一種降解農藥多菌靈的酶及其編碼基因與應用的制作方法

專利名稱：一種降解農藥多菌靈的酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可降解農藥多菌靈的酶及其編碼基因與應用，屬于生物降解技術領域。
背景技術：
在農藥的使用過程中，殘留在自然界中的農藥對環境造成了極大損害。自然界中的微生 物在環境生態的修復方面具有不可忽視的作用，同時展開其相關酶系的研究，建立工業化的 微生物降解技術具有極大的應用前景。在對微生物的相關酶系的研究中，P450酶及其還原 酶具有廣泛的降解苯類衍生物的功能，通常P450酶系參與的降解反應主要有羥化作用，環 氧化作用，雜原子氧化，脫烷基化，脫鹵，環氧化，硫氧化及還原作用等。目前，全世界有 機磷農藥商品己達上百種，特別在殺蟲劑方面，有機磷類為殺蟲劑三大支柱之一，并長年來 鰲居首位，在我國其在各類農藥中所占比例亦為最大。有機磷農藥具有抑制人體乙酰膽堿酯 酶的功能，對人體存在著不同程度的毒性。為此，近年來農藥生產中產生的有機磷農藥廢水、 使用過程中其在農產品中的殘留和對環境造成的污染越來越受到人們的重視。
自從5種高毒,機磷農藥禁用以后，多菌靈以其高效、廣譜、中等毒性的特點逐漸被用 戶認可，并被廣泛應用于水稻、果樹、蔬菜等糧食和經濟作物害蟲的防治中，已經成為取代 甲基對硫磷、甲胺磷等高毒有機磷農藥的主要產品.但是，不能忽視多菌靈在生產及使用過 程中對環境污染產生的壓力。目前，我國農藥企業每生產lt 多菌靈原藥大約產生20t廢水， 其中既含有多菌靈也有多種中間體。因此，多菌靈生產的廢水處理問題成為制約多菌靈生產 的瓶頸。對多菌靈在環境中的降解行為研究結果顯示，其在土壤中的降解半衰期為1(T278d 不等，在水體中的降解半衰期為25.6d，表明該藥劑使用后不僅在農產品中會產生較大的殘 留毒性問題，也會對農田環境及有益生物產生不良影響，甚至被認為會導致干擾人體內分泌。 因此，在該藥劑的生產和使用中更應重視其殘留降解和環境治理問題。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種快速高效降解農藥多菌靈的酶及其編碼基因與應用。
一種降解農藥多菌靈的酶，它具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。 一種編碼上述降解農藥多菌靈的酶的基因，它具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。 含有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的表達載體。SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列均可導
入市售的各種表達載體中。
含有上述表達載體的工程菌株。可通過常規方法，用上述含有SEQIDNo.2所示核苷酸
序列的表達載體改造工程菌株，使其具有降解農藥多菌靈的功能。
上述降解農藥多菌靈的酶在處理生產多菌靈產生的廢水和降解多菌靈方面的應用。 上述工程菌株在處理生產多菌靈產生的廢水和降解多菌靈方面的應用。 本發明的酶可以高效快速的分解農藥多菌靈，為降解有機磷農藥提供了一種可靠、高效
3的途徑，并且可以將本發明所述的基因用于改造工程菌株，培養具有分解農藥多菌靈功能的 工程菌株，為農藥多菌靈的大規模生產與應用鋪平道路。


圖1構建的P450/P450還原酶的載體示意圖2 BC002 p450酶及p450還原酶的可溶性異源表達；
圖3 NADPH表征酶活； .
a. NADra表征P450還原酶的酶活Y = A + B * X ( A: 0.69846; B: -0.00239)
b. NADPH表征P450酶活Y = A + B*X(A: 0.52157; B: -0.00249)
圖4 PNOD活性測定；
a. P450還原酶PNOD活性測定Y = A + B * X (A: 0.0785 ; B: 1.43842E-5)
b. P450 PNOD活性測定Y = A + B * X (A: 0. 06877 ; B: 3. 49206E-6)
圖5 HPLC檢測P450及其還原酶的活性； a.NADPH標品檢測，b. NADPH與P450 、P450 reductase混合體系，c. P450、 P450 reductase 對照，d.NADPH 、 P450、 P450 reductase、多菌靈混合體系，e. P450、 P450 reductase、多 菌靈混合體系，f.多菌靈
圖6 HPLC—MS分析結果；
a. 是HPLC洗脫時間分別為7. 6min-7. 7min和洗脫時間為8. 2-8. 4min的MS檢測圖，
b. 是HPLC洗脫時間分別為8. 6min-8. 7min和洗脫時間為8. 7-9. lrain的MS檢測圖7多菌靈經混合酶系降解后的MS檢測結果；
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述，實施例中的實驗方法及試劑如無特殊說明，均 為本領域常規方法與市售試劑。 實施例
1材料與方法
NaCl、 K2HP04 、 MgS04 CaC03、蛋白胨、酵母膏均為普通市售產品，多菌靈為購
自上海楚定分析儀器有限公司公司的標準品。 1. 1材料
本研究中分離到一株能高效降解多菌靈的細菌，具體分離步驟如下-1. 1. l富集培養基 .
NaCl 1.0 g,K2HP041. Og, MgS04 7H20 1.0g,CaC03 1. Og，多菌靈(多菌靈 先用少量lmol/L稀鹽酸溶解設5個濃度梯度，分別為200rag/L， 400mg/L， 500mg/L, 600mg/L， 800mg/L)，蒸餾水1000mL， pH7.0。
1. 1.2分離純化培養基
NaCl 1.0g,K2HP04 1. Og, MgS04 7H20 1. Og， (NH4)2S04 2. Og, CaC03 1.0g，多菌靈(5個濃 度梯度同富集培養基)，瓊脂20g,蒸餾水lOOOmL, pH 7.0。 1.1.3 LB培養基
蛋白胨10g, NaCl 10g ，酵母膏5g ，蒸餾水lOOOmL， pH6. 8-7. 21.1.4多菌靈降解性試驗培養基.
NaCl l.Og ,K風l.Og' MgS04*7H20 1.0g， (NH4)2S04 2. 0g, CaC03 l.Og,酵母膏O. 15 g，多菌靈500mg，蒸餾水1000mL， pH 7.0。 1.1.5多菌靈降解菌株的富集、分離和純化
在75ml不同濃度梯度的多菌靈富集培養液中分別加入7.5g土樣(取自山東華陽科技有 限公司，土壤也為取自該公司的污水池)，3CTC，200r/rain搖床培養3d后，吸取lmL轉接至相 同濃度的多菌靈富集培養液中，連續富集、轉接5次后，用接種環蘸取少許富集培養液，在 相同濃度的多菌靈分離純化培養基平板上劃線分離，28-3(TC培養，待平板上出現單菌落后， 挑取單菌落轉接至多菌靈分離純化斜面培養基上，連續轉接、傳代5次，仍能在多菌靈培養
基上生長的菌種選用。
經細菌的16S rRNA序列的比對發現該細菌為蠟狀芽孢桿菌。該蠟狀芽孢桿菌能在多菌 靈為唯一碳源的細菌培養基中生長，并在細菌的基礎培養基中，能高效降解多菌靈。命名為 錯狀芽抱桿菌BC002 (5" 7ws cerews BC002)。
大腸桿菌DH5 a購自濟南聯星生物、大腸桿菌BL21購自濟南聯星生物和pET28a載體購 自濟南聯星生物；PMD18-T載體購于TakaRa公司，Nde I和BamH I ， T4連接酶購于 fermentas公司。Tryptone， yeast extract,瓊脂糖購于濟南聯星公司。NaCl，甲醇，乙 醇，乙酸等試劑均為國產分析純。
1. 2引物的設計及基因的擴增
根據已知的芽孢桿菌的基因序列設計16S rRNA基因的鑒定引物Pl， P2。根據己知的 P450及P450還原酶的保守基因序列設計引物，引物序列如下 16S rRNA引物
Pl: atgaacatagaac肪tttcaatcta P2r ttatttttcaataggtaattt3ttggg
P450引物
CYP-ENZ1.' CTGGcatAtggcttcgcctgaaaatgtga CYP-ENZ: actcGGATCCTCTtgagttUtaagcaga; P450還原酶引物
CYP-RED1: CTGGcatAtgatggataaaaaagtatctgcta CYP-RED: actcGGATCCTCTtataccagcccaaacatctttt; PCR反應體系及條件
向PCR小管中按照如下配比加入PCR反應物0.25plTaq酶，2. 5 u 1 10XPCR buffer, lyl P450引物/P450還原酶引物，20.25yl滅菌雙蒸水。反應總體積為25ul, 95°C預 變性2min, 95°C 20s， 55°C 40s， 72°C 40s， 28個循環，72°C 5min，瓊脂糖凝膠電泳檢測 擴增產物。
1. 3序列的測定
將克隆到的基因經PCR產物純化試劑盒純化后的片段連接T載體，反應體系為產物1 uL，PMD18-T載體O. 5uL，連接酶0. 5uL，滅菌雙蒸水8 u L，反應總體積10 u L， 16 °C 30min，反應后的產物與大腸桿菌DH5a'的感受態lOOixL均勻混合，42'C熱激90S，37'C復 蘇培養45min后，涂布氨卞青霉素的LB固體平板，37'C培養16h后挑取單菌落進行菌落PCR
的鑒定。
5PCR鑒定反應體系及條件
重組子的鑒定采用PCR檢測法。用牙簽挑取培養后的大腸桿菌單個菌落，在另一卡那抗 性的LB固體培養基上接種，并在滅菌的PCR小管的管壁上輕輕蘸取，使菌落沾到PCR小管 的管壁上。向PCR小管中按照如下配比加入PCR反應物0.25ulTaq酶，2. 5u 1 10XPCR buffer, 1 u 1 P450引物/ P450還原酶引物，20. 25 u 1滅菌雙蒸水。反應總體積為25" 1, 95°C預變性2min, %。C 20s， 55°C 40s， 72°C 40s， 28個循環，72°C 5raim瓊脂糖凝膠 電泳檢測PCR的陽性克隆。
1. 4表達載體的構建
將帶有酶切位點的PCR片段和pET28a分別用Nde I和BamH I雙酶切作用4h，酶切后 的產物分別用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。回收后的產物按照如下體系進行連接 P450酶切片段/P450還原酶酶切片段3uL, pET28a的酶切片段1 w L， T4連接酶0.5" L，滅菌雙蒸水5.5uL，反應體系10yL， 16'C連接10h。反應后的產物與大腸桿菌DH5 a的 感受態100uL均勻混合，42°C熱激90S, 37°C復蘇培養45min后，涂布氨卞青霉素的LB 固體平板，37'C培養16h后挑取單菌落進行菌落PCR的鑒定。PCR鑒定反應體系及條件同步 驟1.3。
1. 5蛋白表達
將鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21，轉化后的菌落鑒定為目的片段插入陽性的 克隆后，挑取單菌落在5ml的LB氨卞液體培養基中培養10h，轉接至500ml的LB氨卞液體 培養基中培養至對數生長期，向對數生長期的菌體培養液中加入IPTG使其終濃度為0. 2mM， 16'C誘導12h。 3， 500rpm離心收集誘導表達后的菌體，用PBS重懸后，超聲破壁，超聲的 程序為2S， 2S， 15min。超聲后的菌體混懸液12000 rpm離心，分別收集上清液和沉淀，上 清液進行SDS-PAGE檢測。
1. 6用NADPH的消耗表征酶活
由于NADPH在340nm有最大的光吸收，隨著輔酶的消耗，溶液在340 nm處吸光值下 降，而且在反應最初的2min內呈線性關系，因此，可以通過求吸光值曲線的斜率就可以計 算出酶活。在比色皿中加入2ml lmM的月桂酸鈉溶液(溶于Tris-HCL或PBS溶液)然后加 入50 " 1的6mM的NADPH溶液，在添加50 " 1酶液之后，立刻測定340nm的吸光光度下 降，每隔15S取一個測量值，測量時間為120秒，摩爾消光系數為6.22mM"cm'1。
定義將在37。C下，每分鐘催化反應消耗lraMNADPH所需要的酶量為lU，則可以通過
下面的公式計算酶活
酶活的計算公式為:((dA/dT) 34。* (V底物+V麵+V酶液))/ (6. 22* V隨液) 1. 7 PNOD的活性測定
每樣依次加入IOO iil2 uM對硝基苯甲醚(先溶于少量的乙醇，再取少量溶于預熱的 0.1 M的pH 7. 8的磷酸緩沖液)90 u 1的細胞酶液和1 u 1的9. 6 raM的NADPH.酶標儀在 405波長下，每隔25 S紀錄一次光密度值，共紀錄26次，反應溫度為30。C。
1. 8酶活性的測定
在lnil的反應體系中加入純化后的P450及P450還原酶的混合酶系各5P L,多菌靈5mg, DMSO 100uL， 反應1.5h后，乙酸乙酯萃取三次，真空抽干，HPLC和MS檢測甲醇溶解的產物。2試驗結果
2. 1基因的序列測定與比對
將克隆到的16S rRNA序列在BLAST上進行比對發現分離到的芽孢桿菌與蠟狀芽孢桿菌 的序列最為接近，核苷酸的同源性為98%。將該細菌的P450及P450還原酶的基因采用兼并 PCR的方法將其克隆出來并進行測序表明，該細菌的P450核苷酸序列與——具有99%的同源 性，其P450還原酶的核苷酸序列與——具有98%的同源性。將克隆到的酶的基因克隆入表 達載體pET—28a中，構建蛋白的表達載體，構建成功的載體如圖(圖l)。
2. 2酶的純化與活性檢測
將該兩者的基因進行大腸桿菌的異源表達，得到可溶性的活性蛋白(圖2)。 P450酶在 37°C 0.5 mM IPTG誘導下生成包涵體，通過蛋白的變性復性試驗將以包涵體形式表達的蛋 白變為可溶性蛋白，用于酶的活性測定的下一步試驗中。通過酶與NADPH的反應發現，P450 與P450還原酶均能與NADra反應，測得光吸收曲線如圖3。
采用對硝基苯甲醚測所得的酶得PNOD活性，酶標儀在405波長下，每隔25S紀錄一次 光密度值，共紀錄26次，反應溫度為'3(TC，測得特異的光吸收曲線如下(圖4)。
HPLC檢測反應產物發現分離純化后的P450及其還原酶具有降解多菌靈的作用(圖5)。 在沒有酶加入的條件下，NADPH在3(TC的水浴條件下，表現穩定，沒有出現明顯的降解反應 (圖5a)。加入酶后，NADPH特異性的280 nm處的光吸收值急劇下降(圖5b),在樣品處理 過程中，采用酶的PBS緩沖體系作為對照，經過乙酸乙酯萃取，吹干后的殘留物經甲醇融解， 并HPLC分析發現，有一小的吸收峰(圖5c)，該吸收峰出現的時間與多菌靈在未加NADPH 的反應體系中的第一個吸收峰的出現時間一致，但峰面積相差將近一倍，由此推測在未加 NADPH的體系中，該酶能夠降解少量的多菌靈，產生極性比較大的產物(圖5e),在NADPH 加入的反應體系中，通過HPCL分析發現多個出峰時間緊密相聯的吸收峰，在NADPH出峰的 時間之前出現了兩個無法分離的產物峰，將d圖中的出峰時間在7fflin — 15niin的峰進行MS 分析，得到了如下推測的多菌靈降解產物結構式-
^^fa* HN <^1011^+
f、 ' \ Exact Mass: 157.1 - Mol.Wt.: 1S7.2
HC,61.14;H， 6.41;N, 17S2;N、 14.63 通過對不同出峰時間的產物進行MS分析，按照MS提供的分子量，推測多菌靈降解之后
的產物的分子量可能為122. 1， 124. 1， 118. 1， 157. 1, 132. 1，從而推測出多菌靈降解后的產物 的可能的分子式如下
NHCH00CK3
H
Exact Mass: 118.1 Mol.Wt.: 118.1
/e: 118.1 (100.0%), 119.1 (8.6%) L ra^: 122.1 (100.0%)， 123.1 (8.7%)
C,71.17;H,5.12;N,23, 1 . \^、NH￡， 68.82; H， 8.25; N， 2293
Exact Mass:22.1 Mol. Wt.: 122.2
7NH2
c顯p
Exact Mass: 124.1 i M。l. m: 124.1
m/e: 124.1 (100.0%), 125.1 (7.6%) C, 53.05; H， "0;N'2257;O, 12.89
Exact Mass: 191.1 Mol. Wl.: 191.2 ra/e:(100.0%)，92.1 (11.3%) 'N、 C，5&54;H，4.74;N'21.98;0, 16.74
Exact Mass: 157.1 Moll: 157.2
(/ m/e: 157.1 138.1 (9夠 HC'61.14;H，6.41;N，1732;N、 14.63
、)—— CSH8N2 / Exact Mass: 132.1 Moll: 132.2 m/e: 132.1 (IOO夠，133.1 (9.8%) C, 72.70; H, (5.10; N, 21.20
將未加NADPH的反應體系的反應產物進行MS分析，根據得到的分子量進行產物的推測 (圖7)。在降解反應之間，多菌靈的產物較均乙，分子量與理論值一致，在降解后的產物 中出現了多個不明結構的分子量，其中179.1,157. 2與NADPH參與的降解反應的產物大小一
致，從而能夠推測出其分子式如下
f、 \ Exact Ma :
^- Mol.Wt.: 1S7.2
/ m/e: 157.1 (咖呵138.1 (9.8%) HC,61.14;H， S,41;N,17S2;N^ 14.63
經分析發現，分離純化的P450及P450還原酶能夠與NADPH發生反應，表明分離到的酶 具有初步的活性，通過底物降解多菌靈的試驗證實，該酶能夠降解多菌靈，通過HPLC分析 發現，在反應6h后，從反應的產物中檢測到產物的生成，在沒有NADPH參與的條件下，該 酶同樣具有降解多菌靈的微弱活性。通過酶的PN0D活性的測定，發現該酶的活性較低，同 時也解釋了在多菌靈的降解試驗中，檢測到的反應產物量比較低的原因。基因序列
<110> 山東大學
〈120〉 一種降解農藥多菌靈的酶及其編碼基因與應用
<160> 8
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211> 404
<212〉 PRT
<213〉 5"7/"s ce潔s BC002
<400〉 1
Met Ala Ser Pro Glu Asn Val lie Leu Val His Glu lie Ser Lys Leu
15 10 15
Lys Thr Lys Glu Glu Leu Trp Asn Pro Tyr Glu Trp Tyr Arg Leu Met
20 25 30
Arg Asp Asn His Pro Val His Tyr Asp Glu Glu Gin Asp Val Trp Asn
35 40 45
Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Asn Arg Val Leu Ser Asp Tyr Arg Leu
50 55 60
Phe Ser Ser Arg Arg Glu Arg Arg Gin Phe Ser lie Pro Pro Leu Glu 65 70 75 80
Thr Arg lie Asn lie Asn Ser Thr Asp Pro Pro Glu His Arg Asn Val
85 90 95
Arg Ser lie Val Ser Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ser Leu Glu Gin Trp
100 105 110
Lys Pro Arg lie Gin Ala lie Ala Asp Glu Leu Val Gin His lie Glu
115 120 125
Lys Cys Ser Glu Val Asn lie Val Glu Gin Phe Ala Ala Pro Leu Pro 130 135 140Val Thr Val lie Ser Asp Leu Leu Gly Val Pro Thr Thr Asp 145
Lys lie Lys Glu
Asp 150
Ser Asp lie Leu
Trp 165
Lys Phe Asn Asp Leu Asp Ala Glu 180
Leu Leu Pro lie
Pro 155
Met Pro Tyr Ser
Lys Ala Tyr 195
Asp Asp lie lie Ser Asp 210
Leu Thr Asp Glu Glu
225
Gly Asn Glu Thr
Phe 170
Lys Gly lie Ala Leu 185
Gin Glu Lys Arg
Val 200
Leu lie Arg Ala Glu 215
Val Thr Phe Ser
Arg Lys 160 Lys Glu 175
Asn Glu Phe 190
Tyr His Leu Thr 205
Glu Gly Glu Arg
lie 230
Thr Asn Leu lie
Tyr 220
Gly Leu Leu
Thr 245
Leu Val Asp Ser Pro Gly lie Tyr 260
Lys Ala lie Glu
Leu 235
Asn Ser Phe Tyr Cys Phe
Ala Ala 240
Leu lie Ser 275
Thr Leu Ala Arg Arg lie 290
Met Lys Lys Asp Gin 305
Asp Glu Lys Lys
lie 250
Glu Glu Leu Arg Lys 265
Val Leu Arg Tyr
Cys 255 Pro
Asn
Glu 280
Thr Glu Asp Thr Asn 295
lie Val Ala Trp
Glu 270
Phe Pro Val
Arg 285
Phe Gly Pro Leu
Met 310
Ser Gin Ala Ser
lie 300
Ser Ala Ala Asn
Gly Asn Glu Glu 340
Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu 355
Thr Phe Glu Lys
Phe 325
His Leu Thr Phe Gly Lys Gly Pro His
Gin 330 Lys
Val 315
Phe Asn Val His
Gly 345
Ala Glu lie Ala
Arg 335 Cys
Leu 320 Thr
Leu
lie Asn 370
Lys Cys lie Leu Glu 385
Leu Lys Thr Gin
Glu 360
Glu Leu Ser Pro
Asn 390
lie 375
Glu Gin Thr Leu
Phe 350
Leu Thr Thr Phe 365
Phe Cys Leu Glu
Lys 395
Ser 380
Tyr Leu Pro lie
Cys 400
10<210> 2
<211> 1215
〈212> 腿
<213> S"7k ce，s BC002
<400〉 2
atggcttcgcctgaa犯tgttattttagttcatgaaatttca^gctg犯60
gaMtatgg3atccatatgaatggtatcgtttgatgaggg3gttC3tt3t120
gatga卿gcg犯tgttttttt3t3tgatg3tgt3犯tCgtgttttstca180
gattatcgcttattttcaagtag犯gggsgCgC3g3C朋ttctcaatccctcctttagaa240
actag肌taaatataaactctacagatccaccagaacatcgcaatgtacgttccattgtt300
tctaaggcatttactccaagEl3gttt3g犯cagtgga犯cctcgaatacaggctatcgca360
gatg犯cttgtacaacatatcga犯aatgt3gtgaagtt3atatcgttgaacagtttgct420
gcgcctttacctgttaccgttatttctgattt8tt8gg3gtccc肌caac480
aaa^tta^agaatggtctgatattttatttatgccgtatagtttaatgat540
ctggatgccg3gC3ttaaatgaattca犯gcataccttttaccgattgtt600
cagg3aa^g3gatatcatttaaccgatgatatcatatctgattt犯ttcgagctgaatat660
gaaggcga肌gattaaccgatg3ggaaattgt犯ccttttcattaggtttactagcggct720
ggg肌tg犯attt犯ttattaatagcttttattgctttttagtagattca780
cctggaatttcctaactt犯tttc犯aagcgattgagg犯840
gtattscgctatcgctttcctgttacattggcccgg鄉att3C￡Lg8gg￡ltacaaatata900
tttggtccttggatc卿tgattgttgcgtgggttagtgc960
aattttcacaagcctctcaatttaatgtac3tCg犯C3gg1020
catttaacctttggg犯aggtcctcacttttgcttaggagcaccacttgc3Cgttt8g3g1080
gctgagattgcattaactacacttttga犯atctccatct1140
ttctgtttagg犯c朋acatacctatctgc1200
t taaaaac t caataa
1215
〈210〉 3 〈211> 25 <212> DNA <213>人工合成
11<400> 3
atgaacatag aacaatttca atcta 25
〈210〉 4
<211> 27
<212〉 DNA <213>人工合成
<400〉 4
ttatttttca ataggtaatt tattggg 27
〈210〉 5
<211> 29
〈212> DNA <213>人工合成
<400> 5
ctggcatatg gcttcgcctg aaaatgtga 29
<210> 6
<211> 29
〈212〉 腿 <213>人工合成
<400> 6
actcggatcc tcttgagttt ttaagcaga 29
<210〉 7
<211> 32
〈212〉 醒 <213〉人工合成
<400〉 7ctggcatatg atggataaaa aagtatctgc ta 32
<210> 8
<211〉 35
<212> DNA <213>人工合成
<400> 8
actcggatcc tcttatacca gcccaaacat ctttt 3權利要求
1、一種降解農藥多菌靈的酶，它具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權利要求l所述降解農藥多菌靈的酶的基因，它具有如SEQ ID No. 2所示 的核苷酸序列。
3、 含有權利要求2所述的基因的表達載體。
4、 含有權利要求3所述表達載體的工程菌株。
5、 權利要求1所述的降解農藥多菌靈的酶在處理生產多菌靈產生的廢水和降解多菌靈 方面的應用。
6、 權利要求4所述的工程菌株在處理生產多菌靈產生的廢水和降解多菌靈方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種可降解農藥多菌靈的酶及其編碼基因與應用，屬于生物降解技術領域。本發明提供一種可降解農藥多菌靈，具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的酶，以及編碼該酶的基因片斷，該片斷序列為SEQ ID No.2所示。上述酶和基因片斷可應用于處理生產多菌靈產生的廢水和降解多菌靈方面的應用。
文檔編號C12N9/02GK101649306SQ20091001840
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月15日 優先權日2009年9月15日
發明者于彩虹, 欒婧婧, 汪未申, 敏 陳 申請人:山東大學