SK-HEP-1， HepG2) 以及白血病細胞株(K562)作為靶細胞。
如圖4所示，可以確認在除了 AGS之外的大部分癌細胞株，根 據本發明的培養基組合物培養的活化淋巴細胞的細胞毒性與根據T 細胞培養用培養基組合物培養的活化淋巴細胞相比增加了 6 34%。 以上所述僅為本發明的優選實施例而己，并不用于限制本發明， 對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本
發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應 包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種自身活化淋巴細胞培養用培養基組合物，該培養基組合物由細胞培養用培養基和添加于所述細胞培養用培養基的添加劑構成，用于大量培養自身活化淋巴細胞，其特征在于，所述添加劑包含白細胞介素-2、抗CD3抗體、抗CD16抗體以及抗CD56抗體。
2. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合 物，其特征在于，所述細胞培養用培養基含有800 1200 IU/ml白細胞介素-2。
3. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合 物，其特征在于，若以39ml所述細胞培養用培養基為基準時，添加于所述細胞培 養用培養基的添加劑包括20 300ul 17X106 19X106 IU/ml的白細 胞介素-2、 2 30ul 0.9 1.1mg/ml的抗CD3抗體、2 30ul 0.9 1.1mg/ml的抗CD16抗體以及2 30ul 0.9 1.1mg/ml的抗CD56抗 體。
4. 如權利要求3所述的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合 物，其特征在于，若以39ml所述細胞培養用培養基為基準時，所述添加劑還包括 20 500ul 190 210mM L-谷氨酰胺和2 5ml來源于自身的血漿。
5. 如權利要求1所述的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合 物，其特征在于，若以67ml所述細胞培養用培養基為基準時，添加于所述細胞培 養用培養基的添加劑包括20 300ul 17X106 19X 106 IU/ml的白細 胞介素-2、 2 30ul 0.9 1.1mg/ml的抗CD3抗體、2 30ul 0.9 l.lmg/ml的抗CD16抗體以及2 30ul 0.9 l.lmg/ml的抗CD56抗體。
6.如權利要求5所述的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合 物，其特征在于，若以67ml所述細胞培養用培養基為基準時，所述添加劑還包括 20 500ul 190 210mM的L-谷氨酰胺和2 5ml來源于自身的血漿。
全文摘要
本發明涉及一種用于惡性腫瘤治療的培養自身活化淋巴細胞的培養基組合物。更具體地說，本發明涉及一種培養基組合物，所述培養基內除了含有白細胞介素2以外還含有抗CD3、抗CD16以及抗CD56抗體，可以均勻地增值和活化NK細胞、T細胞和NKT細胞，從而可以培養在多種多樣的惡性腫瘤治療中具有顯著功能的免疫細胞。根據本發明的自身活化淋巴細胞培養用培養基組合物，其由細胞培養用培養基和添加于所述細胞培養用培養基的添加劑構成，用于大量培養自身活化淋巴細胞，其特征在于，所述添加劑包含白細胞介素-2、抗CD3抗體、抗CD16抗體以及抗CD56抗體。
文檔編號C12N5/0783GK101603028SQ20091000040
公開日2009年12月16日 申請日期2009年1月6日 優先權日2008年6月10日
發明者崔炳仁, 李東旭, 洪蘚旼 申請人:株式會社Nkbio