一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記的制作方法

專利名稱：一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用分子生物學技術對動物進行篩選育種的領域，具 體涉及一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記。
背景技術：
人和動物體都存在很多的大腸桿菌，但并不會全引起人和動物發 病，是有少數引起人和動物發病，這些能引起人和動物發病的大腸桿 菌正常情況下很少存在于健康體內，這類病原菌根據其毒力因子與發
病機制不同，可分為五類腸毒素大腸桿菌(ETEC)，類志賀毒素 大腸桿菌(EPEC)，敗血性大腸桿菌(SEPEC)及尿道致病性大腸 桿菌(UPEC)，其中前兩種與動物的疾病關系最密切。
其中，腸毒素大腸桿菌(ETEC)是一種引起人和動物腹瀉最常 見的大腸桿菌，其致病力主要由黏附于性菌毛和腸毒素兩種毒力因子 構成，二者密切相關缺一不可。
黏附素性菌毛是人和動物ETEC的一類特有菌毛，因其能黏附于 宿主的大腸上皮胞，故稱其為粘附素或定居因子抗原。迄今，在動物 ETEC中已發現的黏附素主要有F4 (K88) 、 F5 (K99) 、 F6 (987P) 和F41，其次F42和F17。
目前F4受體已從上皮細胞刷狀緣、小腸膜和粘液中提取。它可 能是一種復合糖(Erickson AK, Wingohs JA, McFarland SY, et al.Indentification of two porcine brush border glycoproteins that bind the F4ac adhesin of Escherichia coli and correlation of these binding glycoproteins with the adhesive phenotype [J]. Infect Immun, 1992,60: 983-988.)，而Grange和Mouricout報道它可能是74 kDa的轉鐵蛋白， 以及一種小腸中性鞘糖脂(Grange PA, Mouricout MA. Transferrin association with the porcine intestinal mucosa is a receptor specific for the F4ab fimbriae of Escherichia coli [J]. Infect Immun, 1996,64: 606-610.)。
粘附素雖然不是導致宿主腹瀉的直接致病因子，但它是構成 ETEC感染的首要因7， ETEC必須首先粘附于宿主的大腸上皮細胞， 才能避免腸蠕動和腸液分泌的清除作用，并在腸內定居和繁殖，進而 發揮致病作用。
這些粘附素要在小腸粘膜附著，還必須在小腸粘膜上皮細胞刷狀
緣有特異性受體，不同動物腸粘膜有無特異性受體是由基因控制的， 無受體的動物在受到細菌感染時不發病，表現為抗性。
目前豚鼠、蠔牛和豬等多種動物都存在ETEC致死現象，尤其是 豬，因此尋找和篩選ETFC受體的遺傳標記是培育出具有抗性動物的 重要途徑。

發明內容
本發明的目的是針對ETEC在動物詞養中導致瀉痢的現象，提供 一種通過分子生物學技術找出ETEC粘附素F4受體的相關基因一 7 ，并研究該戶MC4/基因的多態性，從而能有效地篩選動物
5說明書第3/22頁
抗病育種的方法。
本發明的另一個目的是提供一種利用上述方法專門用于豬的抗 病育種篩選的遺傳標記。
本發明的另 一個目的是提供上述遺傳標記在豬標記輔助選擇中 的應用。
本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的
鑒于目前ETEC引起動物瀉痢的情況在豬中最為常見，因此本發
明人選擇豬作為研究對象，采用分子生物學的方法篩選ETEC的粘附 素F4受體的相關基因，其步驟如下-
(1) 分別采集不同品種初生仔豬的小腸，采用體外黏附測定檢測 各樣品的黏附性；
(2) 提取小腸上皮細胞總RNA，并將之反轉錄成cDNA;
(3) 利用S差異顯示引物實施差異PCR，采用聚丙烯酰胺凝膠電 泳和銀染法顯示PCR產物；
(4) 將差異帶回收后再PCR擴增，以增加差異DNA數量；
(5) Northern blot鑒定陽性差異帶；
(6) 將陽性差異帶克隆并測序后，將序列進行數據庫同源性分析;
(7) 根據測序結果和序列分析結果，篩選與受體有關的基因。 根據對差異BLAST結果表明，有一個差異與戶MC4 7基因有
91%(239/260)同源性，于是本發明人又對尸A/C4 7基因進行了分析， 如下所示
根據實驗結果，本發明人發現PMC4 7基因(Genbank登錄號為NM_001001331.1)與F4受體具有一定的關系，于是本發明人又對 戶7l/C4/基因進行了分析，如下所示
小腸上皮細胞含有鈣結合蛋白和Ca2+-ATPaSe，這些對于小腸的 鈣的運輸具有重要作用。據Yamagishi等報道(Yamagishi N., M. Miyazaki and Y. Naito. The expression of genes for transepithelial calcium-transporting proteins in the bovine duodenum[J]. Vet. J. 2006,171: 363-366.)，牛十二指腸血漿膜Ca2+-ATPase 1 (尸MC4/) mRNA含量與血漿中轉的濃度存在負相關，而尸MC4V mRNA含量與 血漿中無機磷的含量存在負相關，維生素D受體mRNA含量與血漿 中鎂濃度存在正相關。
因為動物腹瀉就是由于大腸桿菌釋放的毒素使水和電解液大量 流入腸內，從而引起特征性的臨床癥狀，而戶JWC4 7能調控腸道細胞 的Na+和(^2+平衡，因此尸MC4 /基因對于動物腹瀉也有著有著重要 意義。
Edfors-Lilja等(Edfors-Lilja I, Gustafsson U, Duval-Iflah Y, et al. The porcine intestinal Receptor for Escherichia coli F4ab, F4ac: reginal localization on chromosome 13 and influence of IgG response to the F4 antigen [J]. Anim Genet, 1995,26: 237-242.)經過系統研究，已準確地 將豬小腸的F4 ab受體和F4 ac受體基因座定位于豬Chrl3q31，且 K88abR與K88acR緊密連鎖，而本發明人研究發現尸AfC^7基因也位 于豬的13q31-q32，這再次證明i^TC^7很可能是F4ab或ac受體的 候選基因。綜上所述，尸Jl/C4 7基因的生理功能和基因定位都與F4受體的
相關報道相吻合，因此本發明人確定該基因是F4 ac受體的相關基因， i^TC4 /基因的單核苷酸多態性可作為動物抗病育種時的判斷條件，
由此本發明人得出一種篩選動物抗病育種的方法，該方法包括測定
從該動物獲得的核酸樣品中i^TC4 7基因中多態性的存在，所述多態 性是與腸毒素大腸桿菌粘附素F4受體相關的多態性。
對豚鼠、蠔牛和豬等飼養動物，只要是具有戶MC4/基因的，都 可以通過檢測其核酸樣品中尸MC4 7基因的多態性，根據多態性的檢 測結果，就可以篩選出具有與所需特征相關的動物(即對ETEC具有 抗性的動物品種)進行育種。
本發明人特別對豬核酸樣品中i^/C4 7基因的多態性進行研究， 通過比對發現豬核酸樣品中戶MC4 /基因的多態性發生在戶MC4 7基 因核苷酸第4210位，該位置有一個堿基突變A4210"T4210，所有黏 附型個體的堿基均為A，而所有不黏附型個體的堿基均為T。
根據上述的實驗結果，本發明給出一種篩選豬抗病育種的方法， 其具體包括如下步驟
(1) 豬基因組DNA的獲得；
(2) 以上述豬基因組DNA為模板，擴增i^l/C4/基因序列；
(3) 鑒定尸MC4 /基因的核苷酸第4210位處的多態性，若第4210 位的堿基為A則為黏附型，若為T則為不黏附型。 上述步驟(2)中，用于擴增戶MC4 7基因序列的引物為SEQID NO: 9和SEQIDNO: 10。根據上述研究結果，本發明給出一種可用于豬抗病育種篩選的遺
傳標記，該遺傳標記包含克隆得到一個豬戶MC4 7基因的特異DNA， 它的核苷酸序列如SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQIDN0.3、 SEQ ID NO,4、 SEQ ID N0.5、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示，其中序列表SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQIDN0.3、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID NO,5、 SEQ ID NO,6、 SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示的第4210位堿基處有一個堿基突變A4210—T4210。
上述遺傳標記可應用于豬標記輔助選擇中。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1. 本發明通過分予生物學技術，首先篩選出F4ac受體的豐^m 因""PMC4/基因，根據該基因的單核苷酸多態性可對動物，即基因 組DNA中含有戶MC4 /基因的動物進行抗病育種篩選；
2. 本發明提供一種可篩選豬抗病育種的遺傳標記，利用該遺傳標 記可準確地篩選出對ETEC的受體不具有黏附型的豬，從而培育出抗 性豬，具有極其重大的應用價值和經濟效益。


圖1為顯微鏡下的黏附型的黏附情況圖(X1000);
圖2為顯微鏡下的不黏附型的黏附情況圖(X 1000);
圖3為實施例2中隨即挑選的9對S差異顯示引物的電泳結果
其中，M為Marker, RrR9為9對S差異顯示引物擴增不黏附型 樣品的電泳結果，S, S9為9對5差異顯示引物擴增黏附型樣品的電泳結果，圖中箭頭所指均為差異片段；
圖4為S差異的Northern blot電泳其中，S廣S3為3條S差異的有受體；R廣R3為3條S差異的無受 體對照；
圖5為實施例5中引物2的擴增測序比對結果圖； 其中，箭頭所指位置為多態性位點。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步地解釋，但具體實施例并
不對本發明做任何限定。
實施例l兩個豬種F4受體黏附差異研究
解剖1周齡內沙子嶺豬33頭、大約克豬30頭，取豬小腸組織用 于制備上皮細胞刷狀緣和保存于液氮中用于提取RNA。
取大腸桿菌懸液和仔豬小腸黏膜上皮細胞刷狀緣懸液各0.1 ml 置于1.5mL離心管中，加入甘露糖(0.4mg/mL) 1 u 1，輕輕混合， 室溫培養30min，不時輕搖；混懸后滴一滴于載玻片上，酒精燈下微 熱烘干，再加一滴結晶紫染色液，3 min后用水沖洗載玻片，酒精燈 下微熱烘干，油鏡下觀察，隨機計數20個形態清晰的細胞上所黏附 的細菌數。
判斷標準在油鏡下隨機檢測20或更多形態清晰的刷狀緣，對 于單個的刷狀緣，多于兩個細菌黏附其上判為黏附；對于仔豬個體樣， 樣品中至少有10%的刷狀緣結合多于2個細菌才判為黏附;少于10% 的刷狀緣結合多于2個細菌，但多于10%的刷狀緣結合1 2個細菌，判為弱黏附；最后用數碼相機進行拍照(黏附型見圖l，不黏附型見 圖2)。
圖1和圖2分別是黏附與不黏附型圖，由圖1可見，刷狀緣結合 了多個細菌，而圖2則不然，試驗結果表明，此方法在顯微鏡下能夠
非常清楚的觀察到黏附情況，從而對個體黏附型進行準確判定。
實施例2差異的獲得
一、 cDNA的合成
取實施例1中保存于液氮中的豬小腸組織，采用常規方法提取總 RNA，并進行定量、純度和完整性檢測，再用無RNase的DNase I 處理總RNA，釆用Femientas公司的第'鏈cDNA合成試劑盒中的 oligo(dT)引物進行cDNA的合成。分別取粘附型(有受體)和不黏附 型樣品(無受體)各6個cDNA樣品構建cDNA池用于擴增。
二、 s差異顯示引物
S差異顯示引物由上海英駿生物有限公司合成，每個引物濃度為 20uM，引物序列如下
(1) 5'P隨機引物共IO條:
Pl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示;
P2,其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示;
P3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示;
P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示;
P5，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示;
P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示;P7，其核苷酸序列如SEQIDNO: 17所示; P8，其核苷酸序列如SEQIDNO: 18所示； P9，其核苷酸序列如SEQIDNO: 19所示; PIO，其核苷酸序列如SEQIDNO: 20所示；
(2) 3'oligo(dT)引物共9條 Tl，其核苷酸序列如SEQIDNO: 21所示； T2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 22所示； T3，其核苷酸序列如SEQIDNO: 23所示； T4，其核苷酸序列如SEQIDNO: 24所示； T5，其核苷酸序列如SEQIDNO: 25所示； T6，其核苷酸序列如SEQIDNO: 26所示； T7，其核苷酸序列如SEQIDNO: 27所示； T8，其核苷酸序列如SEQIDNO: 28所示； T9,其核苷酸序列如SEQIDNO: 29所示。 三、長距離PCR (LD-PCR) 1、 PCR循環參數
前4個循環使用低嚴謹條件，后28個循環使用嚴謹條件。 1個循環:94。C，6min; 40°C， 5 min; 68°C， 5 min。 3個循環94。C,2min; 40°C， 5 min; 68°C， 5 min。 28個循環94。C，lmin; 60°C， 1 min; 68°C， 2min。 另夕卜68°C， 7min。 2、 PCR操作流程(1)融化下述試劑
IOXPCR反應緩沖液(試劑盒搭配的)、25 mM Mgd2、上述已 合成好的cDNA樣品、dNTP混合物(試劑盒搭配的)、上述10條5，P 隨機引物、9條3，oligo(dT)引物和純水，完全融化后保持上述溶液在 冰上，使用之前混合好，以避免鹽濃度的局部差異；
(2) 對每一個差異顯示即樣品與引物組合，在0.2mlPCR管中加
入如下反應成分
0.8 u L 已合成好的cDNA樣品
0.8 yL 5,P引物(SEQIDNO: 11~20)
0.8 UL 3'oligo(dT)引物(SEQIDNO: 21,>
當單獨使用一個P引物或一個T引物時，加該引物1.6uL;
(3) 根據表1所示準備主體混合物
表l PCR反應體系成分
成分1個反應體系n個反應體系
10XPCR反應緩沖液2 "2n uL
(包含1.5mMMgCl2)
dNTP混合物(5mM每個)0.2 uL0.2n "
無菌水15.1 yL15.ln uL
Taq DNA聚合酶0.3 "0.3n ix L
主體混合物體積應比PCR操作分析的總數量大10°/。，如總共分 析10個反應管，則應準備11個反應管上述成分，因為由于操作或tips
與移液槍等原因存在誤差。在每一個實驗中，另準備一個否定控制(沒 有模板DNA)。 TaqDNA聚合酶最后加入，然后通過上下移液徹底混(4) 每個PCR反應管加入上述主體混合物17.6pL，用去離子水 補足總體積為20 uh
(5) 旋渦混合器上混合后輕輕離心；
(6) 開啟PCR儀，當PCR儀達到94'C時，放PCR管到PCR儀 中(簡單的熱起始)；
(7) PCR結束后將進行聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染顯示。 四、結果討論
兩個豬種共63頭豬小腸總RNA濃度與純度檢測結果表明，總 RNA濃度在560 1152ng/ml之間，純度在1.75 2.00之間， 一般在 1.85左右，說明采用提取的總RNA質量高，基本無蛋白質污染，可 保證mRNA擴增的順利進行，通過檢測總RNA完整性表明提取的總 RNA分子完整，沒有發生降解。
本發明的差異指在S差異顯示中，在黏附型樣品中表達，但在 非黏附型樣品中不表達，或者在非黏附型樣品中表達，但在黏附型樣 品中不表達的基因。
圖3給出109個S差異顯示引物組合中隨即挑選的9對S差異顯 示引物的電泳結果圖，圖中三處箭頭所分別指出的三條條帶，均是相 對照樣品中沒有出現的，因此這三條條帶可判定為差異片段。
S差異顯示結果為在S差異顯示的109個引物組合的PCR中， 在F4ac黏附差異帶檢測中，共檢測到24條差異片帶，其中有13條 在黏附型中特異表達，ll條在不黏附型樣品中特異表達。實施例3差異的回收、再擴增、純化與Northern blot
本實施例的差異即為實施例2中F4 ac黏附差異帶檢測到的24條。
用干凈的手術刀從實施例2中得到的銀染凝膠片上切下所需的 差異帶，回收其中的DNA，并對差異實施再擴增、純化與回收步聚， 之后進行Northern印跡雜交，確定總RNA中樣品同源RNA的存在 與否或樣品中特定RNA分子的大小和豐度。
本實施例所涉及到的差異擴增、純化、回收以及Northern印跡雜 交等均為本領域的通用操作。
結果顯示:
1、 在24條S差異的再擴增PCR中，有l條差異沒能實現特異 性擴增，表現為多帶或無帶，估計這些差異實際可能包含幾條大小相 近的，需要通過其它方法才能分離出來，本實施例將其作為假陽性差 異，沒作進一步分析；
2、 其余23條S差異的再擴增Northern blot結果判斷原則都如圖 4所示，圖4中給出23條S差異的再擴增Northern blot結果中的3 條S差異的Northern blot結果電泳圖，其中1號和2號這兩條S差異 片段的對照(Ri和R2)顯示為空白，而S^nS2顯示為有條帶，說明 1號和2號為陽性，3號S差異片段的對照R3顯示為有條帶，而S3 也顯示為有條帶，因此判定為假陽性。
根據Northern blot電泳結果圖，本實施例確定23條S差異片段 中有20條為陽性差異，陽性率為87% (20/23)。實施例4陽性差異的克隆、測序與序列分析
本實施例中的材料為通過實施例3確定的純化后的20個陽性差 異，通過感受態細胞的制備、連接、轉化、篩選、鑒定等過程，克隆 陽性差異，然后送上海英駿生物有限公司測序，將測序結果到NCBI 網站通過BLAST程序進行同源比對，再根據比對結果確定該片段是 否為新基因或者與某一基因有較大長度的高同源性。
克隆載體送測序公司測序后，到NCBI網站進行BLAST比對， 本實施例共測序了20條片段，其中比對結果有高同源性(>85°/。)且 同源的長度大于60個堿基的片段有2條；有同源性但低于85°/。或同 源的長度較短的片段有2條，其余16條為新基因片段。20條片段序 列已登錄到GenBank中，登錄號分別為DQ217772、 EC268686、 DW286736 DW286739 、 EB739624 EB739627和EE392468 EE392477。
實施例5豬相關基因SNP篩選
本實施例從實施例1中已經鑒定的黏附型和不黏附型樣本中分 別隨機選擇4個共8個樣品，并分別提取其基因組DNA。
根據豬尸MC4 7基因mDNA序列設計了 4對引物，如下所示 引物l上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 30; 引物l下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 31; 引物2上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 9; 引物2下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 10; 引物3上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 32;引物3下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 33;
引物4上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 34;
引物4下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO: 35。
用上述4對引物分別對所選擇的四個黏附型個體和所選擇的四 個不黏附型個體進行了擴增，擴增產物經純化后送測序公司測序，測 序結果SEQIDNO: 1、 SEQIDNO: 2、 SEQIDNO: 3、 SEQIDNO: 4、 SEQIDNO: 5、 SEQIDNO: 6、 SEQIDNO: 7和SEQIDNO: 8所示。
采用DNAStar軟件之Seqman程序對上述8條序列(SEQ ID NO: 1 8)進行同源比對，篩選與黏附性有關的SNP，其中引物2的擴增 測序比對結果如圖5所示。
結果表明，其中由引物2擴增產物在142堿基處，所有黏附型個 體的堿基均為A，而所有不黏附型個體的堿基均為T，該位點經NCBI 進行同源比對，結果表明即為戶MC4 /基因(NM—001001331.l)的 mRNA第4210堿基處。
另外，圖5所示在第10堿基位點，也存在SNP，但分析表明， 該SNP與黏附性不存在相關。
該結果表明，引物2所擴增產物在第142堿基位置的突變很可能 就是影響F4ac受體黏附性差異的原因，而在其它位點，雖然發現一 些SNP，但這些SNP與樣品的黏附性無關，因此不予考慮。
對其它3對引物的測序結果分析，未發現一 SNP在所有黏附/不 黏附個體中特異表現，因此認為該區段不存在影響黏附性的多態位點。
由此可見，與粘附性有關的SNP為尸MC4 7基因的mRNA第4210 堿基處有一個堿基突變A4210—T4210。
實施例6與黏附性有關的SNP在生產實踐中的驗證
在湖南農業大學種豬場用ETEC F4ac病原菌感染初生仔豬，采 集腹瀉和未腹瀉的初生仔豬各30頭血樣，提取基因組DNA，利用實 施例5中的引物2擴增，并檢測其SNP。
1、 引物
引物2上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 9; 引物2下游引物，其核苷酸)^OTtrSEQ ID NO: l(J。
2、 PCR
PCR反應體系，如表2所示
表2 PCR反應體系中各組成成分
成分_用量(W)_終濃度
10倍緩沖液 IX MgCl2 4.0 2.5mM
dNTPs 0.8 0.2 mM
F引物 0.2 0.2|iM
R引物 0.2 0.2pM
Taq酶 0.4 1 U
DNA模板__50-500 ng
Total體積
PCR循環參數如下
34個循環94。C,4min; 94°C， 30s; 59°C， 40s。 72°C， 7min。
結果表明，在30頭腹瀉的初生仔豬中，引物擴增產物在142堿基處的堿基均為A，由此證明這30頭腹瀉的初生仔豬均為黏附型個
體；而在30頭不腹瀉的初生仔豬中，引物擴增產物在142堿基處的 堿基均為T，說明這30頭不腹瀉的初生仔豬均為不黏附型個體。
上述結果表明i^/C4 7基因為F4ac受體相關基因，通過驗證 戶7kTC4 7基因可以篩選動物抗ETEC的品種進行培育，對于豬來說， 可通過判斷尸i/C4 /基因核苷酸中第4210位堿基的多態性(A4210 —T4210)來篩選對ETEC具有抗性的豬。一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記序列表 SEQUENCE LISTING
<110〉湖南農業大學 劉，定發 蔣，雋
<120〉 一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記
〈130>
<160> 35
<170> Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211〉 256
<212> DNA
<213〉 豬(Sus scrofa)
<400〉 1 gcca^tca3gccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
Ettccccaxxagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctxacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgctgtt"tgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtttttcccaaaac240
aagccttcctggctcc256
<210> 2 〈211〉 256 <212> DNA <213〉 豬(Sus scrofa)
<400〉 2 gccaatcaagccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaac"tccaacccac ctgcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttcaca180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggat"tcccaaaac240
aagccttcctggctcc256
〈210〉 3 <211> 248 <212> 廳 <213> 豬(Sus scrofa)
〈400〉 3 gccaatcaagccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtg"ttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgc"tgtttgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtUttcccaaaac240
aagccttt248
<210〉 4 <211〉 257 <212> DNA <213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 4 gccaatcaagccgatccatg at"tgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccacca gcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtgttcctgcctg120
20cactgtcaactccaacccac ctgcccgctggctgcgatgctg"tttgaactccttttcaca180
ggccgggatc tccactgggggcttacggga gtgagcgttt240
aagccttccttgctcgg257
<210> 5 <2U〉 251 <212〉 腿 <213> 豬(Sus scrofa)
<400〉 5 gccaatcaacccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
a/tccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggca ggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac ctgcccgctggctgcgatgctgtttgaact:ccttttcaca180
tca^ggcaagggccgggatc tccactggggtxttacgggagtgagcgUt"ttccca犯ac240
aagccttcctg251
<210〉 6 <211> 255 <212〉 DNA <213〉 豬(Sus scrofa)
<400〉 6 gccaatcaacccgatccatg attgggttaggtag戰ctttggggccaggtcatcgccacc60
atccccaccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggca ggctcacgtg"ttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttxact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcUacgggagtgagcgttt240
agccttcctggctcc255
<210〉 7 〈211〉 258 <212〉 DNA <213> 豬(Sus scrofa)
<400> 7 gccaatcaacccgatccatg attgggttaggtagagctttggggccaggtcatcgccacc60
atcccca_ccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggca ggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactccaacccac cagcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtttttcccaa犯c240
aagccttcctggctxcgt258
〈210〉 8 〈211〉 253 <212〉 DNA <213〉 豬(Sus scrofa)
〈400〉 8 gccaatxaagccgatccatg attgggttaggt卿gctttggggccaggtcatcgccacc60
atcccca_ccagcagacacaa gttcctcaaggaggcaggcaggctcacgtgttcctgcctg120
cactgtcaactxcaacccac ctgcccgctggctgcgatgctgtttgaactccttttcact180
tcaaggcaagggccgggatc tccactgggggcttacgggagtgagcgtttttcccaa犯c240
aagccttcctggc253<210> 9
<211〉 20
〈212〉 DNA <213>人工合成
<400〉 9
caggacgtga cactt8tgag 20
〈210〉 10
<211> 20
<212> DNA <213〉人工合成
<400> 10
gccagtxtga gagttcacac 20
<210〉 11
<211> 19
<212〉 DNA 〈213〉人工合成
<400> 11
attctctaaa tgctgggga 19
<210> 12
〈211> 20
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400> 12
attctctaaa tcggtcatag 20
〈210> 13
<211〉 19
<212〉 麗
〈213> 人工合成
<400〉 13
attctctaaa tgctggtgg 19
<210> 14
〈211〉 19
〈212> DNA
<213〉 人工合成
〈400〉 14
attctctaaa tgctggtag 19
<210> 15
<211〉 18
〈212〉 腿 <213>人工合成
<400〉 15
attctctaaa gatctgtg 18
<210〉 16
<2U〉 19
〈212〉 DNA <213〉人工合成
〈柳〉16
attctctaaa tgctgggtg 19
〈210〉 17 <211> 19 <212> DNA〈213〉 人工合成<400〉 17
attctctaaa tgctgtatg 19
〈210〉 18
<211〉 19
<212〉 DNA
<213> 人工合成
<400〉 18
attctctaaa tggagctgg 19
<210〉 19
<211〉 19
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
〈400〉 19
attctctaaa tgtggcagg 19
<210> 20
<211〉 17
<212〉 DNA
<213〉 人工合成
<400> 20
attctctaaa gccgtcc 17
<210〉 21
〈211〉 30
<212〉 脆<213〉人工合成
〈400〉 21
cattatgctg agtgatatct ttttttttaa 30
〈210> 22
<211〉 28
<212〉 DNA〈213>人工合成
<400〉 22
cattatgctg agtgatatct tttttttt 28
<210〉 23
〈211〉 30
〈212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
cattatgctg agtgatatct ttttttttag 30
〈210〉 24
<211〉 30
〈212〉 DNA〈213>人工合成
<400〉 24
cattatgctg agtgatatct ttttttttca 30
<210〉 25
<211〉 30
<212〉 DNA
<213> 人工合成
<400〉 25ca/ttatgctg agtgatatct ttttttttcc 30
<210> 26
<211〉 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400〉 26
cattatgctg agtgatatct ttttttttcg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400〉 27
cattatgctg agtgatatct ttttttttga 30
<210〉 28
<211> 30
<212〉 腿
<213〉 人工合成
<柳〉28
cattatgctg agtgatatct ttttttttgc 30
<210> 29
<211> 30
<212> 腿
<213> 人工合成
〈400〉 29
cattatgctg agtgatatct ttttttttgg 30
<210〉 30
〈211〉 20
<212〉 腿
<213> 人工合成
<400〉 30
actgacagca gtcgaggags 20
<210> 31
<211> 20
<212〉 DNA
<213> 人工合成
<柳〉31
ttgatcttga ccacagcctc 20
<210〉 32
<211〉 20
<212〉 D亂
<213〉 人工合成
〈400> 32
agatgcagcc tctgaagagt 20
<210〉 33
<211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工合成
〈400〉 33
卿gatcttg gtggtgtagg 20<210> 34
<211> 20
<212〉 腿
<213〉 人工合成
<400> 34
gcctcggaga ttgtgctcaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> 腿
<213〉 人工合成
<400> 35
gccaccacgt tgacagtcag 20
2權利要求
1、一種篩選動物抗病育種的方法，其特征在于該方法包括測定從該動物獲得的核酸樣品中PMCA 1基因中多態性的存在，所述多態性是與腸毒素大腸桿菌粘附素F4受體相關的多態性。
2、 根據權利要求1所述方法，其特征在于所述動物是豬。
3、 根據權利要求2所述方法，其特征在于所述多態性在戶JkTC4 / 基因的mRNA第4210堿基處。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于該方法具體包括如 下步驟(1) 豬基因組DNA的獲得；(2) 以上述豬基因組DNA為模板，擴增尸」l/C4/基因序列；(3) 鑒定尸MC4 7基因的mRNA第4210堿基處的多態性。
5、 根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述步驟(3)中 戶MC4 7基因的mRNA第4210堿基處的多態性是指戶MC4 /基因的 mRNA第4210堿基處有一個堿基突變A4210—T4210。
6、 根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述步驟(2)中用 于擴增PikTC4 /基因序列的引物為SEQIDNO: 9和SEQIDNO: 10。
7、 根據權利要求1所述方法，其特征在于該方法還包括根據 戶MC4 /基因中多態性的測定結果，選出具有與所需特征相關的動物 進行育種。
8、 一種利用權利要求2所述方法篩選豬抗病育種的遺傳標記， 其特征在于它包含克隆得到一個豬i^fC4 7基因的DNA，該基因的mRNA第4210堿基處有一個堿基突變A4210—T4210。
9、 根據權利要求8所述遺傳標記，其特征在于所述豬i^fC4 / 基因的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.l、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.3、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.5、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.7和 SEQ ID N0.8所示。
10、 權利要求8所述遺傳標記在豬標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發明公開一種篩選動物抗病育種的方法和篩選豬抗病育種的遺傳標記，該方法是測定從該動物獲得的核酸樣品中PMCA 1基因中多態性的存在，該多態性是與腸毒素大腸桿菌粘附素F4受體相關的多態性。本發明的篩選豬抗病育種的遺傳標記包含克隆得到一個豬PMCA 1基因的特異DNA，該DNA的第142位堿基處有一個堿基突變A142-T142。本發明篩選出F4 ac受體的相關基因——PMCA 1基因，根據該基因的單核苷酸多態性可對基因組DNA中含有PMCA 1基因的動物進行抗病育種篩選，準確地篩選出對ETEC的受體不具有黏附型的動物品種，從而培育出抗性品種，具有極其重大的應用價值和經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK101654700SQ200910040940
公開日2010年2月24日 申請日期2009年7月7日 優先權日2009年7月7日
發明者雋 何, 劉定發, 周紅麗, 柳小春, 雋 蔣, 賀長青, 馬海明, 黃生強 申請人:湖南農業大學;劉定發;蔣 雋