辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5基因、蛋白制備方法及其應用的制作方法

專利名稱：辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5基因、蛋白制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體地說，本發明涉及一種辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的分離及其編碼的蛋白質制備方法。此外，本發明還涉及該基因編碼的多聚半乳糖醛酸酶對辣椒寄主的破壞和細胞壁的降解作用。
背景技術：
植物病原卵菌與寄主互作過程中分泌多種重要的細胞壁降解酶或致病酶，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG: EC 3. 2. 1. 15)是多種植物病原卵菌分泌的一種重要致病酶，該類酶通過降解寄主植物細胞壁的果膠、中膠層而破壞寄主防御體系，近而增強病菌對寄主的親合力，因此該類酶是一種重要的致病因子。研究表明多聚半乳糖醛酸酶是一種細胞壁結合蛋白酶，可催化果膠分子中oc- (1，4)-聚半乳糖醛酸裂解，降解細胞壁的果膠，導致細胞壁軟化，利于病原菌的各種侵染結構、及其分泌的各種致病酶或致病毒素順利侵染寄主組織細胞而導致寄主的病程發展。PG分為內切型(endo-)和外切型(exo-)兩種，均由多基因編碼，植物病原卵菌PG基因簇成員間所編碼的多聚半乳糖醛酸酶的性能存在差異，該類酶降解寄主細胞壁的性能常由單個或幾個關鍵戶g基因協同作用。因此，探索植物病原卵菌與寄主互作過程中分泌的PG對寄主植物的致病作用，立足于致病靶標/^基因及其編碼的蛋白質功能特性研究，具重要的理論和實驗意義。
在世界范圍內，植物病原卵菌易導致多種植物的病害，給農業生產造成了嚴重的損失。資料表明PG是多種植物病原卵菌的重要致病因子，辣椒疫霉病是一種重要的卵菌病害，能導致多種植物發生嚴重病害，深入開展辣椒疫霉菌(尸/^o/^^oracfl;^d)多聚半乳糖醛酸酶基因分離及靶標基因編碼的蛋白制作和功能分析具重要的實踐意義，可以實現對于植物病原卵菌所導致的多種植物病害的防治與研究。在本發明申請之前，從世界范圍內除本研究小組已報道了辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶化/j^ 2基因的致病功能機制研究外，還未見辣椒疫霉菌其它關鍵&基因分離及其編碼的蛋白質制作和功能研究資料信息。

發明內容
基于上述的原因，1個克隆自辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶基因,c//^ 5及其編碼的蛋白質制作技術。立足于基因和蛋白水平，證明了該基因有效的參與了辣椒疫霉侵染寄主及導致辣椒疫病病程發生的過程，并立足于植物病理學和細胞化學技術證明了該基因編碼的蛋白質具有導致辣椒葉片產生皺縮、壞死和破壞細胞壁的性能。因此，該基因是辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因簇的一個重要靶標致病基因，本發明為進一步研制辣椒疫霉病菌分子檢測技術提供充分的技術儲備。
本發明所提供的多聚半乳糖醛酸酶基因，其基因序列如Seq ID No:l所示；其蛋白質氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。該基因開放閱讀框架有1086個堿基，編碼一種含有361個氨基酸的蛋白質，分子量為37kDa,有1個信號肽切割位點氨基酸殘基(為SEQ ID NO: 2序列中的1-20的氨基酸)，1個N-糖基化位點(位于SEQ ID NO: 2序列中的252-254號氨 基酸)，無內含子。
該多聚半乳糖醛酸酶基因與JGI中的jgi/phycaf7/20609中的所有Pg基因氨基酸序列 比對，發現l個Pg基因與Pcipg5基因氨基酸同源性最高達82.279/。，沒有一個與其完全相
同的基因，因此該基因是一個新的多聚半乳糖醛酸酶基因。 其具體的分離制備方法為
1、 分離克隆基因具體步驟
A:采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA,用QIAEXII GEL Extraction Kit試劑構建基因組 DNA文庫，將大小為1.5Kb-3. OKb的DNA片段連接于載體PUC19，轉化大腸桿菌DH5 a ， PCR 鑒定文庫質量。
B:根據已報道的植物、細菌、真菌的多聚半乳糖醛酸酶基因保守序列，設計簡并引物 P710 (其序列如Seq ID No: 3所示)和P1150R (其序列如Seq ID No: 4所示)，利用 Pooling-PCR技術篩選DNA文庫(參見plant journal, 2000， 23: 687-695),陽性克隆測序 獲得基因全長。
2、 制備蛋白質的具體步驟
A:A力^ 5基因酵母表達載體構建，目的基因克隆至表達載體pPIC9K中。 B:將上述重組表達載體線性化，轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，酵母轉化子平醇利 用表型平板篩選。
C:酵母轉化子培養和多聚半乳糖醛酸酶甲醇誘導表達，表達產物生物學活性檢測、 SDS-PAGE分析，多聚半乳糖醛酸酶純化。
本發明所用的載體和宿住菌均常見，PUC19為尸c力^ 5基因宿主載體，DH5a為宿主細 胞，pPIC9K為尸c//^ 5基因表達載體，(戶/c力/a ^"or") GS115為該基因的表達宿主菌。 通過這種方法克隆所得的基因及按照其編碼的蛋白質，可以為研究該類病毒的在辣椒 疫病株內轉錄表達水平和在辣椒疫病株內翻譯表達水平而提供有效的依據，其具體的檢測 方式如下
在辣椒疫病株內轉錄表達水平的檢測 A:將用于克隆,c/;^ 5基因的強致病辣椒疫霉菌接種辣椒葉片。 B:發病辣椒葉片總RNA提取及cDNA合成。 C:反轉錄cDNA第一條鏈合成。 D: RT-PCR檢測。 E:DIG-DNA探針制備。 F:MA轉移、固定及分子雜交檢測。 本技術操作釆用了常規基因轉錄表達檢測方法，具體操作過程在后續的具體實施方式
中加以詳述。
在辣椒疫病株內翻譯表達水平檢測步驟A:將用于克隆戶c//^ 5基因的強致病辣椒疫霉菌接種辣椒葉片； B:提取上述病葉中的粗蛋白；
C:利用獲得的,c/;^ 5基因表達純化的蛋白制備特異抗血清；
D:將B步中制得的粗蛋白轉NC膜后，利用上述的特異抗血清進行Western Blot分析 (實驗中釆用HRP標記的羊抗兔為二抗)。
本技術操作采用了常規基因翻譯表達檢測方法，具體過程在后續的具體實施方式
中加 以詳述。
同時為了進一步驗證本發明所提供的戶c//^ 5基因編碼的多聚半乳糖醛酸酶具有破壞 辣椒葉片和降解細胞壁的作用，本發明提供了該基因編碼的蛋白質接種辣椒葉片的方法和
降解細胞壁的電鏡觀察制作技術，具體操作步驟 A:,c//^ 5基因表達純化蛋白接種健康辣椒葉片。
B:取接種表達純化蛋白并呈現明顯癥狀的辣椒葉片樣品固定及脫水處理。 C:然后進行浸透、包埋及切片染色。 D:電鏡觀察。
致病蛋白接種方法是借鑒同類研究成熟的操作技術，電鏡觀察制作屬常規操作技術， 具體操作在后續的具體實施方式
中加以詳述。通過該技術進一步證明了在辣椒疫霉菌與辣 椒寄主互作過程中，該基因編碼的蛋白質具明顯降的破壞辣椒葉片和降解細胞壁的性能。 本技術為探索其它細胞壁降解酶基因簇成員致病功能特性研究提供有價值的借鑒。
綜上所述，本發明提供了 1個克隆自辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶基因,c々^ 5及 其蛋白質制作技術。立足于基因和蛋白水平，證明了該基因有效的參與了辣椒疫霉侵染寄 主及導致辣椒疫病病程發生的過程，并立足于細胞化學技術證明了該基因編碼的蛋白質具 有破壞葉片組織細胞及其細胞壁結構的性能，使受害部位產生明顯的癥狀。因此，該基因 是編碼辣椒疫霉果膠甲基酯酶基因簇的一個重要靶標致病基因，本發明為進一步研制病菌 分子檢測技術提供充分的技術儲備。


圖l.,c/j^ 5基因表達載體示意圖
圖中A即，Kana分別為氨節抗性和卡那抗性，5'A0X1為啟動子，3'A0X1為轉錄終止子，His6 是組氨酸脫氫酶基因篩選標記，EcoR I和Not I為雙酶切位點，戶cZ/^5為目的基因，Stul為 線性化位點；
圖2.,c/;^ 5基因表達純化蛋白結果
圖中M:標準蛋白；l為空載體pPIC9K表達結果；2為戶c/;^5基因在畢赤酵母GS115中的表 達結果；3為A/;^5基因表達蛋白純化結果，3圖示的蛋白帶表明獲得了該基因表達純化的蛋 白；
圖3.戶c/;^ 5基因在辣椒疫病葉內轉錄表達水平的RT-PCR檢測結果
A:l, 3, 5, 7為參試辣椒疫霉菌接種辣椒葉片后的7d內每間隔ld病葉cDNA檢測結果；CK+為辣椒疫霉菌的cDNA檢測結果；CK-為健康辣椒葉片的cDNA檢測結果;B:辣椒寄主PicUn基 因的擴增結果;C:CK-為健康辣椒葉片的RNA擴增結果；1, 3, 5, 7為接種7d后每間隔ld辣椒病 葉的RM擴增結果；CK+為參試辣椒疫霉菌的RNA擴增結果。圖A所示的RT-PCR檢測圖帶亮度逐 漸增強，說明接種辣椒疫霉菌的辣椒葉片(ld-7d)隨著葉片發病程度的增強，該基因在辣椒 病葉內的轉錄表達水平逐漸增強；
圖4.,c/'/7《5基因在辣椒疫病葉內轉錄表達水平的Northern Blot檢測結果 A:l、 3、 5、 7為辣椒疫霉菌接種辣椒葉片7d內每間隔ld病葉RNA的檢測結果；CK+為參試 辣椒疫霉菌的RNA檢測結果(陽性對照)；CK-為健康辣椒葉片的RNA檢測結果(陰性對照)；B: 病葉和健康葉片的RNA質量檢測結果；圖A所示由A//《5基因制備的探針與接種辣椒疫霉菌的 病葉(ld-7d) RNA雜交信號強度逐漸增強，說明在接種辣椒疫霉菌的7d內，隨著發病程度的
加重，該基因在辣椒病葉內的轉錄表達水平逐漸增強；
綜合RT-PCR和Nor thern B1 ot檢測結果表明，辣椒疫霉菌侵染辣椒葉片而引起葉片發病的
過程中，在病菌接種辣椒葉片的7d內，該基因轉錄表達水平逐漸增強；
圖5.,c力^ 5基因在辣椒疫病葉片內翻譯表達水平的Western Blot檢測結果
ld、 3d、 5d、 7d為辣椒疫霉菌接種辣椒葉片7d，每間隔ld戶c/;^5基因在病葉內的翻譯表
達水平檢測結果；CK-為健康葉片粗蛋白的檢測結果；CK+為辣椒疫霉菌粗蛋白的檢測結果； 結果顯示辣椒疫霉菌侵染辣椒葉片而引起發病的過程中，該基因翻譯表達水平逐漸增強； 圖6. A/;7《5基因表達純化蛋白對辣椒葉片細胞壁降解電鏡觀察結果 A:Pcipg5基因表達純化蛋白對辣椒葉片細胞壁的降解效果，劍頭所示；B:表達純化蛋白
鈍化后對辣椒葉片細胞壁無破壞作用，劍頭所示(陽性對照)；C:無菌水對辣椒葉片細胞壁無
任何破壞作用，劍頭所示(陰性對照)。結果顯示該基因表達獲得的蛋白對辣椒葉片細胞壁具
明顯的降解效果，由此推斷該基因編碼的蛋白是一種具降解細胞壁性能的蛋白，或在一定程
度上是一種病程相關蛋白；
具體實施例方式
本發明所提供的實施例，均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或Draper， J等(Blackwell科學 出版社，1988 )所述的操作技術規程，或按制造廠商的建議實驗條件。 實施例l (參試辣椒疫霉菌基因組DNA文庫構建)
選取強致病且具高PGs活性的辣椒疫霉菌株為參試材料，構建基因組DNA文庫，具體步驟 如下
(1) 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因組高質量DNA。
(2) 基因組DNA超聲波打斷,電泳檢測獲得的l. 5Kb-3. OKb的DNA片段，采用Q畫II GEL Extraction Kit試劑盒回收純化。
(3) 基因組文庫鑒定，適宜大小的DM片段連接載體后，轉化大腸桿菌DH5a,取20yL菌(4)隨機挑取了96個克隆進行菌落PCR鑒定和測序分析，確保96個克隆中插入了所需大小 的DM片段成功率達80。/。以上。 實施例2 (基因克隆及測序)
根據已報道的多聚半乳糖醛酸酶基因序列設計簡并引物P710 (其序列如Seq ID No: 3所示) 和P1150R (其序列如Seq ID No: 4所示),利用Pooling-PCR方法篩選基因組文庫，快速分離獲
得目的基因家族的多個基因成員。
1. 96個克隆總質粒DNA提取(堿裂解法)
(1) 將含有質粒的大腸桿菌接種于含有抗生素LB的培養基96深孔板中，37'C, 220rpm
震蕩，至對數生長后期。
(2) 將培養的菌液移至80mL離心管中，4"C， 8000rpm離心15min，棄上清。
(3 )將離心獲得的菌體于盛有5mL溶液I [50mM Tris-HCl ( pH8. 0 )， 10mM EDTA ( pH8. 0 )] 的離心管中重新懸浮，于搖床緩慢搖動10min，然后加O. 5mL的溶菌酶(濃度為10mg/mL),靜 置10min。
(4) 加10mL溶液n
混勻，室溫下放置IO min。
(5) 每管中加7. 5mL冷凍溶液I15MKAC60mL,冰醋酸ll. 5mL, H2028. 5mL〗，充分混勻， 于冰塊表面放置IO min,并震蕩混勻3次。
(6) 4°C, 10000rpm離心10 min,重復離心至大分子DNA沉淀至全部清除為止。
(7) 取上清，加O. 6倍體積的異丙醇，混合后室溫下放置10min,然后室溫下，10000rpm 離心15 min,取沉淀用7(W的乙醇洗兩次，倒置離心管干燥。
(8) DNA溶于3mLTE內，將溶解后的提取物移至50mL的離心管中，加等體積冷凍的5mol/L LiCl，混合后置于冰塊2-5min后，4'C, 10000rpm離心10 min (沉淀大分子RNA )。
(9) 將上清移至于30-50mL的干凈離心管中，加O. 6倍體積的異丙醇，混合均勻，室溫下 沉淀10min, 10000rpm離心10min。
(10) 倒掉上清，倒置離心管，除去殘余的上清，用70y。的乙醇洗2次，倒置離心管干燥 幾分鐘。
(11) 沉淀溶于lmLTE或水中，-20。C下保存待用。
2. 16個克隆總質粒DNA提取
步驟同上，各種溶液用量均為前述的1/6。
3. 單克隆質粒DNA提取
(1) 將含有質粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養基中，37°C, 220-250rpm
震蕩，培養至對數生長期。
(2) 取lml菌液至l. 5ml的離心管中，8000rpm離心lmin,去上清，收集菌體。
(3) 加入200 pL預冷的溶液I，震蕩懸浮菌體。(4) 加入400 niL溶液I1,顛倒離心管數次混勻，12000rpm離心5min。
(5) 加入300juL預冷的溶液in，顛倒混勾液體，置冰塊表面5min, 12000rpm離心5min,
上清轉入另一只離心管中。
(6) 加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min。
(7) 上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置IO min， 12000rpm離心10min，去上清。
(8) 沉淀用70y。乙醇洗2次，倒置干燥。
(9) 回溶于30uL TE(含20iug的RM酶)中，取5/jL電泳檢測后，置于-20'C保存。 4. Pool ing-PCR篩選基因組文庫
采用96深孔板(2.2mL)培養單克隆，將每一深孔板所培養的克隆作為一個Super Pool, 再將此Super Pool分為6個Matrix Pool,提取Super Pool質粒，以基因組DNA作為陽性對照， 水作為陰性對照。
PCR反應程序為95°C 4 min; 94°C 1 min, 55°C 30 s, 72°C 1 min,共35個循環；最 后72'C延伸10 min。
反應體系為ddH20 ( 32.5 ju L ), 10 x buf f er ( 5 y L )， MgCL2 ( 4 n L ), dNTP ( 4 ju L ), P710(1mL), P1150R (1 m L) ， DNA(2jjL), TaqE ( 0. 5 ja L )。
取10)JL反應產物電泳，確定含有目基因單克隆，送上海博亞生物有限公司測序。借助NCBI 中的BLAST程序對獲得基因全長進行同源序列比較，確定目的基因。根據基因全長序列推測相 應的氨基酸序列，推算目的基因編碼的蛋白質分子量，約為37kDa。 實施列3 (基因表達與蛋白純化)
l.A//^ 5基因成熟肽序列分離
(1 )根據已獲得的尸c7/^5基因全長DNA序列，以參試辣椒疫霉菌的RNA為模板進行RT-PCR 擴增，獲得其cDNA全長。
(2)根據其cDNA全長，設計表達引物，去除信號肽序列和3'、 5'非編碼區序列，并在 上游引物(Pcipg 5F:其序列如Seq ID No:5所示，
EcoRI酶切位點，下游引物(Pcipg 5R:其序列如Seq ID No: 6所示
5， -TATAGCGGCCGCTTAGCACTTGACAGTGCTGG-3')引入Not I酶切位點，擴增產物含,c/;^5
基因編碼的成熟蛋白序列。
反應體系為50 jnL:擴增Pcipg 5基因全長獲得cDNA模板(2mU, 10xbuffer (5 ju L ), dNTP ( 4 |a L ), Pcipg 5F (1 |a L) , Pcipg 5R ( 1 m L )， TaqE ( 0. 5 ja L ), ddH20 ( 32. 5 n L)
PCR反應程序為94°C 10 min; 94°C 30 min, 67. 3°C 45s, 72°C 1 min,共35個循環； 最后72'C延伸10 min。取10)jL反應產物進行iy。瓊脂糖凝膠電泳分析，然后進行測序，獲得？c/'/^ 5基因表達序 列，然后目的基因回收連接與pGEM-T Easy Vector,轉化大腸桿菌DH5a,藍白斑篩選、質粒 DNA酶切鑒定，篩選陽性克隆質粒pGEM-T/,c//^5。
2.,c/》g 5基因畢赤酵母表達
2.1酵母表達載體的構建
(1) EcoR I和Not I雙酶切pGEM-T/,c/'/^5質粒，回收插入片斷。
(2) 與同樣雙酶切的酵母表達質粒pPIC9K連接，轉化大腸桿菌DH5 a 。
(3) 轉化后的DH5cc經Amp抗性篩選，獲得菌落經37'C搖床過夜后提取質粒。
(4) 重組質粒pPIC9K/A^w 5酶切及測序鑒定。 2.2重組表達載體線性化
用StuI限制性內切酶(位于5' AOX l區域)進行線性化酶切，以獲得GS115 His+Mut+表 型轉化子，反應體系為
(1) 取質粒pPIC9K/v^//^5 10/iL (10-20 y g)，加入5yL 10X H buffer后，再加入 Stu I 3)uL。
(2) 加ddH力22uL,總體積為40iuL (空載體pPIC9K線性化反應體系相同)。
(3) 37'C反應4 h后，取少量反應液電泳檢測酶切效果。
(4) 酶切完成后，將線性化載體DNA電泳，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收并純化 目的片斷，-20'C保存以備轉化。
2. 3酵母轉化
2.3.1畢赤酵母GS115感受態細胞制備
(1) 接種畢赤酵母GS115于3mL YPD液體培養基，30C振蕩培養過夜，然后取lmL于50mL YPD 液體培養基，3(TC,振蕩培養16-18h, OD600 = 1. 3 ~ 1. 5, 4'C、 3400rpm離心5min。
(2) 用50mL冰冷無菌水重懸細胞，然后用25mL冰冷無菌水重懸細胞，同上離心。
(3) 用5mL冰冷的lM山梨醇重懸細胞，同上離心。
(4) 同上離心，用O. 5 mL冰冷lM山梨醇重懸細胞，終體積為1.5mL,制備感受態細胞，用 于轉化。
2. 3. 2重組表達載體pPIC9K/Pcipg5轉化感受態細胞
(1) 取80juL酵母感受態細胞與5-20ug線性化重組表達載體(溶于5-lOyL TE )(空載體 做對照)。
(2) 將樣品加入預冷的0. 2cm電轉杯，冰洛5 min后電轉。
(3) 加入lmL lmol/L冰冷的山梨醇于電轉杯，后轉至一個新離心管中。
(4) 將轉化后的酵母菌于30'C下放置1-2h。
(5) 取200-600iuL菌液涂于MD平板上,30。C倒置培養2-3d,檢測轉化子后，進行Mur/Muts 表型篩選。2. 3.3酵母轉化子篩選與鑒定
2. 3. 3. l酵母轉化子甲醇利用表型平板篩選
(1) 酵母轉化子對應接種于MD和固平板。
(2) 3(TC培養2-4d，測定菌落大小及數量。
(3) 入選均能在MD和畫平板正常生長的酵母轉化子，然后用PCR鑒定陽性克隆。 2.3.3.2酵母轉化子基因組DNA提取
(1) 取酵母細胞,12000rpm離心lmin,吸除上清。
(2) 加入600 m l山梨醇buffer,加入大約50ja 1 Lyticase,充分混勾，30°C/30min， 4000rpm 離心10min,棄上清，破除酵母細胞壁。
(3) 加入200 yl緩沖液重懸沉淀，充分混勾。
(4) 加入20ju 1蛋白酶K溶液，混句。
(5) 加入220)li 1 GB緩沖液，充分混勾，70。C放置10min,離心除去管蓋內壁水珠。
(6) 加入220 pl無水乙醇，充分混勻，離心除去管蓋內壁水珠。
(7) 再加入一個吸附柱CB2中，12000rpm離心30 s,倒掉廢液，然后將吸附柱放入收集管中。
(8) 向吸附柱中分別加入500 p 1、 700inlGD緩沖液，分別12000rpm離心30s,倒掉廢液， 均將吸附柱CB2放入收集管中。
(9) 12000rpm離心2min,倒掉廢液，置于室溫數分鐘晾干。
(10) 將吸附柱轉入新離心管中，滴加50-200 u 1洗脫緩沖液TE,室溫放置2-5min， 12000rpm離心2min，收集至離心管中。
2. 3.3.3 pPIC9K AOX l通用引物鑒定 反應體系50;/L:
(1) 加入AOXl通用引物5， A0X1: 1^L, 3， A0X1: 1^L。
(2) 加入IO x PCR Buffer (Mg2+free) 5;/L。
(3) 加入MgCl2 (25ramol/L)4 ^L。
(4) dNTP混合(2. 5mmol/Leach)4^L。
(5) 重組酵母基因組DNA 5;iL。
(6) Tap聚合酶(5U"L) 0. 5^L。
(7) ddH20 29. 5:L。
擴增反應條件94°C 4min; 94°C 1 min, 54°C 30 s, 72°C 1 min, 35個循環；72°C 10 min,取IO //L PCR產物檢測。
2. 3.3.4 ,c/pg 5基因特異性引物鑒定 反應體系
(1)加戶c/滯5基因特異引物Pcipg 5F (20^mol/L)和Pcipg 5R (20〃mol/L)各l ^L。(2) 加10xPCR Buffer (Mg2+free) 5^L。
(3) 加MgC丄2 (25mmol/L)仏L。
(4) 加dNTP混合(2. 5mmol/Leach) L。
(5) 加重組酵母基因組DNA 5斗。
(6) 加Tap聚合酶(5U/^L) 0. 5〃L。
(7) 加ddH2。 29. 5 〃L。
擴增反應條件94°C 10 min; 94'C 30s, 67. 3°C 45s， 72°C lmin,共35個循環；最后 72。C延伸10 min。
2.3.15外源基因多拷貝轉化子篩選
(1) 制備適量YPD培養基，加入適當體積的100mg/mLG418貯備液，混勻鋪制平板，制備含 不同濃度的G418 ( 0 mg/mL， 0. 25mg/mL， 0. 5mg/mL， 1. 00 mg/mL, 2. 00 mg/mL, 4. 00 mg/mL ) 的YPD平板。
(2) 吸取2mL無菌水至每個含有His+轉化子的MD平板，用無菌涂布器刮取菌落，將菌體重 懸于滅菌水中。
(3) 菌懸液混合后，轉至50mL無菌離心管中，渦漩振蕩5-10s,分光光度計測定細胞濃度。
(4) 分別取l x 105個菌體細胞涂布于已制備的含不同G418濃度的YPD平板。
(5) 3(TC培養2-5d后，挑取對G418最高濃度具抗性的菌落于YPD平板劃線純化，作為多聚 半乳糖醛酸酶誘導表達待選菌株。
2.4酵母轉化子培養和多聚半乳糖醛酸酶誘導表達
(1) 挑取對G418具最高抗性水平的陽性菌落，接種于盛有25mL BMGY培養基的250mL搖瓶 中，28-3(TC振蕩培養(250 - 300rpm) 16-18h,至生長對數期，轉化pPIC9K空載體GS115菌株
為對照。
(2) 5000 rpm離心5min回收酵母細胞，棄上清，將細胞重懸于適當體積的BMMY培養基中， OD600值達1. 0。
(3) 將培養液置于500ml搖瓶中，28-3(TC搖床震蕩培養。
(4) 間隔24h補加100y。甲醇至終濃度0. 5%,持續誘導。
(5) 間隔24h取樣一次，至168h，每次取誘導培養液lmL于l. 5mL離心管中，最大轉速離心 2-3 min,取上清液和細胞沉淀均凍存于-7(TC冰柜中。
(6) 表達產物SDS-PAGE分析，然后利用DNS法測定誘導表達的多聚半乳糖醛酸酶活性。 2. 5多聚半乳糖醛酸酶融合蛋白純化
2.5.1蛋白樣品的制備
(1) 收集誘導表達的酵母轉化子培養物，6000rpm離心30min,棄沉淀，取上清。
(2) 將上清液按照60y。的飽和度加入(NH4)2SO4沉淀多聚半乳糖醛酸酶，8000rpm離心30min,
收集沉淀。(3)沉淀用8ml Native Binding Buffer重新懸浮后，透析過夜棄除鹽離子，透析產物即
待純化的蛋白樣品。
2. 5. 2蛋白純化步驟
2. 5. 2. 1 Ni-NTA凝膠純化柱準備
(1) 吸取l. 5ml凝膠樹脂加入至10ml凝膠純化Ni-NTA柱中，輕微離心使樹脂沉淀至柱子底
部，流盡清液。
(2) 加入6ml雙蒸水，重新懸浮樹脂。
(3) 輕微離心使樹脂沉淀至柱子底部，流盡清液。
(4) 加入6ml Native Binding Buffer,重新懸浮樹脂。
(5) 連續重復步驟3三次。
(6) 連續重復步驟4-5三次。 2.5.2.2多聚半乳糖醛酸酶純化
(1) 取可溶性蛋白8ml注入Ni-NTA柱中。
(2) 輕柔攪拌使樹脂在蛋白液中懸浮，吸附30-60min，去掉上清。
(3) 用8ral Native Wash Buffer沖洗，使樹脂沉淀至柱子底部，去掉上清。
(4) 重復步驟3三次。
(5) 用8-12 ml Native Elution Buffer洗脫蛋白。
(6) 重復步驟5—次，收集洗脫樣品，取l ml洗脫液進行SDS-PAGE分析。
(7) 將洗脫液用雙蒸水透析，去鹽離子，獲得純的融合蛋白，SDS-PAGE分析后，按照上述 方法測定純化蛋白的活性。
實施列4 (戶c//^ 5基因于辣椒疫病葉內轉錄表達水平的RT-PCR和Northern Blot檢測)
1. 參試辣椒疫霉菌接種辣椒葉片
(1) 參試辣椒疫霉菌于0MA基質上培養7d。
(2) 利用Petri溶液誘導產生孢子囊，4'C處理30min誘導產生游動孢子，配制成濃度為l x 105/ml游動孢子懸浮液。
(3) 懸滴法接種健康辣椒葉片，觀察病害癥狀。
2. 辣椒病葉總RNA提取與cDNA合成
(1) 接種ld、 3d、 5d、 7d的辣椒病葉經DEPC水處理后，分別取O. lg樣品進行液氮研磨，移 入lml Trizol溶液室溫靜置5min。
(2) 加入0. 2mL氯仿，充分混合混勾，4'C下12000rpm離心15min，吸取上清，重復一至多次。
(3) 吸取上清，每lml Trizol加入O. 25倍異丙醇和0. 25倍RNA沉淀劑，充分混勻，室溫放 置IO min, 4'C下12000rpm離心10 min。
(4) 收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌2次，重復離心。(5) 吸盡殘余乙醇，或使殘余乙醇揮發掉。
(6) 加50-100)j 1 DEPC處理水,將RNA溶液于-7(TC下保存備用。
3. 反轉錄合成cDNA第一鏈
(1) 取l-2ug總RNA,加入ddH20至9. 5 iuL, 75。C變性5min,冰浴5min,稍微離心。
(2) 加10X擴增緩沖液2)aL。
(3) 加10mmol/L dNTP混合液2 ju L。
(4) 加25mmol/LMgCl2 4iuL。
(5) 加引物01igo—dT 1 nL。
(6) 加RNA酶抑制劑O. 5juL。
(7) 加反轉錄酶M-MLV IiliL。
(8) 反應總體系20)uL。
(9) 反應液混合后，室溫放置10min, 42'C溫洛60min, 85'C水洛放置10min。
(10) 加180pL ddH20混勻，稍微離心，-2(TC下保存，設陰性對照3個分別是①加入第 一鏈cDNA反應所需的所有試劑，不加模板RNA;②加除反轉錄酶外的所有試劑；③加除引物外
的所有試劑。
4. RT-PCR
反應體系(1)加雙蒸水32. 5 jliL; 10 x buf f er 5 |a L; MgCL24nL; dNTP 4 n L;引物 RT-5F:其序列如Seq IDNo: 7所示，1 RT-5R:其序列如Seq ID No: 8所示，1jliL; cDNA
2 |u L， TaqE 0. 5 ju L。
擴增條件94。C預變性5min; 94。C變性lmin, 64。C退火30s， 72。C延伸30s， 30個循環； 72。C延伸10min,取10/iL PCR產物iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測。
p-actin參比體系同上，引物為P -actinF (其序列如Seq ID No: 9所示)；P-actinR (其序列如Seq ID No:10所示)。
P-actin擴增條件94。C預變性4min; 94。C變性lmin, 62。C退火lmin, 72。C延伸30s， 30 個循環，72'C延伸10min，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。
5. Northern Blot
5.1辣椒病葉總RNA提取方法同上 5. 2 DIG-DNA探針標記制備
(1) 在一離心管中加入l ug RT-PCR擴增產物于滅菌的雙蒸水中至終體積為16nL。
(2) 沸水洛10min,迅速置于冰洛冷卻，變性DNA。
(3) 充分搖勻DIG-High Prime,力口4 )a L于變性DNA溶液中，混合并短暫離心。
(4) 37。C溫洛lh或過夜。
(5) 加2juL 0. 2M EDTA(pH8. 0)或65。C溫洛10min以終止反應。 5. 3 RNA轉移與固定5. 3. l凝膠制備
(1) 取O. 72g瓊脂糖溶于56. 7ml的M0PS中，加熱融解后冷卻至60。C左右，加入37%甲醛溶液 3. 3 ml于制膠盒中冷卻。
(2) 取30nL RNA加入等體積的上樣緩沖液中混勻。
(3) 65。C溫育15min后，立即放入冰洛中冷卻，離心5s。
(4) 加樣前，將凝膠預電泳5min,隨后將樣品加至凝膠加樣孔。
(5) 將凝膠浸入1X甲醛凝膠電泳緩沖液中，3-4V/cm電壓電泳。
(6) 電泳后取出凝膠，用DEPC處理水淋洗數次，每次3min。
(7) 將凝膠在20xSSC中浸泡兩次，每次15min,除去凝膠中的甲醛。
(8) 將尼龍膜在20xSSC中浸泡30min。
(9) 利用虹吸式轉膜法轉膜過夜。
(10) 轉膜后，用2XSSC于室溫下泡膜5-10min,夾于兩層濾紙間晾干，然后在8(TC烤2h或 紫外照射5min以固定RNA。
5.3.2分子雜交
(1) 預熱適宜體積的DIG Easy Hyb (10 mL/10 cm2膜)至68。C，在雜交管中輕輕搖動膜預 雜交30min。
(2) 煮沸地高辛一標記DNA探針5min，快速冰/水浴冷卻，使之變性(大約25ng/ mL DIG Easy I-Iyb)。
(3) 加變性地高辛標記DNA探針至預熱的DIG Easy Hyb (3.5 mL/100 cm2)膜中，充分混 勻并避免產生泡沬。
(4) 倒掉預雜交液，把探針/雜交混合液加至膜上，在雜交爐中，68'C溫育4h或過夜，并 混合搖動。
5. 3. 3免疫學檢測
(1) 分別用2XSSC和0. 5XSSC洗膜，每次5min后，再在清洗緩沖液中沖洗尼龍膜1-5min。
(2) 在10OmL封閉溶液中溫育3 Omi n 。
(3) 在20mL抗體溶液中溫育30min。
(4) 在100mL漂洗緩沖液中洗15min。
(5) 在20mL檢測緩沖液中平衡2-5min。
(6) 膜上滴加顯影液，15-25。C溫育5min后，37°C溫育濕膜10min。
(7) X光片于5-25。C顯影15-25min。
實施列5 (/c/z^5基因在辣椒疫病病葉內翻譯表達水平的Western Blot檢測)
1、 辣椒疫病病葉總RNA提取方法同上
2、 Pci;^ 5基因表達蛋白特異抗血清制備
(1)將制備的/^/;^ 5基因表達純化蛋白稀釋至lmg/mL,制成抗原液。(2) 取適量純化蛋白液按1:1比例加入弗氏不完全佐劑進行孵化，孵化45min左右，制備約 含有50(^g/mL表達產物的抗原油乳劑。
(3) 取l只健康家兔用乳化的戶c/;^ 5基因表達蛋白進行免疫，連續免疫3次，每次免疫間 隔時間為l周，l周后進行第4次免疫，兩周后取血。
(4) 將血樣放置于4。C冰柜，過夜沉淀，然后吸取適量血清。
(5) 利用瓊脂擴散方法檢測制備的血清效價和專化性。 3、 Western Blot
3.1 SDS-PAGE電泳分析同上。 3.2電轉移步驟■
(1) 切取與凝膠大小一致的硝酸纖維素膜(NC膜)于甲醇中浸泡30min，使膜至半透明。
(2) 濾紙和海綿浸泡于電轉緩沖液PBST (lOOmL的PBS緩沖液中加入Tween-20 50ul混合均 勻)中至使用。
(3) 釆用電轉液(25mM Tris PH8. 0, 192mM甘氨酸，20。/。甲醇)進行轉化。
(4) 轉化過程，先用100V電壓150mA電流轉移l-2h,然后用100V電壓240mA電流轉化30min。
(5) SDS-PAGE電泳后，將凝膠置于雙蒸水中清洗2次。
(6) 按照海綿墊，濾紙，凝膠，NC膜，濾紙，海綿墊的順序，將凝膠固定于電轉移儀上， 加入l. 5L電轉緩沖液。
(7) 按照凝膠為負極，NC膜為陽極的順序電泳，電轉反應在4'C下進行。 3.2融合蛋白與一抗結合步驟
(1) 取NC膜浸泡于15ml阻斷緩沖液(PBST緩沖液中加入脫脂奶粉，加入比例為w/v-5: 100),然后水平緩慢振蕩l-2h。
(2) 用25ml PBST緩沖液洗脫表面封閉液3次，每次洗脫5min。
(3) 將膜轉至含一抗的溶液中， 一抗配置參照其效價，按照1:1000比例與阻斷緩沖液均勻 混合，然后水平緩慢振蕩2-3h。
(4) 用20ml電轉緩沖液洗脫NC膜，每次5rain。 3. 3二抗結合與顯色
(1) 含有一抗的NC膜轉至二抗(HRP標記的羊抗兔IgG)溶液中(二抗溶液用阻斷緩沖液按 照l: 200比例稀釋)，室溫緩慢搖動2-3h。
(2) 用電轉緩沖液20 ml洗脫3-4次，每次5min,并將膜轉移至黑暗處。
(3) 按照北京希凱公司提供的DAB顯色試劑盒進行顯色操作，將膜轉至其中，黑暗條件下 顯色5-20min。
(4) 待蛋白條帶顯色清晰時，用20ml (1犯20終止反應，然后用數碼相機或凝膠成像系統照相。
實施列6 (戶"/w 5基因表達純化蛋白對辣椒葉片的破壞作用和細胞壁降解)1、 戶c々w 5基因表達純化蛋白接種辣椒葉片操作
(1) 將戶c/;^ 5基因表達純化蛋白稀釋至濃度為700 //g/mL。
(2) 利用針刺法，將適宜濃度的表達純化蛋白接種于4-6葉期的辣椒葉片。
(3) 采用同樣接種方法，將辣椒疫霉游動孢子懸浮液(濃度為lxl05mL)、 700wg/mL的鈍 化蛋白、無菌水接種于同時期的健康辣椒葉片。
結果表達純化蛋白對辣椒葉片具明顯的破壞作用，導致接種葉片皺縮，而經鈍化后的蛋 白與無菌水一致，對辣椒葉片幾乎無任何破壞作用。
2、 A，//^ 5基因表達純化蛋白對辣椒葉片的破壞癥狀及降解細胞壁的透射電鏡觀察 2. 1癥狀觀察
(1) 接種蛋白的辣椒葉片癥狀觀察。
(2) 接種游動孢子的辣椒葉片癥狀觀察。
(3) 陽性、陰性對照辣椒葉片癥狀觀察，綜合比較Pcipg 5基因表達純化蛋白對辣椒葉片 的破壞作用。
2.2透射電鏡觀察
(1) 取樣和固定蛋白接種辣椒葉片l-7d期間，間隔24h取樣一次，所取小塊樣品放入2. 5%
戊二醛溶液中，抽氣，確保細胞迅速固定。
(2) 脫水步驟:70y。丙酮15min—8(W丙酮14min—90y。丙酮15min—100y。丙酮2 x 10min,確保
包埋介質完全滲入細胞內，將細胞內水分全部驅除。
(3) 浸透和包埋步驟將脫水處理的材料于環氧樹脂和十二烷基琥珀酸酐浸透ld后，在多 孔橡膠包埋模板中處理，然后于45'C烤箱內處理12h,再于60'C烤箱內處理36h使樹脂聚合硬 化，形成包埋塊。
(4) 切片及染色
① 修塊將包埋塊至于夾持器中，解剖鏡下將組織置于45度角度，除去包埋劑，并修成 推體形。
② 半薄切片定位利用超薄切片機將處理材料切制成厚度為l-10um的切片，然后用小毛 刷移置于載玻片上，加溫使切片展平，待干燥后，用甲苯胺藍染色，然后光學顯微鏡觀察定 位。
③ 超薄切片用自動切片機將切片切制后，放置于載網膜上。
染色用醋酸鈾對超薄切片染色。 '
(5) 電鏡觀察、照相
① 觀察將制作完備的超薄切片于3萬倍透射電鏡下觀察細胞壁的降解。
② 照相選擇細胞壁得到明顯降解的材料進行照相，其結果如圖6所示。〈110〉山東農業大學
〈120〉辣椒疫霉果膠甲基酯酶Pcipg 5基因、蛋白的制備方法及其應用
<160>10
<210>1
<211〉1086
<212〉腿
<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici) <220>
<221>sig_peptide
<222>(1)...(60)
<221>CDS
<222>(1)".(1086)
<400>1
"g aag Met Lys 1
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240
288
336
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
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<210〉2
<211〉361
<212>PRT
<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici) <220〉
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1
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Lys
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<211〉22
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<213〉人工序列
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400〉10
cgctccgtca ggatcttcat c 2權利要求
1.一種辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg 5基因，其特征在于該基因所編碼的蛋白質具有導致辣椒葉片受害部位產生皺縮和壞死，并使葉片受害部位的細胞壁得到明顯的降解，其基因序列如Seq ID No1所示；其蛋白質氨基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2. —種辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶^c/;^ 5基因分離克隆及其蛋白質的制備方法， 其步驟如下1) 5基因分離克隆的具體步驟A:釆用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，用QIAEXII GEL Extraction Kit試劑建議構建基 因組DNA文庫，將大小為1. 5Kb-3. 0Kb的DNA片段連接于載體PUC19，轉化大腸桿菌DH5 a , PCR鑒定文庫質量。B:根據已報道植物、細菌、真菌的多聚半乳糖醛酸酶基因保寺序列，設計簡并引物P710 (其序列如Seq ID No: 3所示)和P1150R (其序列如Seq ID No: 4所示)，利用Pooling-PCR 技術篩選DNA文庫，陽性克隆測序獲得基因全長序列。2) 制備蛋白質的具體步驟A:尸c々w 5基因酵母表達載體的構建，目的基因克隆至表達載體pPIC9K中。 B:將上述重組表達載體線性化后，轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，酵母轉化子甲醇利 用表型的平板篩選。C:酵母轉化子的培養和多聚半乳糖醛酸酶的甲醇誘導表達，表達產物生物學活性檢測、 SDS-PAGE分析，多聚半乳糖醛酸酶純化。
3. —種由尸c/p《5基因編碼的蛋白質，應用于對接種辣椒葉片破壞和受害部位的細胞 壁降解作用檢測。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，特別提供了1個克隆自辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶基因Pcipg 5及其蛋白質制作技術。立足于基因和蛋白質水平，證明了該基因有效的參與了辣椒疫霉菌侵染辣椒寄主及其導致辣椒葉片疫病病程發生的過程，立足于植物病理學和細胞化學技術進一步證明了該基因編碼的蛋白質接種于辣椒葉片后，使葉片接種部位產生了明顯的枯萎、皺縮癥狀，并使受害葉片部位的細胞壁得到明顯的降解，即該基因編碼一種重要的病程相關蛋白，或者可能是辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因簇的一個重要靶標致病基因，本發明為進一步研制辣椒疫霉菌分子檢測技術提供了重要的技術儲備。
文檔編號C12N15/56GK101638662SQ20091001799
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月2日 優先權日2009年9月2日
發明者張修國 申請人:山東農業大學