專利名稱：海參腸道組織蛋白酶b的分離純化方法
技術領域：
本發明屬于從海洋動物提取蛋白酶，同時涉及采用離子交換層析技術、凝 膠層析技術、高效液相色譜技術、冷凍干燥的技術等領域。
背景技術：
溶酶體中存在多種組織蛋白酶，目前已從魚貝類肌肉和內臟中純化并鑒定 IO種組織蛋白酶，即組織蛋白酶A、 B、 C、 D、 E、 H、 L、 L-like、 X及S。
對組織蛋白酶B的研究主要集中在魚類。目前，已從gray mullet、 tilapia mossambica、鯖魚、common Mackerel、 chun salmon、鯉魚肌肉中純化了組織蛋 白酶B，并對其進行了鑒定。
組織蛋白酶B(Cathepsin B,CB)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白水解酶，具有內 肽酶活及羧肽酶活，對肌肉蛋白質有廣泛的降解作用。研究表明，在pH5.0時， CB能夠水解肌球蛋白、肌鈣蛋白、原肌球蛋白和肌動蛋白。CB的催化作用由 Cys， His實現，易被巰基試劑抑制，又稱巰基酶，屬于木瓜蛋白酶家族。近年 來研究發現，組織蛋白酶也參與細胞凋亡過程，其中組織蛋白酶B、 C等能直 接或間接地激活Caspase (天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)而觸發細胞凋亡， 從而加速組織自溶。
目前，尚未有海參腸道組織蛋白酶B的相關提取方法，也未見到相關的文 獻合信息報道。
發明內容
針對海參貯存十分困難，因為其體內存在的酶類的協同催化作用可將自身 體內的蛋白質水解，引發海參神奇的自溶現象。本發明旨在研究海參自溶相關 的組織蛋白酶B，對海參自溶酶系的研究，將有助于延長海參貯存期、優化加工 條件及其開發出更有營養價值的功能性食品。
本發明的技術方案是在低溫條件下，對海參腸勻漿破碎，緩沖液浸提， 采用硫酸銨分級沉淀提取組織蛋白酶B粗酶。并依次利用離子交換樹脂、凝膠 層析技術使粗酶達到純化。
具體操作步驟為1. 海參的處理
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。
2. 粗酶的提取
將其用1 20倍海參腸體積的0"C的含5 200mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸) 的5 200mmol/LpH3.0 6.8的醋酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4"C下浸提4 18h， 采用6000 20000Xg (4°C)冷凍離心5 60min，取上層清液。選擇硫酸銨飽 和度為10% 卯％，對所得上層清液進行硫酸銨分級沉淀，經6000 20000Xg (4°C)冷凍離心20 60min后，取沉淀，并用上述醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，透 析除鹽后濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。
所述硫酸銨分級沉淀目的是在不同的硫酸銨飽和度下使不同的蛋白質從溶 液中沉淀析出，選擇目的蛋白的最大飽和度作為硫酸銨的最終飽和度。本實驗 選用5 200mmol/L pH 3.0 6.8的醋酸鈉緩沖液作為提取海參腸組織蛋白酶B 的浸提液。具體操作如下取新鮮海參腸用上述浸提液浸提，勻漿搗碎后經冷 凍離心5 60min后，取上清液，平均分成6份后并在4'C和磁力攪拌下依次向 上清液中加入研磨后的硫酸銨，使其飽和度分別達到0%、 20%、 40%、 60%、 80%、 90% ，靜置4h后，冷凍離心20 60min，取上清液測定酶活力。選取酶 活力最大所在的硫酸銨飽和度作為分級沉淀的條件。
3. 組織蛋白酶的純化
將得到的組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜、凝膠色譜、高效液相色 譜中的2 3種方法達到純化的目的，其中離子交換層析色譜是必須使用的。凝 膠色譜可以用 一種或兩種不同的層析方法先后進行純化。
(1) 離子交換色譜采用DEAE Sepharose CL-6B，采用含0.01 10 mmol/L 的NaCl的5 200mmol/LL-Cys的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速 為0.5ml/min,將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
(2) 凝膠色譜采用G-75或/和Sephacryl 100HR方法
G-75凝膠層析采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys 的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集， 透析除鹽后濃縮。
Sephacryl 100 HR凝膠層析采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/LL-Cys的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
(3)高效液相色譜技術采用凝膠色譜柱TSK-3000 SWxl (日本東洋曹達 TOSOH 7.8 mmX 300 mm 5 u m)，用0.01 10 mmol/L的Na2S04洗脫，流速 為0.1 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。 在酶的濃縮部分可以采用以下三種方法之一進行
(1) 采用超濾濃縮法
選擇1000 10000分子量的超濾膜，將小分子蛋白和金屬離子去除，達到 濃縮的目的。
(2) 采用聚乙二醇濃縮法 將所需濃縮的酶液裝于分子量為10000的透析袋內后，置于4'C條件下的燒
杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆蓋，當透析袋內溶劑滲出即被聚 乙二醇迅速吸去，從而達到濃縮的目的。
(3) 采用冷凍干燥技術
將得到的粗酶冷凍干燥得到干粉，將干粉復溶于l 2ml浸提液中，形成溶 液，以達到濃縮的目的。 本發明突出的優點是
1. 首次從海參腸分離純化得到組織蛋白酶B。
2. 對組織蛋白酶B的研究為海參自溶過程生理生化變化機制和代謝途徑的研 究奠定基礎，為海參深加工研究提供理論依據。
3. 豐富了酶學理論，對海參自溶酶系的研究，將有助于延長海參貯存期、優 化加工條件及其開發出更有營養價值的功能性食品。
具體實施例方式
實例一
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用5倍海 參腸體積的0。C的含5mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的5mmol/LpH 3.0的醋酸鈉 緩沖液勻漿破碎；在4。C下浸提4h，采用6000Xg (4°C)冷凍離心60min，取 上層清液。選擇硫酸銨飽和度為65%，進行硫酸銨分級沉淀，經20000Xg(4"C) 冷凍離心60min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析除鹽 后，超濾濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗酶過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.5 2.0mmol/L的NaCl的50mmol/L
6L-Cys pH6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收 集。收集的酶液透析除鹽后，超濾濃縮，過SephacryllOOHR凝膠層析色譜柱， 將有酶活力的部分收集，透析除鹽，超濾濃縮。 實例二
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用3倍海 參腸體積的(TC的含1Ommol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的5mmol/L pH 6.0的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4t:下浸提6h，采用15000Xg (4°C)冷凍離心30min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為40%，進行硫酸銨分級沉淀，經15000Xg(4°C) 冷凍離心60min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析除鹽， 采用聚乙二醇法濃縮后，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗 酶過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.01 1.0 mmol/L的NaCl 的20mmol/LL-Cys的pH6.0的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速0.5ml/min，將有 酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用聚乙二醇法濃縮后，過G-75凝 膠色譜柱，采用含3.0mmol/L的NaCl的40mmol/L L-Cys的pH6.0的磷酸鈉緩 沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽，采用聚乙二 醇法濃縮。
實例三
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用20倍海 參腸體積的(TC的含20mmol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的150mmol/L pH 6.8的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4。C下浸提15h，采用18000 Xg(4'C)冷凍離心10min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為卯％，進行硫酸銨分級沉淀，經18000 Xg
(4°C)冷凍離心30min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解， 透析除鹽后，采用聚乙二醇法濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織 蛋白酶B粗酶過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.5 8.0 mmol/L的NaCl的20mmol/L L-Cys的pH6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用聚乙二醇法濃 縮后，過Sephacryl 100 HR凝膠層析色譜柱，采用含5.0mmol/L的NaCl的 20mmol/LL-Cys的pH6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力 的部分收集，透析除鹽，采用聚乙二醇法濃縮。
實例四取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用15倍海 參腸體積的(TC的含100mmol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的80mmol/L pH 5.5的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4"C下浸提12h，采用20000 X g (4°C )冷凍離心40min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為85%，進行硫酸銨分級沉淀，經20000 Xg(4'C ) 冷凍離心40min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析除鹽 后，采用冷凍干燥技術濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶 B粗酶過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0. 01 0.5 mmol/L的 NaCl的100mmol/LL-CyspH5.5的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min， 將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，過 G-75凝膠色譜柱，采用含5mmol/L的NaCl的10Ommol/L L-Cys pH5.5的磷酸 鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除 鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，上樣于高效液相凝膠色譜柱TSK-3000 SWxl， 用0.5mmol/L的Na2SO4洗脫，流速為0.1ml/min，將有酶活力的部分收集，透析 除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮。
實例五
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用10倍海 參腸體積的0。C的含50mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的50mmol/L pH 5.0的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4'C下浸提18h,采用15000Xg (4°C)冷凍離心20min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為75%，進行硫酸銨分級沉淀，經15000Xg(4 。C)冷凍離心30min后，取沉淀。將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用冷凍干燥技術濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋 白酶B粗酶過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.02 1.0 mmol/L 的NaCl的80mmol/L L-Cys pH5.0的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min， 將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，過 G-75凝膠色譜柱，采用含0.2 mmol/L的NaCl的80mmol/L L-Cys的pH5.0的磷 酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集酶液透析除 鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，過SephacryllOOHR凝膠層析色譜柱，將有酶活 力的部分收集，透析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮。
實例六
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用12倍海
8參腸體積的(TC的含60mmol/L L-Cys (L-半胱氨酸)的100mmol/L pH 5.8的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4'C下浸提10h，采用20000Xg(4°C)冷凍離心50min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為80%，進行硫酸銨分級沉淀，經20000Xg(4 °C)冷凍離心50min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用冷凍干燥技術濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋 白酶B粗酶過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含1.0 1.5 mmol/L 的NaCl的60mmol/L L-Cys的pH5.8的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術 濃縮后，過Sephacryl 100 HR凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L的NaCl的60mmol/L L-CyspH5.8的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。 收集的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，上樣于高效液相凝膠色譜柱 TSK-3000 SWxl，用0.1mmol/L的Na2S04洗脫，流速為0.15ml/min，將有酶活 力的部分收集，透析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮。
實例七
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用10倍海 參腸體積的(TC的含50mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的50mmol/LpH 5.5的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4"下浸提8h，采用8000Xg (4°C)冷凍離心20min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為60%，進行硫酸銨分級沉淀，經8000Xg (4 。C)冷凍離心20min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用超濾濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗 酶過Sephacryl 100 HR凝膠層析色譜柱，采用含50mmol/L的NaCl的20mmol/L L-Cys的pH5.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收 集，透析除鹽，采用超濾濃縮后，過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱， 采用含0.5 8.0 mmol/L的NaCl的20mmol/L L-Cys的pH5.5的磷酸鈉緩沖液線 性洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽，采 用超濾濃縮后，過G-75凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L NaCl的20mmol/L L-Cys pH5.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集 的酶液透析除鹽，采用超濾濃縮。
實例八
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用5倍海參腸體積的0r的含40mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的40mmol/L pH 5.0的醋酸 鈉緩沖液勻漿破碎；在4t下浸提6h，釆用12000Xg (4°C)冷凍離心40min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為65%，進行硫酸銨分級沉淀，經12000Xg(4 °C)冷凍離心40min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，超濾濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗酶過 G-75凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L NaCl的20mmol/L L-Cys pH5.0的磷酸鈉 緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽， 釆用超濾濃縮后，過DEAE Sepharose CL-6B離子交換色譜柱，采用含0.5 1.0 mmol/L的NaCl的40mmol/L L-Cys pH5.0的磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透析除鹽后，超濾濃縮，過 SephacryllOOHR凝膠層析色譜柱，將有酶活力的部分收集，透析除鹽，超濾濃 縮。
實例九
取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質。將其用10倍海 參腸體積的(TC的含100mmol/LL-Cys (L-半胱氨酸)的100mmol/LpH 5.5的醋 酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4。C下浸提15h，采用18000Xg(4'C)冷凍離心30min， 取上層清液。選擇硫酸銨飽和度為75%，進行硫酸銨分級沉淀，經18000Xg (4 °C)冷凍離心30min后，取沉淀，將沉淀用50ml上述醋酸鈉緩沖液溶解，透析 除鹽后，采用冷凍干燥技術濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋 白酶B粗酶過G-75凝膠色譜柱，采用含50 mmol/L的NaCl的100mmol/L L-Cys pH6.5的磷酸鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集 的酶液透析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，過DEAE Sepharose CL-6B離子交 換色譜柱，采用含0. 01 0.5 mmol/L的NaCl的100mmol/LL-Cys pH6.5的磷酸 鈉緩沖液線性洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集。收集的酶液透 析除鹽，采用冷凍干燥技術濃縮后，上樣于高效液相凝膠色譜柱TSK-3000 SWxl， 用0.5mmol/L的Na2SO4洗脫，流速為0.1ml/min，將有酶活力的部分收集，透析 除鹽，釆用冷凍干燥技術濃縮。
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權利要求
1.海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在于操作步驟為(1)海參處理取新鮮活海參，去體壁后將海參腸清洗，去除泥沙和雜質；(2)粗酶提取將其用1～20倍海參腸體積的0℃的含5～200mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸)的5～200mmol/L pH 3.0～6.8的醋酸鈉緩沖液勻漿破碎；在4℃下浸提4～18h，6000～20000×g冷凍離心5～60min，取上層清液用選擇好的硫酸銨飽和度進行硫酸銨分級沉淀，后4℃下經6000～20000×g冷凍離心20～60min，取沉淀，并用上述醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，透析除鹽后濃縮，即得到組織蛋白酶B粗酶；(3)酶的純化將得到的組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜、凝膠色譜和高效液相色譜中的2～3種方法達到純化的目的，其中離子交換層析色譜是必須使用的。
2. 根據權利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(2)粗酶提取中所述用選擇好的硫酸銨飽和度進行硫酸銨分級沉淀是 在不同的硫酸銨飽和度下使不同的蛋白質從溶液中沉淀析出，選擇目的蛋白的 最大飽和度作為硫酸銨的最終飽和度；具體步驟是取新鮮海參腸用5 200mmol/L pH 3.0 6.8的醋酸鈉緩沖液浸提，勻漿搗碎后經冷凍離心5 60min，取上清液，平均分成6份后并在4'C和磁力攪拌下依次向上清液中加入 研磨后的硫酸銨，使其飽和度分別達到0%、 20%、 40%、 60%、 80%、 90% ， 靜置4h后，冷凍離心20 60min，取上清液測定酶活力,選取酶活力最大所在 的硫酸銨飽和度作為分級沉淀的條件。
3. 根據權利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(3)酶的純化中所述組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜進行純化的 具體步驟為采用DEAESepharoseCL-6B離子交換層析色譜柱，以含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys的pH5.0 6.5的磷酸鈉緩沖液線性洗 脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
4. 根據權利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(3)酶的純化中所述組織蛋白酶B粗酶用凝膠色譜進行純化，可以采用 G-75凝膠層析柱或/和SephacryllOOHR凝膠層析柱進行純化，具體步驟為均采用含0.01 10 mmol/L的NaCl的5 200mmol/L L-Cys的pH5.0 6.5的磷酸 鈉緩沖液洗脫，流速為0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
5. 根據權利要求1所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，其特征在 于步驟(3)酶的純化中所述組織蛋白酶B粗酶用高效液相色譜技術進行純化是 采用TSK-3000 SWxl凝膠色譜柱，用0.01 10 mmol/L的Na2S04洗脫，流速為 0.1 0.5ml/min，將有酶活力的部分收集，透析除鹽后濃縮。
6. 根據權利要求1 5中任一項所述海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方 法，其特征在于所述的濃縮采用以下三種方法之一進行(1) 超濾濃縮法選擇1000 10000分子量的超濾膜，將小分子蛋白和金屬離子去除，達到 濃縮的目的；(2) 聚乙二醇濃縮法將所需濃縮的酶液裝于分子量為10000的透析袋內后，置于4t:條件下的燒 杯中，向其中添加聚乙二醇，直到透析袋被覆蓋，當透析袋內溶劑滲出即被聚 乙二醇迅速吸去，從而達到濃縮的目的；(3) 采用冷凍干燥技術將得到的粗酶冷凍干燥得到干粉，將干粉復溶于l 2ml浸提液中，形成溶 液，以達到濃縮的目的。
全文摘要
海參腸道組織蛋白酶B的分離純化方法，在4℃下用含L-Cys的醋酸鈉緩沖液對海參腸勻漿破碎緩沖液浸提，采用硫酸銨分級沉淀，沉淀再用上述醋酸鈉緩沖液溶解沉淀，透析除鹽后濃縮得到組織蛋白酶B粗酶。將得到的組織蛋白酶B粗酶用離子交換層析色譜、凝膠色譜和高效液相色譜中的2～3種方法達到純化的目的。
文檔編號C12N9/64GK101565696SQ20091001189
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月5日 優先權日2009年6月5日
發明者蕾 于, 晶 劉, 吳海濤, 周大勇, 孫黎明, 宮國君, 朱蓓薇, 董秀萍 申請人:大連工業大學