專利名稱：一株點青霉菌株及其在生物轉化桑葉黃酮苷中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，特別涉及一林點青霉菌抹及其在生物轉化桑葉 黃酮苦中的應用。
二背景技術：
現有技術桑樹資源的藥用在我國歷史悠久，將其作為天然藥物加以應用非 常廣泛。我國是桑樹的起源中心，桑樹的種質類型豐富多樣，我國桑屬植物有15 個種4個變種。國家種質鎮江桑樹圃現保存有12個桑種、3個變種的各類桑種質 1900余份。我國大部分地區均有桑樹分布與栽培，全國桑園面積約1000萬畝， 其中以江蘇、浙江、四川等主產區產量最多。桑葉是桑樹生物產量最大的部分， 在實際蠶桑生產中，往往出現桑葉過剩的情況，這造成資源的極大浪費。若對這 些資源加以充分利用，其經濟效益與社會效益均相當可觀。現代藥理研究發現， 桑葉提取物在治療糖尿病、高血壓、高血脂等癥及抗衰老、抗病毒、抗炎等方面 都具有良好的療效，這與桑葉中的黃酮、多糖和生物堿等有效成分密切相關，其 中桑葉黃酮的藥理活性最為顯著。因此，近年來人們已經開始越來越多地關注到 桑葉黃酮資源的綜合利用與開發。
桑葉黃酮主要是由槲皮素和山奈酚等為苷元的糖苷類黃酮香組成。生物利用 度研究表明，天然糖苷類的分子結構并不是其活性發揮的最佳形式，苷元才是活 性發揮的最佳形式，因為苷元更容易被人體吸收，在人體內具有更高的生物利用 度。因此，如果能夠在體外將糖普型桑葉黃酮轉變為苷元型黃酮，就可以增強桑 葉黃酮的生物活性。雖然在酸性或堿性條件下糖苷鍵可以斷裂，并且反應得率也 很高，但在酸或堿性條件下桑葉黃酮苷元的穩定性較差。另外，在強酸或強堿條 件下也不易進行工業化生產。由于酶反應有其獨特的優勢，不i"又作用條件溫和， 而且多采用弱酸性緩沖溶液，桑葉黃酮苷元也不易變性。因此，尋找一種通過微 生物轉化或酶促水解生產桑葉黃酮苷元的高效、環境友好的工藝方法就顯得十分 迫切和必要。目前，對桑葉黃酮苷的提取分離方法報道較多，如CN 1683360、 CN 101244124公開了釆用大孔樹脂吸附法分離桑葉黃酮的方法，CN 1762428公開了 采用超臨界C02法從桑葉中提取桑葉黃酮和生物堿，CN 101214279公開了采用 超聲波輔助萃取法提取桑葉黃酮和多糖的方法；對糖苷酶催化水解的研究則主要 還集中在對酶學、催化等性質方面的研究，如CN 1483825公開了采用酶法水解 ，丁制備異槲皮素和槲皮素的方法，CN1229086公開了采用酶法水解人參鳥苦糖 基制備稀有人參皂苷的方法。然而，對于采用微生物或酶法轉化桑葉黃酮苦制備 高活性苷元的研究未見報道。
雖然現有技術表明微生物能夠產生糖苷水解酶，但產量及轉化率報道很不穩 定，對桑葉黃酮苷轉化定向水解生產桑葉黃酮苷元的應用研究缺乏基礎數據。若 能采用自行設計的快速篩選體系篩選到能水解桑葉黃酮苷的糖苷水解酶生產菌 林，高效轉化桑葉黃酮苷制備高活性苷元，可應用于工業化生產。因而，制備糖 苷水解酶及用該酶定向水解桑葉中黃酮苷來代替化學水解法生產高活性普元，為 其在醫藥、保健、食品、化妝品等工業上開拓新市場具有十分重要的意義。
發明內容
技術問題本發明針對上述技術缺陷，提供一林點青霉菌抹及其在生物轉化 桑葉黃酮苷中的應用。使得該菌林所產的糖苷水解酶能高效轉化桑葉黃酮苦生成 高活性苷元。
技術方案 一林點青霉菌抹(Pe柳'c7犯ww woto&w) LJ-2菌林，保藏日期為 2008年7月14日，保藏登記號為CGMCC No. 2590。點青霉Pem'c/〃z'wm woto加m LJ-2在生物轉化桑葉黃酮苷制備黃酮苷元的應用。點青霉戶e"jc/〃;ww朋to&w LJ-2在生物轉化桑葉黃酮苦制備黃酮苷元的應用方法，利用點青霉戶e"/d〃&w U-2進行發酵產酶培養生產糖苷水解酶在溫度25 40。C的培養基中接 菌，搖瓶培養1-6天得發酵液，所述培養基的pH 5.0-8.0，其質量百分比含量 為磷酸氫二鉀0.1%~1.5%、磷酸二氫鉀0.1%-1.5%、硫酸銨0.1%~1.5%、硝 酸鈉0.01% ~ 0.5%、硫酸鎂0.01% ~ 0.5%、七水合硫酸亞鐵0.001% ~ 0.5%、硫酸 鋅0.001% ~ 0.5%、蔗糖1~5%;配制質量濃度1%~ 10%的桑葉黃酮苷溶液，用 NaOH或HC1溶液調pH為4.0 ~ 9.0，作為酶催化反應底物，向步驟a所得發酵液 過濾得到的粗酶液或濕菌體中加入該反應底物溶液，并控制反應體系中的pH為 4.0 ~ 9.0,在20 - 55。C條件下，轉速100 ~ 200 r/min,反應時間8 ~ 36 h,得黃酮 苷元。有益效果本發明的微生物分類命名為點青霉尸6"/"7//"附LJ-2，已 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏單 位地址中國北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所。保藏編號是 CGMCC No. 2590,保藏時間是2008年7月14日。
篩菌過程利用,丁為唯一碳源建立了新型快速篩選產糖苷水解酶菌林的培養 體系和對目的菌抹篩選的快速檢驗方法，結合初篩、復篩過程成功篩選出點青霉 尸ew^7'〃/wm LJ-2。所篩選到的點青霉i^m'dWww "oto&m LJ-2是一種好氣
性、易培養、產多種復合酶的真菌，生長速度快，繁殖力強，產酶效率高，安全 高效，產糖苷水解酶具有生物轉化桑葉黃酮苷制備高活性苷元的活性，轉化率 高。
本發明菌林Pem'"'肌"w "oto&w LJ-2系從土壤中分離得到，觀察分析了該菌 形態特征、培養特征、生理特性及代謝特征，結果表明該菌林具有以下特征 (l)形態學特征生長迅速，長成的菌落青綠色，正反面顏色不同，菌絲深入 培養基，子嚢孢子青綠色；顯微照片顯示其具有典型的青霉"掃把"分生孢子，但 是該菌分生孢子比較小，成串珠型，相互交聯；(2)培養特征:在以蘆丁為唯一 碳源的培養基上與在蔗糖培養基上相比，菌落顏色更為鮮綠，有時會達到深綠 色，3-5天長出分生孢子，亦為鮮綠色，菌落反面顯示龜裂均勻；(3)生理特 征對碳源、氮源及溫度有廣泛的適應性，易培養；(4)代謝特征將該菌液 體擴大培養后應用HPLC分析發現，其分解聲丁生成異槲皮苷和槲皮素，最終轉 化為二氧化碳和水，降解蘆丁的速度非常迅速。
四
圖1點青霉/^m'c7加wm LJ-2的菌落照片
圖2點青霉i^m'c/ffiwm woto/w附LJ-2的鏡檢照片
五具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明 本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之 后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本 申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1
本實施例說明點青霉尸e"Zd〃/ww "oto ww LJ-2的篩選過程。 釆.集多處土壤樣品，放入50 mL無菌水的錐形瓶中，加入20顆左右的玻璃 珠，劇烈震蕩20min,使泥土完全搗碎，靜置。在每只50 mL無菌水的三角瓶中 加入1 mL 土壤樣品懸浮液，放入恒溫震蕩培養箱培養，37。C下培養2天。取懸 液涂布于初篩平板培養基上，進行產酶菌林的初篩。初篩培養基的質量組成為 磷酸氫二鉀1.0 %、磷酸二氫鉀0.5°/。、硫酸銨0.1%、硝酸鈉0.05%、硫酸鎂 0.05%、硫酸亞鐵0.005%、硫酸鋅0.005%、瓊脂5°/0、 pH 6.5，并加入1%,丁。 溫度35。C，培養時間1 6天。挑選產生菌落較大的菌才朱20林，接種到真菌完全 培養基斜面培養。
將斜面上生長比較好的菌體轉接到產酶液體培養基中，進行產酶菌林的復 篩。產酶培養基質量比組成磷酸氫二鉀1.0%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸銨 0.1%、硝酸鈉0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.005%、硫酸鋅0.005%、 pH 6.5，并加入1%,丁于500 mL,三角瓶裝液量50mL。搖瓶轉速150 r/min,溫度 35°C，培養時間1-6天，取發酵液用HPLC測定,丁、異槲皮苷和槲皮素濃度 評價其產糖苷水解酶的粗酶活力，得到酶活最高的一抹菌林，命名為點青霉 尸em'c/〃/wff7 wo^a/""m LJ-2。
其中，HPLC法的才企測條件為
色諳柱Alltima C18(150 mm x 4.6 mm);流動相0.5M醋酸銨緩沖液(pH 4)-乙腈(85:15, V/V);才會測波長360 nm; 流速1 mL/min;柱溫30°C; 進樣量20pL。
本發明對點青霉Pem'"7"ww LJ-2菌林的形態特征、培養特征、生理
特性及代謝特征，結果表明該菌林具有以下特征(l)形態學特征生長迅 速，長成的菌落青綠色，正反面顏色不同，菌絲深入培養基，子嚢孢子青綠色； 顯微照片顯示其具有典型的青霉"掃把，，分生孢子，但是該菌分生孢子比較小，成 串珠型，相互交聯；(2)培養特征:在以，丁為唯一碳源的培養基上與在蔗糖培 養基上相比，菌落顏色更為鮮綠，有時會達到深綠色，3-5天長出分生孢子，亦 為鮮綠色，菌落反面顯示龜裂均勻；(3)生理特征對碳源、氮源及溫度有廣 泛的適應性，易培養；(4)代謝特征將該菌液體擴大培養后應用HPLC分析 發現，其分解,丁生成異槲皮苷和槲皮素，最終轉化為二氧化碳和水，降解蘆丁 的速度非常迅速。
實施例2
6本實施例說明利用點青霉Pew'c/仍wm "oto&w LJ-2進行了發酵產酶培養生產 糖苷水解酶及其生物轉化桑葉黃酮苷制備高活性苷元的方法。
培養基質量比組成磷酸氫二鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸銨0.1%、硝 酸鈉0.01%、硫酸鎂0.01%、硫酸亞鐵0.001%、疏酸鋅0.001%、 pH 5.0,并加入 1%聲丁。
將點青霉Pe"/c/〃&w LJ-2的孢子懸浮液(質量濃度)以1%的接種量
接種于培養基中，于溫度25。C好氣培養1天，即產酶結束。
將桑葉黃酮苷溶解配制成質量濃度1%的溶液，用NaOH或HC1溶液調pH 為4.0，作為酶催化反應底物。在發酵液過濾得到的粗酶液或濕菌體中加入該底 物溶液，并控制pH為4.0, 20°C,轉速100r/min，反應培養8 h,水解桑葉黃酮 苦生成高活性普元的轉化率達16%。
實施例3
本實施例的方法與實施例2相同，改變所用方法參數。
培養基質量比組成磷酸氫二鉀1.0%、磷酸二氫鉀O. 5%、硫酸銨0.1%、硝 酸鈉0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.005%、硫酸鋅0.005%、 pH6.0。
將點青霉Pe"/c/〃/i/w "oto/w附LJ-2的孢子懸浮液(質量濃度)以2%的接種量 接種于培養基中，于溫度35。C好氣培養4天，即產酶結束。
將溶解配制成質量濃度為3%的溶液，作為酶催化反應底物。在發酵液過濾 得到的粗酶液或濕菌體中加入該底物溶液，并用NaOH或HC1溶液調pH為 6.5， 35°C，轉速150r/min，反應培養24h，水解桑葉黃酮苷生成高活性苷元的轉 化率達57%。
實施例4
本實施例的方法與實施例2相同，改變所用方法參數。
培養基質量比組成磷酸氫二鉀1.5%、磷酸二氫鉀1.5%、硫酸銨1.5%、硝 酸鈉0.5%、硫酸鎂0.5%、硫酸亞鐵0.5%、硫酸鋅0.5%、 pH8.0。
將點青霉尸6"/"7//"附"oto加w LJ-2的孢子懸浮液(質量濃度)以3%的接種量 接種于培養基中，于溫度40。C好氣培養6天，即產酶結束。
將桑葉黃酮苷溶解配制成質量濃度為10%的溶液，用NaOH或HC1溶液調 pH為9.0,作為酶催化反應底物。在發酵液過濾得到的粗酶液或濕菌體中加入該 底物溶液，并控制pH為9.0， 55°C，轉速200 r/min，反應培養36h,水解桑葉 黃酮苷生成高活性苷元的轉化率達33%。
權利要求
1.一株點青霉菌株(Penicillium notatum)LJ-2菌株，其特征在于保藏日期為2008年7月14日，保藏登記號為CGMCC No.2590。
2. 根據權利要求1所述的點青霉Pem'"'〃/ww "oto&w LJ-2在生物轉化桑葉黃 酮苷制備黃酮苷元的應用。
3. 根據權利要求2所述的點青霉Pem'd〃/ww LJ-2在生物轉化桑葉黃 酮苦制備黃酮苦元的應用，其特征在于a. 利用點青霉Pem'c/Www LJ-2進行發酵產酶培養生產糖苷水解 酶在溫度25 4(TC的培養基中接菌，搖瓶培養1-6天得發酵液， 所述培養基的pH 5.0-8.0,其質量百分比含量為磷酸氫二鐘 0.1% ~ 1.5%、磷酸二氫鉀0.1%~ 1.5%、硫酸銨0.1%~ 1.5%、硝酸鈉 0.01% ~ 0.5%、硫酸鎂0.01% ~ 0.5%、七水合硫酸亞鐵0.001%-0.5%、硫酸鋅0.001% ~ 0.5%、蔗糖1~5%;b. 配制質量濃度1%~ 10%的桑葉黃酮苷溶液，用NaOH或HC1溶液調 pH為4.0 ~ 9.0,作為酶催化反應底物，向步驟a所得發酵液過濾得到 的粗酶液或濕菌體中加入該反應底物溶液，并控制反應體系中的pH 為4.0-9.0,在20 55。C條件下，轉速100-200 r/min,反應時間 8~36h,得黃酮苷元。
全文摘要
一株點青霉菌株(Penicillium notatum)LJ-2菌株，保藏日期為2008年7月14日，保藏登記號為CGMCC No.2590。點青霉Penicillium notatum LJ-2在生物轉化桑葉黃酮苷制備黃酮苷元的應用。
文檔編號C12N1/14GK101575575SQ20091002816
公開日2009年11月11日 申請日期2009年1月20日 優先權日2009年1月20日
發明者榮 仇, 吳福安, 俊 王, 濤 耿, 趙璐璐, 陳明勝 申請人:江蘇科技大學 被以下專利引用 (1),