專利名稱：核酸納米金生物傳感器及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種核酸快速檢測產品的制備方法。
背景技術：
基因檢測不僅對生物學研究至關重要，而且對臨床醫學、藥學、環境監測、法醫鑒 定等領域具有極其重要的意義。傳統的基因檢測技術有Northern雜交法、Southern雜交 法Western blotting法、PCR等，但是這些檢測方法不僅費時費力，而且特異性差。在過去 的十幾年中，實時熒光定量PCR已經發展成為一種重要的基因檢測技術，具有高靈敏度和 特異性，但是需要昂貴的儀器及專業人員的操作。近年來興起的DNA納米技術是以DNA堿 基嚴格互補配對的特性為原理，主要應用于分子的組裝，產生有功能的組裝聚集物。DNA納 米技術除了用于基因芯片，還應用于將DNA結合到納米顆粒上構成納米顆粒基因探針，通 過與靶DNA之間的互補實現納米顆粒的組裝，這已成為一種新型的DNA檢測系統。Mirkin 等運用金納米顆粒基因探針與合成靶雜交，形成透射電鏡下明顯的聚集體，可判斷合成靶
(Chad A. Mirkin, R. L. L. , Robert C. Mucic&Jgimes J. Storhoff Nature 1996, 382,607-609)。Wang等制備金納米顆粒乙型肝炎病毒(HBV) DNA基因探針，在玻片上目視 化檢測 HBV DNA 的多聚酶鏈反應產物(Wang YF, Pang Dff, Zhang ZL, et al. Visual gene diagnosis of HBV andHCV based on nanoparticle ρ robe amp lification and silver staining enhancement. J Med Virol，2003，70 :2052211)。習東等應用 Fe304 (核)/Au (殼) 納米顆粒HBVDNA基因探針，通過尼龍膜上斑點雜交或液相中雜交研究其在檢測HBV DNA中 的應用(Dong Xia, X. L. , Qin Ninga, Qianghua Lud, Kailun Yao, Zuli LiudJournal of Nanjing Medical University 2007，21，207-212)。但上述檢測技術都存在各自的缺點，例 如，Mirkin的技術需要復雜昂貴的透射電鏡，Wang的技術需要昂貴的進口玻片，且需要長 時間的預雜交、雜交洗滌過程，習東的技術在檢測時需要長時間的復雜的預雜交、雜交、洗 膜銀染過程，耗時費力。因此，人們仍然需要尋找快速、靈敏、低成本、操作簡易的核酸檢測 工具。
發明內容
本發明的目的是克服現有基因檢測技術存在的問題和不足，提供一種用于核酸快 速檢測的新的檢測工具，即核酸納米金生物傳感器，并提供該核酸納米金生物傳感器的制 備方法。本發明所述的一種核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣 品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針， 該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯形成的；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡 核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記并與鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸 水紙一端的寡核苷酸探針形成質控線；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測 線。
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根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述質控線與檢測線相 距 3-10mm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述固定于膠板上的樣 品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的相鄰部分彼此重 疊 2mm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述膠體金的粒徑為 8-100nm。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述寡核苷酸為單鏈 DNA 或者 RNA。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的寡核苷酸探針是 針對目的基因片段設計合成的寡核苷酸探針；其中，涂在玻璃纖維上的寡核苷酸探針與目 的基因特異性互補，固定在硝酸纖維素膜上的兩種寡核苷酸探針中，固定于檢測線的探針 與目的基因特異性互補，固定于質控線的探針與涂在玻璃纖維上的寡核苷酸探針特異性互 補。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的納米金標記寡核 苷酸探針的制備方法包括以下步驟1)納米金的制備選用粒徑為8-lOOnm的膠體金顆粒，膠體金采用常規的氯金酸 煮沸還原法制備，通過控制還原劑的量在0. 01%-0. 05%以及攪拌速度在1000-50000轉之 間來控制顆粒粒徑；2)寡核苷酸探針分子設計及修飾合成針對目的基因片段設計合成三條寡核苷 酸探針，三條寡核苷酸探針與模板DNA的關系及三者之間的關系為DNA探針1和DNA探針 2分別與所測樣品中模板DNA特異性互補，DNA探針3與DNA探針2特異性互補，該DNA探 針2的5’端或3’端采用巰基修飾合成；3)納米金與寡核苷酸探針的偶聯與封閉老化將上述巰基修飾的寡核苷酸探針 加入到5倍體積濃縮的納米金溶液中，混合，在4-37°C反應10-24小時，用10%牛血清白蛋 白封閉多余的活性位點，30分鐘后加入NaCl和SDS使其終濃度分別至0. 15M和0. 01 %，老 化10-20小時后，10000-16000轉/分鐘離心20-60分鐘，棄上清，即可獲得所述的納米金標 記寡核苷酸探針，將此納米金標記寡核苷酸探針沉淀用重懸液重新懸浮，4°C保存。根據本發明所述的核酸納米金生物傳感器的進一步特征，所述的樣品墊是經過以 下處理的采用含0. 25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化鈉的混合液浸泡玻璃 纖維4個小時后，37 °C烘干。本發明將表面合成化學、生物化學及物理化學有機結合起來，解決目視化基因檢 測技術設計與制造中的關鍵技術，具體構思如下膠體金是一種帶負電的膠體溶液，能與巰基共價結合形成Au-S鍵，通過寡核苷酸 修飾巰基與膠體金偶聯從而形成金標DNA探針；鏈霉親合素(SA)是與親合素(A)有類似生 物學特性的一種蛋白質，是由Sti^ptomyces avidin菌在培養過程中分泌的一種蛋白質產 物。SA是一種四聚體蛋白，其每個單體通過親水鍵和范德華力與一個生物素結合后兩者形 成穩定且難斷裂的鍵，因此利用生物素與鏈霉親和素間的親和力，用一個用生物素標記的探針與鏈霉親和素偶聯，固定于硝酸纖維素膜上作為檢測線和質控線；將硝酸纖維素膜、金 標墊、樣品墊、吸水紙固定于膠板上，組裝成納米金生物傳感器。本發明的技術原理是核酸納米金生物傳感器以夾心DNA雜交為基礎，其基本原 理為設計3條DNA探針，DNA探針1和DNA探針2分別與所測樣品中模板DNA特異性互 補，DNA探針3與DNA探針2特異性互補(圖1)。DNA探針1和DNA探針3分別固定在硝 酸纖維素膜的檢測線(Test line)和質控線(Control line)上，DNA探針2與膠體金相連， 涂布在金標墊上。當在樣品墊上滴加樣品(含模板DNA)時，由于毛細作用，模板DNA隨樣 品液一起向前運動，當到達金標墊時，模板DNA與金標墊上的DNA探針2特異性雜交。雜交 的DNA繼續向前移動，當到達檢測區域時模板DNA與DNA探針1再次特異性雜交而固定在 檢測線上。由于膠體金的光學性質，在檢測線上聚集的膠體金顆粒顯現出紅色的條帶，過剩 的膠體金-DNA探針2由于毛細作用繼續向前移動，與質控線上的DNA探針3雜交，而在質 控線上出現紅色的線。如果樣品中沒有模板DNA時，檢測區域不出現紅線，而質控線上出現 紅線。因此，質控線出現紅色線說明試紙條可用，而檢測線出現與否是樣品陰性和陽性的標 準。整個檢測過程只需要10分鐘左右。本發明的優點在于本發明所述的核酸納米金生物傳感器制備簡便、檢測迅速，將 目標DNA滴于樣品墊上，約10分鐘后即可通過觀察檢測線及質控線來判斷結果，不需要專 業的技術人員及昂貴的儀器設備。
圖1顯示DNA探針1、DNA探針2和DNA探針3之間的關系。 圖2顯示納米金生物傳感器檢測模板DNA的結果；圖2A為不含模板DNA的檢測結 果，圖2B為含有0. 5nmol/L模板DNA的檢測結果。
具體實施例方式實施例一本發明所述的核酸納米金生物傳感器的制備1、探針的設計及模板的合成選擇DNA 模板為流感病毒 cDNA ( > gi | 227809835 | gb | FJ966085. 11 Influe nza Avirus (A/California/04/2009(HlNl))segment 7 matrix protein 2(M2)and matrixprotein I(Ml) genes, partial cds)中的一個基因片段,具體序列為 SEQ ID NO. 1, 如下ACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATG根據該DNA模板設計以下3個探針探針1 :5，-CCTCGCTCACTGGGCACGGT-生物素-3' SEQ ID N0. 2探針2 :5，-SH-CATTTAGGGCATTTTGGA-3，SEQ ID N0. 3探針3:5，-生物素-TCCAAAATGCCCTAAATG-3，SEQ ID N0. 42.納米金(膠體金)的制備在500ML的圓底燒瓶中加入100ml 0. 01 %的HAuCL4溶液，邊攪拌邊加熱至沸騰； 向上述溶液中加入2ml 1 %枸櫞酸鈉，溶液20秒內變為藍色，60秒后變為酒紅色，繼續煮沸10分鐘，停止加熱繼續攪拌15分鐘；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光
度值鑒定。3.金標寡核苷酸探針的制備用100 μ 1去離子水溶解IOD DNA-探針2，加入到5 倍體積濃縮的膠體金溶液中，4°C 24小時；10%的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl 和1 %的SDS，分別至終濃度0. IM和0. 01 %，4°C過夜，12000轉/分鐘離心30分鐘，棄上清， 沉淀用IOOul含20mM Na3PO4, 5% BSA, 0. 25% TweenJP 10%蔗糖重新懸浮，制成懸浮液。4.金標墊的制備將本發明制備的金標寡核苷酸探針涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個小時，制成金 標墊，備用。5.生物素標記探針與鏈霉親和素的偶聯及偶聯物的固定鏈霉親和素可以與生物素通過親水鍵和范德華力相結合并形成穩定且難斷裂的 鍵，因此本發明采用生物素標記的DNA探針與鏈霉親和素混合反應，采用劃膜噴金儀涂于 硝酸纖維素膜上。例如，用10 μ 1去離子水溶解IOD生物素標記的DNA-探針1，加入5 μ 1 (2mg/ml) 鏈和親霉素，室溫下反應1小時后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測線上，37°C干燥 兩個小時。DNA-探針3采用同樣方法固定于質控線上。6.樣品墊的處理玻璃纖維浸泡0.25% TritonX-100、0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化鈉中 4個小時后，
37 °C烘干備用。7.核酸納米金生物傳感器的組裝將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標記寡核苷酸探 針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊l_5mm(最好是2mm)，經切割 成寬4mm后即得到本發明所述的核酸納米金生物傳感器。實施例二 本發明所述的核酸納米金生物傳感器的質量控制與檢測效果采用實施例一所制成的核酸納米金生物傳感器，進行以下實驗，驗證其檢測效果。將上述合成的模板DNA用PBS稀釋一系列梯度10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、 0. 5nmol/L、0. lnmol/L后，取100 μ 1滴于上述納米金生物傳感器的樣品墊上，隨著液體的 向前移動，帶動金標墊上的金標寡核苷酸探針向前移動，約10分鐘即可判斷結果。質量控制標準1)C線(質控線)出現紅色的線證明納米金生物傳感器有效。2)T線(檢測線)出現紅色的線與否，是陽性陰性判別的標準。結果判定標準1)C線出現紅色的線，同時T線出現紅色的線，說明被檢樣品為陽性；2) C線出現紅色的線，同時T線沒有出現紅色的線，說明被檢樣品為陰性；3) C線沒有出現紅色的線，說明納米生物傳感器失效。實驗結果表明，當模板DNA 濃度為 10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、0. 5nmol/L 時在 T 線和C線均能能穩定出現清晰的紅線(見圖2A)，當濃度低于0. lnmol/L時檢測線上出現紅 線不穩定，當溶液中不含模板DNA時，只有C線顯色T線不顯色(見圖2B)。因此，本發明所
6述方法所制備的核酸納米金生物傳感器的檢測靈敏度約為0. 5nmol/L0 序列表(SEQUENCE LISTING) <110>中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院 <120>核酸納米金生物傳感器及其制備方法 <130> <160>4
<170>PatentIn version 3. 4 <210>1 <211>58 <212>DNA <213>流感病毒 <400>1
accgtgccca gtgagcgagg actgcagcgt agacgctttg tccaaaatgc cctaaatg 58 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工合成 <400>2
cctcgctcac tgggcacggt20
<210>3 <211>18 <212>DNA <213>人工合成 <400>3
catttagggc attttgga18
<210>4 <211>18 <212>DNA <213>人工合成 <400>4
tccaaaatgc cctaaatg18
權利要求
一種核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯形成的；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記并與鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質控線；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測線。
2.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述質控線與檢測線 相距 3-10mm。
3.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述固定于膠板上的 樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼此重疊l_5mm。
4.根據權利要求3所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述的相鄰部分彼此 重疊2mmο
5.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述膠體金的粒徑為 8-100nm。
6.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述寡核苷酸為單鏈 DNA 或者 RNA。
7.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述的寡核苷酸探針 是針對目的基因片段設計合成的寡核苷酸探針；其中，涂在玻璃纖維上的寡核苷酸探針與 目的基因特異性互補，固定在硝酸纖維素膜上的兩種寡核苷酸探針中，固定于檢測線的探 針與目的基因特異性互補，固定于質控線的探針與涂在玻璃纖維上的寡核苷酸探針特異性互補。
8.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于，所述的納米金標記寡 核苷酸探針的制備方法包括以下步驟1)納米金的制備選用粒徑為8-lOOnm的膠體金顆粒，膠體金采用常規的氯金酸煮沸 還原法制備，通過控制還原劑的量在0. 01%-0. 05%以及攪拌速度在1000-50000轉之間來 控制顆粒粒徑；2)寡核苷酸探針分子設計及修飾合成針對目的基因片段設計合成三條寡核苷酸探 針，三條寡核苷酸探針與模板DNA的關系及三者之間的關系為DNA探針1和DNA探針2分 別與所測樣品中模板DNA特異性互補，DNA探針3與DNA探針2特異性互補，該DNA探針2 的5’端或3’端采用巰基修飾合成；3)納米金與寡核苷酸探針的偶聯與封閉老化將上述巰基修飾的寡核苷酸探針加入 到5倍體積濃縮的納米金溶液中，混合，在4-37°C反應10-24小時，用10%牛血清白蛋白封 閉多余的活性位點，30分鐘后加入NaCl和SDS使其終濃度分別至0. 15M和0. 01%，老化 10-20小時后，10000-16000轉/分鐘離心20-60分鐘，棄上清，即可獲得所述的納米金標記 寡核苷酸探針，將此納米金標記寡核苷酸探針沉淀用重懸液重新懸浮，4°C保存。
9.根據權利要求1所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于，所述的樣品墊是經過 以下處理的采用含0. 25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化鈉的混合液浸泡玻 璃纖維4個小時后，37 °C烘干。
全文摘要
本發明涉及一種核酸納米金生物傳感器及其制備方法。本發明所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯形成的；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標記并與鏈霉親和素偶聯形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質控線；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測線。本發明的優點在于本發明所述的核酸納米金生物傳感器制備簡便、檢測迅速，約10分鐘后即可通過觀察檢測線及質控線來判斷結果，不需要專業的技術人員及昂貴的儀器設備。
文檔編號C12M1/34GK101942386SQ200910040930
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月8日 優先權日2009年7月8日
發明者劉國東, 曾令文, 頓博影 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院