專利名稱：一種與植物配子發育相關基因的cDNA序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種克隆獲得的與植物配子發育相關BKAPa基因的cDNA序列及其編 碼的蛋白質序列，同時還涉及該基因在植物基因工程雄性不育系育種中的應用，屬于生物 技術領域。
背景技術：
雜種優勢是植物界中普遍存在的一種生物學現象，指的是遺傳組成不同的親本雜 交產生的F1代在生活力、生長勢、適應性、抗逆性和豐產性等方面明顯優于雙親的現象。利 用雜種優勢可以大幅度提高作物產量，是現代農業科學技術的突出成就之一。油菜(Brassica napus L.)作為一種重要的油料作物，是食用植物油和植物蛋白 的主要來源，也是潛在的僅次于豆粕的大宗飼用蛋白源。同時，油菜也是生物柴油的理想原 料。與其它大田作物相比，油菜雜種優勢強，增產效果顯著，在油菜雜種優勢利用的各種途 徑中，雄性不育是其主要途徑之一。植物雄性不育的來源有很多途徑理論上，任何影響雄配子發育的因素都會產生 雄性不育，然而對于特定的作物而言，真正可以大面積應用的雄性不育類型卻非常有限，有 些作物甚至由于不育系來源匱乏而造成產量低、品種遺傳單一，給農業生產帶來潛在的風 險。因此，開辟新的不育源、培育新型不育系已成為雜種優勢利用的重點和主要目標之一。植物花粉發育過程涉及大量的基因表達，很明顯這些花粉特異基因和啟動子可以 在雄性不育的基因工程中應用。Mariani等將Barnase (—種RNase)基因與TA29 (煙草絨氈層特異表達的啟動 子)構成嵌合基因(TA29-Barnase-bar)，并把它導入油菜，從而得到TA29-Barnase轉基 因不育系。1992年，將Barnase (—種RNase)的抑制基因(Barstar基因)引入，而得到 TA29-Barstar-bar 轉基因恢復系。TA29_Bamase_b￡ir 核不育系與 TA29-Barstar-bar 恢復 系配制的雜交種F1，全部恢復雄性可育。這個轉基因雄性不育材料還具有抗除草劑的特性， 苗期噴施除草劑，可殺死核不育系繁殖、制種時母本行約50%的可育株，解決了用人工拔除 可育株的困難和問題。比利時PGS公司育成的這種轉基因核不育雜種，已有5個(1996年 2個，1997年3個)在加拿大注冊推廣，1999年推廣面積已達80萬-100萬hm2。印度已將 這種基因轉入芥菜型油菜中，配制的10個雜交組合，比對照增產9. 9% -34. 52%。但這類 不育系在應用上的最大缺點是不育系和恢復系都是轉基因產品，不僅進行遺傳轉化比較耗 時，而且在實際應用上，因轉基因產品在很多國家還未被廣泛接受，限制了其進一步推廣。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從植物油菜中克隆得到的與植物配子發育相關基因 的cDNA序列。本發明的目的還在于提供一種該序列編碼的多肽氨基酸序列。進一步，本發明的目的提供一種含序列表中序列1或序列2或序列1部分序列所構建的植物表達載體和RNAi載體。更進一步地講，本發明的目的還在于提供一種該基因的應用。為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種與植物配子發育相關基因的cDNA序列，它具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。所編碼的序列表中序列1為來源于油菜的與配子發育相關的BKAPa基因或BKAPa 等同基因的序列。同時，本發明的技術方案還采用了一種cDNA序列，它編碼的蛋白質具有序列表中 序列2所示的多肽氨基酸序列。所編碼的序列表中序列2所示的多肽氨基酸序列的第12-29位含有由18個氨基 酸殘基(RKKIYKTGVDADEARRRR)組成的核定位信號肽(NLS)。所編碼的序列表中序列2所示的氨基酸多肽序列的第104-450位含有1個IBB結 構域,8個ARM重復單元(ARM repeat)和2個HEAT重復單元(HEATr印eat)。本發明的技術方案還采用了一種含序列表中序列1或序列2或序列1部分序列所 構建的植物表達載體和RNAi載體。進一步，本發明的技術方案為一種與植物配子發育相關的BKAPa基因的應用，將 含有所述基因正反向互補序列的RNAi載體轉化油菜，培育出轉基因的不育系；將轉基因不 育系與其它能恢復其育性的正常可育系雜交，產生雜交種子。更進一步，本發明的技術方案為根據所述的基因序列及突變位點設計特異的 PCR引物，產生特異性的分子標記，用此標記鑒定核不育育性分離群體，進行分子標記輔助 選擇，可以獲得全不育群體用于雜種生產。本發明提供的基因BKAPa是從含有BKAPa等位基因的不育和可育系油菜中通過 RT-PCR方法分離獲得的，其具有以下特征1、具有序列表中序列1的核苷酸序列，其中包括起始密碼子ATG和終止密碼子TGA 在內的共計1629個堿基的完整開放讀碼框(0RF)。不育系中克隆到的序列與序列表中序 列1的核苷酸序列有2個位點的突變差異，即在第175個堿基處，缺失了 2次簡單重復序列 (CAG)共計6個堿基；在第693個堿基處，A堿基轉換為T堿基。2、編碼序列表中序列2所示的多肽氨基酸序列，該序列由542個氨基酸組成，具有 1個與KAPb蛋白結合的N-末端結構域(IBB)、8個ARM重復單位(ARM repeat)和2個HEAT 重復單位(HEAT repeat)組成的功能結構域，其生物學功能為植物配子發育所必需的元件。 不育系中的氨基酸序列與序列表中序列2的氨基酸序列有1個位點的突變差異，即在第59 個氨基酸處缺少了 2個谷氨酰胺(QQ)。根據本發明提供的BKAPa基因序列信息(序列1，序列2)，本領域技術人員可以 通過以下方法容易地獲得與BKAPa等同的基因(1)通過數據庫檢索獲得；(2)用BKAPa基 因片段為探針篩選油菜或其它植物的基因組或cDNA文庫獲得；(3)根據BKAPa基因序列信 息設計寡核苷酸引物(含兼并性引物)，用PCR擴增方法從油菜或其它植物的基因組獲取； (4)在BKAPa基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學合成的方法獲得。本發明所述的術語BKAPa等同基因，是定義為與BKAPa基因的核苷酸序列或氨基 酸殘基序列相比有一個或若干個核苷酸或氨基酸的差異，包括堿基或氨基酸殘基的改變、 缺失、插入，或與BKAPa基因序列中的連續210堿基以上的區段有85%以上的相似性，且其表達產物的功能與BKAPa表達產物的功能相同的基因。因此，本發明提供的BKAPa基因還包括BKAPa等同基因，它們為下列核苷酸序列之一，或編碼下列核苷酸多肽序列之一的核苷酸序列(1)將序列1的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代、缺失或添加，且編碼與 序列2同等功能蛋白質的衍生核苷酸序列；(2)與序列1中連續210堿基以上的區段有85%以上的相似性，且其表達產物的 功能與BKAPa表達產物的功能相同的核苷酸序列；(3)將序列2的氨基酸多肽序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加， 且編碼與序列2同等功能蛋白質的衍生氨基酸多肽序列，或其保守性變異多肽，或其活性 片段。本發明所述的BKAPa基因或其等同基因，還包括含有這些基因全部序列或部分序 列的載體。本發明的BKAPa基因屬于KAPa基因家族成員。KAPa基因對動物的配子發育具有 重要的作用，該家族基因部分成員的突變會引起果蠅、線蟲等動物雄配子或雌配子不育，通 過轉基因互補實驗，又可使其育性恢復。本發明提供的BKAPa基因具有重要的應用價值。應用之一是將所述的BKAPa基因 用任何一種方法使其在油菜或其它植物中突變或沉默，可獲得轉基因雄性不育系，用轉基 因雄性不育系與可使其育性恢復的植物雜交，可產生雜交種子用于生產。本發明提供的BKAPa基因的另一個應用是根據所述基因序列信息產生特異性的 分子標記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態)、SSR(簡單序列重復多態)、RFLP (限制性酶 切片段長度多態性)、CAP (切割擴增片段多態性)、SCAR(序列特征性區域擴增多態性)。用 此標記可鑒定油菜或其它植物的雄性不育系或非不育系植株的基因型。本發明采用了一種新的與配子發育密切相關的基因，為植物特別是油菜選育新型 不育系以及雜交育種提供有用的基因和分子標記。本發明的基因在油菜花蕾中高度表達， 并且該基因的cDNA序列和氨基酸序列在甘藍型油菜正常野生型和細胞核雄性不育系之間 存在明顯的突變差異，該基因的突變可能是導致雄性不育的根本原因，因此，該基因在創造 基因工程不育系方面具有極大的應用潛力。利用本發明克隆的基因可進行分子水平的育 種，與常規的雜交和回交育種方法相比，用轉基因方法培育不育系可縮短育種時間，育成的 不育系不育性穩定徹底，無微粉產生。還可以同時導入其它有用基因，如抗病抗蟲基因、優 良品質基因等，培育出優質抗病蟲害的不育系。而且還可以通過轉基因的方法培育相應的 恢復系用于雜種生產。另外，與常規的系譜選擇育種方法相比，分子標記輔助選擇育種可提 高育種選擇效率。
圖1為油菜BKAPa基因cDNA 5，端PCR擴增結果；其中，M為 DL2000(100、250、500、750、1000、2000bp)DNA 分子量標準；1 泳道是以
H2O模板的PCR擴增；2泳道是以等位可育油菜cDNA為模板的PCR擴增；3泳道是以不育油 菜cDNA為模板的PCR擴增。圖2為油菜BKAPa基因cDNA 3，端PCR擴增結果；
其中，M為 DL2000(100、250、500、750、1000、2000bp)DNA 分子量標準；1 泳道是以
H2O模板的PCR擴增；2泳道是以等位可育油菜cDNA為模板的PCR擴增；3泳道是以不育油 菜cDNA為模板的PCR擴增；圖3為BKAPa基因RNA干擾載體RNAi-BKAPa的構建；圖 4 為 BKAPa 基因反義 RNA 載體 Antisense RNA-BKAPa 的構建；圖5為轉基因油菜植株灌漿期表型；CK為未轉基因的正常可與油菜，角果發育正常；RANi和Anti-RNA為轉 RNAi-BKAPa載體和Antisense RNA-BKAPa載體的油菜，轉化單株的結實性很差或幾乎不結實。圖6為轉基因油菜成熟期植株農藝性狀比較；Mg23 (CK)和MDGMS (CK)分別為未經轉化的正常可育油菜和MDGMS不育油菜對照 株，各自發育正常，在自然授粉情況下可以正常結實；MD1、MD3為正常可育油菜Mg23的轉化 植株，在自然授粉情況下基本不結實；Pl、P2、P3為不育油菜MDGMS轉化植株，在自然授粉情 況下不結實，而且植株發育矮小。圖7為轉基因油菜分枝及角果對比；A圖為轉基因植株灌漿期分枝；B圖為轉基因植株成熟期分枝；C圖為轉基因植株 灌漿期角果；D圖為轉基因植株成熟期角果；1為未經轉化的正常可育油菜，結實性正常；2 為正常可育油菜Mg23轉化植株，不能結實；3為未經轉化的不育油菜，結實性基本正常；4 為不育油菜轉化植株，不能結實。圖8為BKAPa基因特異的SCAR標記。1-5是不育單株，無擴增帶；6-10是正常可育單株，可擴增特異的1500bp的單一條 帶；M :DL2000(100、250、500、750、1000、2000bp)DNA 分子量標準。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施方式
對本發明提供的BKAPa基因的克隆過程、基因功能 分析以及用途作具體說明。1、油菜BKAPa基因cDNA的克隆及序列分析本發明以油菜剛抽苔的幼嫩主花序總花蕾為材料，利用Trizol法提取總RNAj^ 檢測RNA合格后，以0lig0(dT)18為引物進行反轉錄反應合成cDNA。以反轉錄的cDNA為模 板，利用引物 Fl (5，> ATGTCGCTGAGGCCGAGCAC)和 R15(5，> CCTGCAGAATCTGTTCTTCCTC)弓丨 物組合在可育和不育系中均擴增到約1. 5Kb的單一片段(見圖1)，利用引物F12(5' > CTG TGG TTG GCG CTGGTATTG)禾口 AR (5 ‘ > TCAGGC AAATTT GAATCC ACC)引物組合在可育和不 育系中均擴增到約500bp的單一片段(見圖2)。將上述片段克隆測序后，二者分別包括了 起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，并且有約200bp的重疊區，可以拼接在一起形成油菜的 BKAPa基因開放讀碼框(ORF)。可育系序列拼接后從起始密碼子到終止密碼子共計1629b， 而不育系為1623bp，堿基總數比等位可育系少6個。拼接后的序列在不育和可育系之間有 2個位點存在突變差異，即在第175個堿基處，缺失了 2次簡單重復序列(CAG)共計6個堿 基；在第693個堿基處，A堿基轉換為T堿基。2、油菜BKAPa蛋白結構分析
將克隆到的油菜BKAPa基因cDNA序列翻譯成相應的氨基酸序列(序列2)。將序列 2與不育系中克隆到的序列的相應氨基酸序列比較發現，雖然二者在cDNA水平上有2個位 點的突變差異，但在氨基酸序列組成上只有1個突變位點差異，即由于cDNA第一個突變位 點簡單重復序列的缺失突變，導致不育系肽鏈在第59個氨基酸處缺失2個谷氨酰胺(QQ)， cDNA第二個突變位點的A-T堿基轉換并未引起氨基酸組成的變化。油菜BKAPa蛋白由542 個氨基酸組成，而突變不育系只有540個氨基酸。 對本發明的序列2氨基酸序列分析表明，油菜BKAPa多肽序列的第12_29個氨基 酸為核定位信號肽(NLS)序列(RKKIYKTGVDADEARRRR)。對本發明的序列2氨基酸序列進行結構域分析，該序列包括1個與KAPb結合 的N-末端結構域(IBB)、8個ARM重復單位(ARM repeat)和2個HEAT重復單位(HEAT repeat)。3、油菜BKAPa基因RNAi及Antisense RNA載體的構建RNAi (RNA干擾)是近年來發展起來的一項能有效抑制轉錄后RNA功能的技術，在 線蟲中被廣泛應用來研究基因的功能，目前也廣泛應用于其他生物的基因功能研究。本發 明通過構建intron-spliced hpRNA載體系統，并轉化油菜來抑制BKAPa基因在油菜中的表 達，從而驗證其在油菜個體發育中的功能。為了提高準確性和效率，同時構建了 2個RNAi 載體和1個Antisense RNA載體。具體構建過程如圖3、圖4所示。4、BKAPa基因RNAi及Antisense RNA載體對油菜的轉化本發明采用真空滲透轉化方法，對油菜轉化構建的2個RNAi載體和1個 Antisense-RNA載體Anti_BKAP。通過抑制BKAPa基因的表達，轉基因植株表現明顯的突變 現象轉化植株能夠進行正常的營養生長，但在自然授粉狀況下不能結實(見圖5、圖6)，突 變株只有個別子房膨大，其內著生1-2個膨大的胚珠，但不能發育完全，多為空癟的珠被殼 (見圖7)，在培養基上不能萌發或萌發后不能繼續發育而早期夭折。表明BKAPa基因是油 菜配子發育所必需的。5、BKAPa基因序列在分子標記付諸選擇育種中的應用根據不育系突變位點所對應的可育正常位點序列設計如下一對引物SCP 1(5，> CTCCAGCAGCAGCAGCAGCCT)禾口SCP2(5，> GCAGGAATGAGAACCGTAGG).用 SCP 1/SCP2 這對引物在等位可育系中擴 增到約1. 5kb的單一特異片段，而在不育系中未擴增到任何帶(見圖8)，因而可以作為穩定 可靠的SCAR標記用于輔助選擇育種。一種與植物配子發育相關基因的cDNA序列及其應用.ST25. txtSEQUENCE LISTING<110>河南大學<120> 一種與植物配子發育相關基因的cDNA序列及其應用<130>BKAPa<140>CN<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>1629<212>DNA<213>甘藍型油菜
<400>1atgtcgctga ggccgagcac acgcgtggag ctgaggaaga agatatacaa gacaggtgtt60gacgccgatg aagctaggcg gaggagagag gacaacctcg tggagatcagcgcgaggaca gtctcctcaa gaaacgccgc gaggggatga tgctccagca gcagcagcag180cctctcggag cagctggtct cgacgccctc cagagcgctg ccgccgttga gaaacgacta240gaaggtatcc caatgatggt acaaggtgtt tattatgatg atccccaagc tcagctagaa300gccactactc aatttagaaa gttattatct atagagcgca gtcctccgat agatgaagtg360atcaaagctg gtgttatccc acgttttgtt gagtttcttg gaaggcaaga ccacccacaa420cttcagtttg aggctgcatg ggctttgacc aacgttgcgt caggaacatc agatcatact480cgggttgtga ttgaacatgg ggcggtgcct atcttcgttg agcttctcag ctctgctagt540gatggcgttc gagagcaggc cgtgtgggct ttggggaatg ttgctggaga ctcgccaaac600tgcaggaacc ttgttctcag ctgtggtgct cttgcaccct tgctgtctca gttaaacgaa660aattcaaagt tatccatgct aaggaacgct acatggacct tgtccaactt ttgtcgtggg720
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一種與植物配子發育相關基因的cDNA序列，它具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所編碼的序列表中序列1為來源于 油菜的與配子發育相關的BKAPa基因的序列。
3.根據權利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所編碼的序列表中序列1為來源于 油菜的與配子發育相關的BKAPa等同基因的序列。
4.一種如權利要求1所述的cDNA序列，它編碼的蛋白質具有序列表中序列2所示的多 肽氨基酸序列。
5.根據權利要求4所述的cDNA序列，其特征在于所編碼的序列表中序列2所示的多 肽氨基酸序列的第12-29位含有由18個氨基酸殘基(RKKIYKTGVDADEARRRR)組成的核定位 信號肽(NLS)。
6.根據權利要求4所述的cDNA序列，其特征在于所編碼的序列表中序列2所示的氨 基酸多肽序列的第104-450位含有1個IBB結構域，8個ARM重復單元(ARM repeat)和2 個 HEAT 重復單元(HEAT repeat)。
7.—種重組載體，它含有權利要求1所述的cDNA序列。
8.—種重組載體，它含有權利要求4所述的cDNA序列。
9.一種與植物配子發育相關的BKAPa基因的應用，其特征在于將含有所述基因正反 向互補序列的RNAi載體轉化油菜，培育出轉基因的不育系；將轉基因不育系與其它能恢復 其育性的正常可育系雜交，產生雜交種子。
10.一種與植物配子發育相關的BKAPa基因的應用，其特征在于根據所述的基因序列 及突變位點設計特異的PCR引物，產生特異性的分子標記，用此標記鑒定核不育育性分離 群體，進行分子標記輔助選擇，可以獲得全不育群體用于雜種生產。
全文摘要
本發明公開了一種來源于甘藍型油菜的與配子發育相關的基因BKAPa的核苷酸序列及其編碼的多肽氨基酸序列及其在轉化油菜及其它植物選育雄性不育系以及根據該基因序列產生的分子標記在育種方面的應用。本發明的基因在油菜花蕾中高度表達，并且該基因的cDNA序列和氨基酸序列在甘藍型油菜正常野生型和細胞核雄性不育系之間存在明顯的突變差異，該基因的突變可能是導致雄性不育的根本原因，因此，該基因在創造基因工程不育系方面具有極大的應用潛力。
文檔編號C12N15/63GK101812461SQ200910064498
公開日2010年8月25日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者安國勇, 宋純鵬, 張驍, 楊翠玲, 王道杰, 苗琛, 郭靄光 申請人:河南大學