專利名稱：：黃傘菌絲體富硒培育及黃傘硒多糖的提取工藝的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種黃傘菌絲體富硒培育及黃傘硒多糖提取工藝。
背景技術：
：黃傘(p力oh'Waa&'posa(Fr.)Qu61.)是野生于泰山上的一種珍貴藥、食兩用真菌，脆嫩可口、營養豐富。從黃傘中提取的多糖物質具有抑制腫瘤生長，預防葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌感染等作用。硒元素是人體必需的微量元素之一，具有降低癌癥發生率和死亡率，防治腦血管疾病、糖尿病，抗衰老等作用，并且能夠解除重金屬的致癌性與毒害。而硒制劑中以有機硒為佳，與無機硒相比有機硒具有吸收率高、無毒性等優點。近年來的研究表明，有機硒對鉛具有一定的拮抗作用。多糖類等大分子物質，其糖鏈上豐富的游離-OH和-COOH基團可與鉛絡合，形成難以吸收的凝膠，有效地阻止鉛在胃腸道的吸收，起到促進排鉛的作用，說明硒多糖具有復合排鉛的功能。本發明通過黃傘菌絲體的富硒培育，提取黃傘硒多糖，通過動物實驗，具有較好的排鉛效果，為黃傘硒多糖的開發利用奠定了基礎。
發明內容本發明的目的是通過黃傘菌絲體的富硒培育，提取黃傘硒多糖，為實現上述目的，本發明所采取的技術方案包括以下方法步驟(1)黃傘菌種的活化將由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg和蒸餾水1000ml組成的培養基裝入試管，滅菌擺斜面后冷卻，在無菌條件下，將冷藏保存的黃傘菌母種轉接活化后，接種到配置好的培養基上，在25t恒溫培養箱進行菌種的擴大培養；(2)液體培養種子的制備將由土豆100g、麥麩50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg和蒸餾水1000ml組成的液體培養基裝入培養瓶封口后，進行高壓滅菌，在0.15Mpr/cm2，125°C條件下滅菌20h;待液體培養基溫度降至30QC以下時，按無菌操作規程選取經步驟(1)擴大培養后菌絲濃密、生長優良的菌種，接入液體培養基中，每支試管菌種擴接6瓶三角燒瓶；將接種后的三角燒瓶置于搖床中進行避光培養，溫度為24t，轉速為145r/min，培養96h，待菌絲球呈米粒狀并布滿培養液時，停止培養，用作液體培養的種子；(3)種子的擴大培養在由土豆100g、麥麩50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg和蒸餾水1000ml組成的液體培養基中添加亞硒酸鈉母液，調整培養基中硒離子濃度為20-50ppm;調整后的培養基裝入50—200L液體發酵罐中，裝入培養基的體積量為發酵罐容量的70%，經滅菌冷卻待培養液溫度降到25。C左右時，按無菌操作規程將步驟(2)制備的液體培養種子接種到培養基中，接種量為培養液體積的10%;控制培養溫度24t，罐壓0.02MPa/cm2，通氣量0.03m7min，培養96h，待菌絲球布滿培養基時停止培養；(4)黃傘硒多糖的提取將擴大培養的獲得的菌絲球用蒸餾水清洗3-5次后，加入10倍于菌絲球重量的蒸餾水進行熱水浸提，提取溫度為95。C，提取時間2h;將壓濾后的濾液導入濃縮罐中，在0.09MPa的真空度下，濃縮至原體積的l/4;濃縮液取出后按l:2比例加入95%乙醇，靜置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下離心10min，60'C烘干，即得粗黃傘硒多糖。通過該培育工藝提取的黃傘硒多糖經稱量測定得率為0.08g/100ml、硒多糖中硒濃度為2120ppm，因此本發明工藝合理，硒多糖的得率高，硒多糖中的硒濃度冷縣*3里冋。具體實施例方式下面結合實施例對本發明進一步描述本發明的黃傘菌絲體富硒培育工藝包括以下方法步驟(1)黃傘菌種的活化將由土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg和蒸餾水1000ml組成的培養基裝入試管，滅菌擺斜面后冷卻，在無菌條件下，將冷藏保存的黃傘菌母種轉接活化后，接種到配置好的培養基上，在25t恒溫培養箱進行菌種的擴大培養；(2)液體培養種子的制備將由土豆100g、麥麩50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg和蒸餾水1000ml組成的液體培養基裝入培養瓶封口后，進行高壓滅菌，在0.15MPr/cm2，125°C條件下滅菌20min;待液體培養基溫度降至30°C以下時，按無菌操作規程選取經步驟(1)擴大培養后菌絲濃密、生長優良的菌種，接入液體培養基中，每支試管菌種擴接6瓶三角燒瓶；將接種后的三角燒瓶置于搖床中進行避光培養，溫度為24。C，轉速為145r/min，培養96h，待菌絲球呈米粒狀并布滿培養液時，停止培養，用作液體培養的種子；(3)種子的擴大培養在由土豆100g、麥麩50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg和蒸餾水1000ml組成的液體培養基中添加亞硒酸鈉母液，調整培養基中硒離子濃度為20-50ppm;調整后的培養基裝入50—200L液體發酵罐中，裝入培養基的體積量為發酵罐容量的70%，經滅菌冷卻待培養液溫度降到25。C左右時，按無菌操作規程將步驟(2)制備的液體培養種子接種到培養基中，接種量為培養液體積的10%;控制培養溫度24。C，罐壓0.02MPa/cm2,通氣量0.03m7min，培養96h，待菌絲球布滿培養基時停止培養；(4)黃傘硒多糖的提取將擴大培養的獲得的菌絲球用蒸餾水清洗3-5次后，加入10倍于菌絲球重量的蒸餾水進行熱水浸提，提取溫度為95。C，提取時間2h;將壓濾后的濾液導入濃縮罐中，在0.09MPa的真空度下，濃縮至原體積的1/4;濃縮液取出后按1:2比例加入95%乙醇，靜置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下離心10min，60'C烘干，即得粗黃傘硒多糖。黃傘硒多糖抗鉛作用試驗如下試驗動物采用體重為20(±2)g小白鼠30只，隨機分成3組，每組l0只，分別飼以普通飼料(硒含量為0.1497mg/kg)，添加硒多糖飼料(硒含量為0.4387mg/kg)，飼料組成為玉米70%，大豆29%，食鹽1%，自由進食進水。給藥方式采用腹腔注射方法。給藥量為鉛2Omg/kg，(藥量/體重)。前兩次隔日給藥，第3次3d給藥，第4次，5次隔4d給藥。第5次給藥后飼養9d后斷脊處死取樣。黃傘硒多糖對小鼠組織中硒、鉛含量的影響試驗結果見下表小鼠組織中硒、鉛的含量(X士S,濕組織)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由上表可見，在本試驗濃度下硒多糖可使小鼠各組織硒含量增加，使心、腎硒含量明顯增加(P〈0.05)，使血、肝硒含量極顯著增加(P〈0.01);使血、心、肝、腎硒含量極顯著增加(P〈0.01)硒多糖的補硒效果顯著。可降低小鼠各組織中鉛含量，減少鉛在體內的蓄積，但硒多糖的排鉛效果對心、腎等組織可達極顯著水平，對肝等組織可達顯著水平。上述實驗表明，硒多糖具有較好抗鉛作用，可不同程度減低小鼠各組織中鉛含量，迅速增加各組織中的硒含量，表明硒多糖具有對抗鉛毒性作用。為尋求解決目前由于鉛污染對人體危害的預防提供了一條新途徑。權利要求1、一種黃傘菌絲體富硒培育及黃傘硒多糖提取工藝，其特征在于包括以下方法步驟(1)黃傘菌種的活化制備PDA培養基，裝入規格為180×80的試管內，封口、滅菌、擺斜面，培養基冷卻后，在無菌條件下，將冷藏保存的黃傘菌母種轉接活化，在25℃下進行菌種的擴大培養；(2)液體培養種子的制備按馬鈴薯100g、麥麩50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g和蒸餾水1000ml的配比制備液體培養基，分裝于500ml的三角瓶封口后，進行高壓滅菌，在0.15Mpr/cm2、125℃條件下滅菌20min；取出待液體培養基溫度降至30℃以下時，按無菌操作規程選取經步驟(1)活化培養后的菌種，接入液體培養基中；每支試管菌種擴接6-8瓶三角燒瓶；將接種后的三角燒瓶置于搖床中進行避光培養，溫度為22-26℃，轉速為120-160r/min，培養時間為90-120h，待菌絲球呈米粒狀并布滿培養液時，停止培養，用作液體培養的種子；(3)種子的擴大培養在由(2)組成的液體培養基中添加配制成一定濃度的亞硒酸鈉母液，調整培養基中硒離子濃度為20-50ppm；將上述培養液裝入50-200L液體發酵罐中，裝入培養基的體積量為發酵罐容量的70％；經滅菌冷卻待培養液溫度降到20-30℃時，按無菌操作規程將步驟(2)制備的液體培養種子接種到發酵罐中，接種量為培養液體積的3％-10％；控制培養溫度22-26℃，罐壓0.01-0.03MPa/cm2，通氣量0.02-0.04m3/min，培養時間為80-120h，待菌絲球布滿培養基時停止培養；(4)黃傘硒多糖的提取將擴大培養的獲得的菌絲球用蒸餾水清洗3-5次后，加入10倍于菌絲球濕重的蒸餾水進行熱水浸提，提取溫度為85-100℃，提取時間2-4h；將壓濾后的濾液導入濃縮罐中，在0.085-0.095MPa的真空度下，濃縮至原體積的1/3-1/5；濃縮液取出后按1∶2-1∶4比例加入60-95％乙醇，靜置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下離心10h，60℃烘干，即得粗黃傘硒多糖。全文摘要本發明公開了一種黃傘菌絲體富硒培育及黃傘硒多糖的提取工藝，包括黃傘菌種的活化、液體培養種子的制備、種子的擴大培養和黃傘硒多糖的提取等方法步驟，本發明通過黃傘菌絲體的富硒培育，提取黃傘硒多糖，具有工藝合理，硒多糖的得率高，硒多糖中的硒濃度含量高的特點。文檔編號C12R1/645GK101525646SQ20091001455公開日2009年9月9日申請日期2009年3月6日優先權日2009年3月6日發明者王臨哲,蘇延友申請人:王臨哲